Name: rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters at JoVE.com

RSM erkjenner midler fra NSF Graduate Research Fellowship. MBN erkjenner midler fra en Lewis-Sigler Fellowship og utrustet gave Peter Lewis. DB erkjenner midler fra NIH (GM046406) National Institute of General Medical Sciences Center for Kvantitativ biologi (GM071508). Vi erkjenner Christina DeCoste for å få hjelp med flowcytometri eksperimenter.

Figur 2 gir en skjematisk av protokoll seksjoner 1-3. En. Opprettelse av ATFs <ol><li> Lag primere for PCR forsterke DNA bindende domene av interesse. Homologi med ACT1 promotoren og hormon-reseptor (som beskrevet i figurene 3 og 4) ble tilsatt via PCR for å lette korrekt rekombinasjon inn i stammen yMN15. </li><li> PCR forsterke DBD av interesse å bruke en high fidelity polymerase. </li><li> Transform&gt; 1 pg av renset PCR-produkt i gjær ved bruk av litium-acetat-metoden 13. </li><li> Etter transformasjon, spin celler i full fart for 15 sek i mikro og fjerne transformasjon mix. </li><li> Suspender i ~ 200 mL sterilt vann og plate på YPD. </li><li> Den neste dag, replika-plate fra YPD på 5-FOA plater (5-FOA-plater fremstilt som beskrevet i Cold Spring Harbor Manual Gjær) 13. </li><li> Tillate vekst for 2-4 days og restreak minst 5-10 kolonier på YPD. Utfør en koloni PCR ved bruk av primerne i tabell 1, og fremgangsmåten for å kontrollere inkludering. </li></ol> 2. Opprettelse av ATF Plasmid Reporter <ol><li> Bestem bindingsstedet av ATF (mest sannsynlig komme fra litteraturen). </li><li> Bestill ønsket bindende region som oligos (eller Ultramers, hvis nødvendig). Bestill som topp-og bunn tråder med riktig overheng for NotI &amp; Xbal som vist i Tabell 2. </li><li> Fortynn oligoer i ekvimolare konsentrasjoner (100 pM). </li><li> Phosphorylate bruker T4 polynukleotidkinase og deretter anneal i en thermocycler. Reaksjonsbetingelsene er i tabell 3. </li><li> Digest ~ 1-2 ug pMN8 med NotI-HF og Xbal i 1 time ved 37 ° C (reaksjonsbetingelser i tabell 4). </li><li> Gel rense ryggraden bandet. </li><li> Fortynne renset ryggrad til 10 ng / mL. </li><li> Fortynne dobbel-strandet, fosforylrerte bindingssetet til 5x den molare konsentrasjonen av ryggraden per mL. </li><li> Ved hjelp av T4-DNA-ligase for å ligere bindingsstedene i det fordøyde ryggraden ved romtemperatur i 30 min (Tabell 5). </li><li> For transformasjon, legger halve ringsreaksjonen til 50 mL av standard, kjemisk kompetente Escherichia coli som XL1-Blue eller DH5-Alpha. </li><li> Varmesjokkceller for 45 sekunder i et 42 ° C vannbad og deretter sette på is i 2 min. </li><li> Legg 900 mL av SOC medium til transformasjon reaksjon. </li><li> Vokse ved 37 ° C i 1 time på et rulletrommel. </li><li> Spre 100-200 mL celler per LB + AMP (100 mikrogram / ml) plate og inkuberes over natten. </li><li> Vokse opp E. coli i LB + AMP væske og høste plasmid DNA. Sekvens verifisere ny reporter plasmid fra ligation kolonier ved hjelp av primeren 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Transformering ny reporter plasmid inn i ATF-holdige gjær strain fra Seksjon 1 bruker litium acetate transformasjon. </li></ol> Tre. Tallfeste effekten av ATF Induksjon på Gene Expression Bruke GFP Reporter Forbereder prøvene: <ol><li> Lag 25 mM β-østradiol lager (10 ml etanol + 0,0681 g β-østradiol). Holde nedkjølt. </li><li> Grow ATF + Reporter holdig belastning over natten i 5 ml SC-ura. </li><li> Skaffe ni 250 ml riste kolber og tilsett 25 ml SC-URA til hver. </li><li> Legg 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM eller 10 uM β-østradiol. Dette gjøres enklest ved å gjøre 10-ganger seriefortynninger av 25 mM β-østradiol lager. For en endelig konsentrasjon på 10 uM β-østradiol, tilsett 10 pl av 25 mM β-østradiol lager til 25 ml SC-URA. </li><li> Legg 125 mL av natten kulturer til kolber (1:200 fortynning). </li><li> For de to øvrige kolber, vaksinere med en konstituerende GFP produsere Strain og en stamme som mangler GFP. Dette er nødvendig for å kalibrere strømningscytometer. </li><li> Rist ved 200 rpm ved 30 ° C i 12-18 timer. Merk: Den optimale inkubasjonstiden blir bestemt ved å identifisere når GFP induksjons ikke lenger endres etter tilsetning av β-østradiol. </li><li> Ta 500 mL av hver kultur og spinne ned i separate 1,7 ml mikrosentrifugerør. </li><li> Sug SC-ura. </li><li> Vask en gang i en ml PBS 0,1% Tween-20 og aspirer. </li><li> Tilsett 1 ml PBS 0,1% Tween-20 og resuspender. </li><li> Tilsett 1 ml PBS 0,1% Tween-20 til Falcon-rør. </li><li> Til de resuspenderte celler til 5 ml rør (endelig volum = 2 ml) (kan lagres ved 4 ° C i flere dager). </li><li> Valgfritt: sonicate celler Lett å breakup eventuelle klumpet seg celler. Flowcytometri analyse: Oversikt: fluorescens av 10.000-100.000 celler er typisk analysert per prøve. Data kan behandles enten i FlowJo eller bruke egendefinerte skript i Matlab ellerR. Sørg for å kalibrere spenning av GFP kanalen med GFP positive og negative kontroller. Når FCS Filene eksporteres, et manus som den i figur 6 sammen med funksjons fca_readfcs ( <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> kan) brukes til å behandle data. </li><li> Utfør flowcytometri. <ol><li> Bruk forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) for å identifisere gjærceller. </li><li> Sett strømningshastigheten til ~ 3000 celler / sek. </li><li> Mål GFP (FITC kanal). </li><li> Når dataene er samlet inn, eksportere. FCS filer </li></ol></li><li> Load MATLAB. </li><li> Flytt. FCS filer, fcs_readfcs.m, og et skript lik som fra figur 6 til samme mappe. </li><li> Endre den nåværende arbeidskatalog til mappen som inneholder data og skript. </li><li> Kjør skriptet fra figur 6 (merk:legenden har blitt lagt inn manuelt for å produsere det som er vist i figur 7). </li></ol> 4. Tallfeste effekten av ATF Induksjon på cellevekst <ol><li> Fra frossen fisk, strek ut begge deler (1) en ATF-inneholdende stammen, og (2) en ATF-manglende stamme (for eksempel yMN15) på separate YPD-plater. </li><li> Etter 2 dagers vekst, inokulere kultur separate rør inneholdende 5 ml av YPD væske med hver stamme og vokse over natten ved 30 ° C. </li><li> Utfør 10-ganger seriefortynninger av en 0,25 mM β-østradiol stamløsning opp til 10.000 ganger (0,025 uM β-østradiol) i 100% etanol. </li><li> Legg 40 mL av kulturer over natten til 10 ml av YPD væske (1-250 fortynning). </li><li> For hver stamme, tilsett 96 pl av fortynnede celler til 18 brønner i en 96-brønns plate. </li><li> Tilsett 4 mL av β-østradiol til cellene. Et viktig punkt er å sørge for at hver brønn har samme mengde totalt etanol. (Alternativt en mo<html> re konsentrert lager av β-østradiol kan anvendes, og deretter fortynnes til et punkt virkningen av etanol på vekst er ikke målbar). </li><li> Utfør i tre eksemplarer. Tre av brønner for hver stamme bør være etanol-bare kontroller. </li><li> Dekk til 96-brønns plate i gass-permeabel membran. </li><li> Monitor vekst (OD 600) i plateleser. </li><li> Tallvekstratene ved hjelp av en rekke standardmetoder som for eksempel å finne den maksimale helling. Merk: Vi har hatt god suksess med åpen kildekode programvarepakke grofit 14, som går i R programmeringsmiljø Det er verdt å nevne at mens vekstrater beregnet fra 96-brønns plate analyser i forhold til å riste-kolber (25 ml kulturer). er ikke nødvendigvis det samme (både på grunn av forskjeller i fysiologi og i instrumentering), har vi observert at de relative vekstratene er lik (selv om dette kanskje ikke alltid være tilfelle). </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Lag Induserbare Genomisk Alleler <ol><li> Skaff pMN10, en noncentromeric plasmid med ATF-responsive promoter fra pMN8 smeltet til KanMX (i motsatt retning). </li><li> Begrensning fordøye vektor ryggrad og gel ekstrakt som i § 2. </li><li> Anneal, phosphorylate, og Ligate oligos inneholder passende bindingssteder som beskrevet i § 2. </li><li> Sequence bekrefte. Dette plasmid vil nå fungere som et DNA-templat for å lage den induserbare allel. </li><li> Skaff gjærstamme som uttrykker den tilsvarende ATF av interesse. </li><li> PCR forsterke KanMX-arrangøren kassett (~ 2 kb) ved hjelp av primere fra Tabell 6. </li><li> Transformering av PCR-produktet inn i ATF-uttrykkende stamme ved hjelp av lithium-acetat-metoden. </li><li> Plate på YPD og kopi plate på YPD + G418 neste dag. </li><li> Bekreft hensiktsmessig innsetting av promotoren ved hjelp av den fremre primer (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) og en motsatt indre primer til the gen hvis arrangøren har blitt erstattet. Den reverse primeren er typisk utformet til å være mellom 200 til 300 bp nedstrøms fra den første ATG 15.. Den endelige PCR-produktet er ~ 1,2 kb. </li></ol>

<ol>
	<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid,+tunable,+single-gene+specificity+in+yeast.">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic acids res. 41, e57 (2013).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131, 129-134 (1993).</li><li>Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+oestrogen+receptor+ligand-binding+domain+as+an+improved+switch+for+the+regulation+of+heterologous+proteins.">A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins.</a> Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Analysis+of+mRNA+Molecules+Using+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Vis. Exp. (76), e50382 (2013).</li><li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway.">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).</li><li>Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activator/repressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast.">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+aryl+hydrocarbon+receptors+for+bioassay+of+aryl+hydrocarbon+receptor+ligands+in+transgenic+tobacco+plants.">Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).</li><li>Hickman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+regulation+of+sulfur+and+phospholipid+metabolism+reflects+the+importance+of+methylation+in+the+growth+of+yeast.">Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).</li><li>Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+protein+depletion+by+genetically+controlled+deprotection+of+a+dormant+N-degron.">Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 267 (2009).</li><li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells.">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nat. methods. 6, 917-922 (2009).</li><li>Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=grofit:+Fitting+Biological+Growth+Curves+with+R.">grofit: Fitting Biological Growth Curves with R.</a> J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).</li><li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150, 647-658 (2012).</li><li>Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+specific+receptor-ligand+pairs+for+use+in+the+creation+of+gene+switches.">Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).</li><li>McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+orthogonal+ligand+specificity+in+a+single+scaffold.">Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold.</a> Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).</li><li>Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+pathways+that+couple+cell+growth+and+division+in+yeast.">Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast.</a> Science. 297, 395-400 (2002).</li><li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression.">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol. cell. 21, 319-330 (2006).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).</li><li>Polstein, L. R., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors.">Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).</li><li>Losi, A., Gartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+chromophores,+new+photoactivation+paradigms,+trendy+applications:+flavins+in+blue+light-sensing+photoreceptors.">Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors.</a> Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry.">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).</li></ol>

McIsaac, Noyes, og Botstein (med andre) har sendt inn en del av dette systemet som en patent Disclosure.

De hormonbaserte brytere er beskrevet her har utallige applikasjoner, fra å studere innfødte cellebiologi å teste muligheten for en DNA-bindende domene av interesse å målrette en DNA sekvens in vivo. Systemet har mange ønskelige funksjoner, inkludert en gradert respons på inducer, rask action, og stram regulering (dvs.. Ingen målbar leakiness, se figur 7). Men det er fortsatt rom for forbedringer og vekst. Nyere arbeider i syntetisk biologi har lagt vekt multipleksing syntetiske systemer og utvide repertoaret av godt karakterisert, programmerbare DNA deler 16. Uavhengig, betinget uttrykk for tydelige mål gener krever både flere indusere og DNA-bindende domener som mangler overlapp spesifisitet. Tilgjengeligheten av konstruerte og naturlig forekommende reseptorer gir et stort sett av deler som å utvikle nye kunstig transkripsjonsfaktorer. Utviderepertoar av gjensidig ortogonale brytere har blitt sterkt hjulpet av rettet evolusjon nærmer 17,18. Dagens innsats for å omprogrammere ligandbindende spesifisitet av våre kunstige transkripsjonsfaktorer vil bli presentert i fremtiden. Tidligere har de fenotypiske konsekvenser av genet sletting / overekspresjon blitt grundig studert i gjær 19,20. Imidlertid har det ikke vært lett å studere effekten av uttrykk på forskjellige fenotyper over et område av ekspresjonsnivåene. Et primært trekk ved systemet som presenteres her er dens gradert natur (figur 8). Mens ofte lagt til grunn, kan forholdet mellom genekspresjon og fenotyper av interesse ikke nødvendigvis være monoton. Kunstige transkripsjonsfaktorer slik som Z 3 EV og Z 4 EV vil gjøre oppgaven med å analysere de fenotypiske respons til endringer i genekspresjon ukomplisert. Til slutt, protokollene diskutereed i dette manuskriptet er for konstruksjon og karakterisering av kunstige transkripsjonsfaktorer som reagerer på β-østradiol, men et viktig alternativ til kjemisk reagerende domener er bruken av lys-reagerende domener (for eksempel PhyB/Pif3, LOV, og BLUF), hvis virksomhet er reversibel uten å forurolige kulturen vekstmedium 21-23. Light-baserte systemer til rette tid og rom kontroll av genekspresjon, protein-protein interaksjoner, ion transport, og enzymatisk aktivitet, som allerede har vist seg kraftig 21-26. Som konklusjon, har vi presentert fremgangsmåter for rask bygging av induserbare transkripsjonsfaktorer, kunstige i gjær. Denne protokollen gir en mal for deres konstruksjon i forbindelse med beslektede GFP reportere, så vel som fremgangsmåter for analyse av rapportør data ved hjelp av strømningscytometri og analysering av effekten på ATF aktivering på veksten.

Utvikle genetiske brytere i gjær er av stor interesse for både akademisk og industriell forskning. I det ideelle tilfellet, kan genetiske brytere brukes til å aktivere en spesiell genet (eller et sett av gener) bare når dette er ønskelig ved experimenter. En genet kodende sekvens plasseres nedstrøms for en syntetisk promoter uttrykkes ikke i fravær av en induserende molekyl: ved inducer tillegg genet skal bli hurtig uttrykt. Det har nylig blitt vist at en slik bryter kan være konstruert i gjær, hvor det i fravær av induser, viser strekk en sletting fenotype, men i nærvær av induser, er uttrykket aktivert i forhold til nivået av inducer i alle celler 1,2. Historisk sett har betingede uttrykk systemer i gjær støttet seg tungt på nærings-responsive DNA-sekvenser, inkludert den MET, PHO, og GAL arrangører (hvis virksomhet er sensitiv for ekstracellulære nivåer av metionin, fosfat, oggalaktose, henholdsvis). Mens betinget uttrykk kan oppnås, kommer det på bekostning av betydelige mitogen effekt. Hormonreseptorer som de menneskelige østrogenreseptorer har vist seg å være effektive brytere i eukaryoter 3,4. I fravær av hormon, kan et protein kondensert til et hormon reseptor bli sekvestrert i cytoplasma hvor den kommuniserer med Hsp90 anstand kompleks. Ved binding riktig ligand, gjennomgår reseptoren en konformasjonsendringen, forårsaker den til å bli løst fra Hsp90 anstand komplekse og avslører en kjernefysisk lokalisering signal. For å overholde lokaliserings-dynamikken i en bestemt hormon reseptor-inneholdende protein, laget vi en C-terminal fusjon av Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, en syntetisk transkripsjonsfaktor som inneholder Gal4p DNA-bindende domene, det ligandbindende domene av human østrogenreseptor , og VP16) med GFP to. Kjernefysiske lokalisering ble observert i løpet av åtte minutter etter tilsetting avmette mengder av induceren, ß-østradiol, som villtype gjær er fullstendig inert. På denne tiden, de fleste celler har klart synlige aktive transkripsjon nettsteder for GEV målgener (analysert via fluorescens in situ hybridisering) samt fullt modne mRNA 2,5. GEV målgener økt i uttrykket&gt; 2 ganger i løpet av 2,5 min 2,6 (målt ved hjelp av mikromatriser), viser at det tar &lt;2,5 min for det kimære aktivator å translocate til kjernen, binde DNA, og aktivere transkripsjon. Mens flere andre på-brytere har blitt brukt i gjær som utnytter forskjellige små molekyler eller legemidler (inkludert de klassiske doxycycline baserte svitsjer fra Escherichia coli 7,8 og en indigo basert switch 9 fra Arabidopsis thaliana), har ingen oppnådd hastighet, spesifisitet, eller tetthet av regulering utstilt av hormonbaserte svitsjer. Det er verdt å nevne that rask off-brytere har også blitt utviklet i gjær, og vanligvis jobber ved å fusjonere et gen til en protease eller ubiquitin ligase målretting sekvens 2,10,11,12. Evnen til hurtig å fjerne et målprotein fra cellen letter undersøkelsen av essensielle gener, så vel som gener som er utsatt for genetisk undertrykkelse ved sletting 10.. Metodene som beskrives i denne protokollen, er for å bygge og karakterisere syntetiske on-brytere i gjær. Først viser vi hvordan du raskt generere genomically integrerte fusjon proteiner som består av en DNA-bindende domene av interesse, ligandbindende domenet for menneskelig østrogen reseptor, og VP16 (DBD-EV). Etter vår protokoll, blir fusjonsproteinet uttrykkes fra en ACT1 promoter. Deretter viser vi hvordan du oppretter en beslektet reporter plasmid for ATF og teste dens funksjonalitet ved hjelp av flowcytometri. Selv om vi forestille slike rapportør plasmider anvendt med nye ATFs (figur 1), kan de be brukt som journalister for en innfødt transcriptional aktivator i tillegg. Endelig er detaljene for å teste effekten av ATF aktivisering på cellevekst i 96-brønners plater og for prosjektering induserbar genomisk alleler gitt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Expand High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:88px;">Roche</td>
			<td style="width:88px;">11 732 650 001</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0202S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Competent E. coli</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">18258-012</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Estradiol</td>
			<td style="width:88px;">Tocris Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">2824</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0201</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">PBS</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">10010-23</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">Tween-20</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">clonNAT</td>
			<td style="width:88px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:88px;">AB-102L</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">XbaI</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R0145S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">NotI-HF</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R3189S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">B7204S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Glucose</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">D15-500</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Bacto-Peptone</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">211677</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">210929</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Agarose</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">214010</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:88px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:88px;">04-355-222</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">G418</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">11811-031</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:88px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:88px;">27104</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L-6883</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Salmon sperm DNA</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">93283</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">PEG 3350</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-3640</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15</td>
			<td style="width:88px;">Noyes or Botstein labs</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Luria Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Material Name</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">LSRII Flow Cyometer&#160;</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">Various Models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">R</td>
			<td style="width:88px;">Open Source</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">For analyzing growth-rate data from plate reader.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Falcon Tubes</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">352052</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">1.7 ml Eppendorf&#160; Tubes</td>
			<td style="width:88px;">GeneMate</td>
			<td style="width:88px;">C3262-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">250 ml Shake Flasks</td>
			<td style="width:88px;">Corning</td>
			<td style="width:88px;">4446-250</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">96-well, flat-bottom plates</td>
			<td style="width:88px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3635</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)</td>
			<td style="width:88px;">BioTek</td>
			<td style="width:88px;">H1MG</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Breathe-Easy Membranes</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Z380059-1PAK</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:88px;">various companies</td>
			<td style="width:88px;">Various models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">SC-Ura powder</td>
			<td style="width:88px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:88px;">114410622</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">5-FOA</td>
			<td style="width:88px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:88px;">F9001-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters

Syntetisk biologi har som mål å rasjonelt designe og bygge syntetiske kretser med ønskede kvantitative egenskaper, samt tilby verktøy for å avhøre strukturen av innfødte kontroll kretser. I begge tilfeller, kan evnen til å programmere genekspresjon på en hurtig og fleksibel måte, uten av-target-effekter, være nyttig. Vi har konstruert gjærstammer inneholdende ACT1 promoter oppstrøms for en URA3 kassett fulgt av ligand-bindende domene av human østrogenreseptor og VP16. Ved å transformere denne stammen med en lineær PCR-produkt inneholdende et DNA-bindende domene og velge mot tilstedeværelsen av URA3, kan et konstitutivt uttrykt kunstig transkripsjonsfaktor (ATF) bli generert ved hjelp av homolog rekombinasjon. ATFs konstruert på denne måte kan aktivere en unik målgenet i nærvær av induser, og dermed eliminere både off-target aktivering og nonphysiological vekstbetingelser som finnes med vanlig brukt conditional genuttrykk systemer. En enkel metode for hurtig bygging av GFP rapportør plasmider som reagerer spesifikt til et opprinnelig eller kunstig transkripsjonsfaktor av interesse er også tilveiebrakt.

<html> Figur 5 viser induksjon av GFP ved Z 3 EV, Z 4 EV, eller GEV over tid. Legg merke til at økningen i GFP produksjonen i respons på ATFs inneholder nonyeast DNA-bindende domener. Vi har nylig spekulert i at dette er et resultat av disse faktorene som oppnådde enkelt-gen spesifisitet i gjær genomet en. GEV induksjon alene fører til aktivering / undertrykkelse av hundrevis av gener, mens Z 3 EV og Z 4 EV bare aktivere uttrykk for et mål gen plasseres nedstrøms av en syntetisk promoter inneholder riktige bindingssteder (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;og 5&#39;- GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, henholdsvis) en. Figur 7 demonstrerer stramt regulering av systemet (ikke noen induse fører ikke til noen påviselig GFP), og at alle celler blir indusert i respons til induktoren evne Z 3 EV å indusere GFP tvers av en rekke β-østradiol-konsentrasjoner er vist i figur 8.. <html> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Figur 1. Kunstige transkripsjonsfaktorer samhandle med Hsp90 i fravær av β-østradiol. Når β-østradiol binder seg til ATF, dissosierer Hsp90, slik at ATF til å gå inn i kjernen og aktivere ekspresjon fra plasmid reporter. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Figur 2. Skjematisk av protokoll for ingeniør stammer som inneholder kunstige transkripsjonsfaktorer og bygge / teste beslektede GFP reportere. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. The ACT1pr-URA3-EV-sekvensen i belastningen yMN15 ved LEU2-locus. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> Fig. 4. Design of PCR-primere for amplifisering av et DNA-bindende domene av interesse med ytterligere sekvenshomologi til å generere et nytt fusjonsprotein når det med hell omdannet til yMN15. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> Figur 5. GFP induksjon av tre forskjellige ATF-promotor parene i respons til en pM β-østradiol. &lt;/ P&gt; <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Figur 6. Et MATLAB skript for behandling flowcytometri data. Dette skriptet ble tilpasset fra <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Figur 7. Induksjon av GFP ved Z 3 EV som reaksjon på 0 μ M β-østradiol og 1 mM β-østradiol etter 18 timers induksjon. Fluorescens ble også measured celler som mangler GFP å illustrere den stramme regulering av Z-3-EV-system. Dette tallet ble generert ved hjelp av koden i figur 6. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figur 8. Forholdet mellom konsentrasjon-induktoren og ekspresjon utgang er gradert med en Hill koeffisient på ~ 1. (A) Fordeling av GFP-ekspresjon som funksjon av β-østradiol konsentrasjon. (B) Gjennomsnittlig fluorescens av utdelinger fra (A). Dataene var egnet til funksjonen G (D) = G min + (G-G max min) D n / (K n + D n) der D er β-østradiol dose, G min og G max er den laveste og maksimale GFP verdier, resdalene n er Hill-koeffisienten, og K er β-østradiol dose som gir ½ (G + G max min). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsekvens </td><td> Navn </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Sjekk Forward </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD Sjekk Omvendt </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Maling for å bekrefte riktig fusjon av DBD av interesse for Østrogen Reseptor. Termin primer er homolog den ACT1 arrangøren og omvendt primer er homolog til østrogen reseptor. For Typiske DBDs (~ 300 bp), er PCR produkt &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsekvens </td><td> Navn </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBD binging site ... t-3 &#39; </td><td> Top oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA-bindingssted omvendt ... GC-3 &#39; </td><td> Bottom oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top oligo + 6x Zif268 bindingssteder </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> Bottom oligo + 6x Zif268 bindingsseter </td></tr></tbody></table> Tabell 2. S tructure av primere for å skape dsDNA inneholder bindende områder av interesse. For å opprette Z 3 EV-responsive arrangøren, de oligonukleotider Top oligo + 6x Zif268 bindingsseter og Bottom oligo + 6x Zif268 Binding ble brukt.Sekvenser for å skape de riktige DNA overheng er i små bokstaver. Den Zif268 konsensus bindingssete, GCGTGGGCG, er understreket i den øverste oligo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> T4 polynukleotidkinase Buffer </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> T4 polynukleotidkinase (@ 10 000 enheter / ml) </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Topp oligo (100 mm) </td><td> 1,5 mL </td></tr><tr><td> Bunn oligo (100 mm) </td><td> 1,5 mL </td></tr><tr><td> Vann </td><td> 41 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 3.. Fosforylere og anneal primere i en thermocycler ved hjelp av 50 pl av reaksjonen beskrevet ovenfor. Det er to thermocycler trinn. Trinn 1: 37 ° C 30 min (fosforylere), og trinn 2: 95 ° C 30 sek (fratre 1 ° C hvert 30 sek før ved 4 ° C, varmebehandles). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> Xbal </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> NotI-HF </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Plasmid DNA </td><td> 5 mL (1-2 mikrogram) </td></tr><tr><td> 10x Cut Smart Buffer </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Vann </td><td> 38 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Begrensning digest av plasmid pMN8 med Xbal og NotI. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Reagens </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Beløp </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4 Ligase Buffer </td><td> 2 mL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4 ligase </td><td> 0,2 mL </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / mL </td><td> 1 mL </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Bindende Sekvenser @ 5x molar konsentrasjon / mL </td><td> 1 mL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Vann </td><td> 15,8 mL </td></tr></tbody></table> Tabell 5. Ligate bindingssteder i plasmid DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Primer </td><td> Beskrivelse </td></tr><tr><td> ~ 40 bp oppstrøms for ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Forward primer for å forsterke KanMX-arrangøren </td></tr><tr><td> 5&#39;-revers komplement (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Omvendt primer for å forsterke KanMX-arrangøren </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Forward primer for å gjøre GCN4 promoter swap. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Omvendt primer for å gjøre GCN4 promoter swap. </td></tr></tbody></table> Tabell 6. PCR forsterke KanMX-arrangøren for å gjøre titratible allel.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters at JoVE.com

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Denne protokollen beskriver en eksperimentell prosedyre for rask bygging av kunstige transkripsjonsfaktorer (ATFs) med beslektede GFP journalister og kvantifisering av ATFs evne til å stimulere GFP uttrykk via flowcytometri.

Rapid Syntese og Screening av kjemisk Aktivert transkripsjonsfaktorer med GFP baserte Reportere

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Overvåking av Ubiquitin-proteasome aktivitet i levende celler ved hjelp av en Degron (DGN)-destabilisert grønt fluorescerende protein (GFP)-baserte reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Synthesis of Nine-atom Deltahedral Zintl Ions of Germanium and their Functionalization with Organic Groups

Syntese av Nine-atom Deltahedral Zintl Ioner av germanium og deres funksjonalisering med organiske grupper

Although the first studies of Zintl ions date between the late 1890's and early 1930's they were not structurally characterized until many years later.1,2 ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Bruke coculture å oppdage Kjemisk mediert uspesifikt Interaksjoner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolasjon fra Cell spesifikke subpopulasjoner Bruke Laser-fangst mikrodisseksjon Kombinert med Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...