Name: rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters at JoVE.com

RSM erkänner finansiering från NSF Graduate Research Fellowship. MBN erkänner finansiering från en Lewis-Sigler Fellowship och begåvad gåva av Peter Lewis. DB erkänner finansiering från NIH (GM046406) National Institute of General medicinska vetenskaper Centrum för kvantitativ biologi (GM071508). Vi erkänner Christina DeCoste för hjälp med flödescytometri experiment.

Figur 2 ger en schematisk bild av protokoll 1-3 § §. 1. Skapande av atfs <ol><li> Skapa primrar för PCR-amplifiering av DNA-bindningsdomän av intresse. Homologi med ÄRV1 promotorn och hormonreceptor (såsom beskrivits i fig 3 och 4) tillsätts genom PCR för att underlätta korrekt rekombination i stammen yMN15. </li><li> PCR förstärka DBD av intresse med hjälp av en hifi-polymeras. </li><li> Omforma&gt; 1 ng av renad PCR-produkt i jäst med hjälp av litium-acetat metoden 13. </li><li> Efter transformation, spin celler i full fart i 15 sekunder i mikrocentrifug och ta bort omvandlings mix. </li><li> Resuspendera i ~ 200 l av sterilt vatten och platta på YPD. </li><li> Nästa dag, replika plåten från YPD på 5-FOA-plattor (5-FOA-plattor görs enligt beskrivningen i Cold Spring Harbor Jäst Manual) 13. </li><li> Låt tillväxt för 2-4 days, och restreak minst 5-10 kolonier på YPD. Utför en koloni-PCR med användning av de primrar som anges i tabell 1 och sekvensen för att kontrollera införandet. </li></ol> 2. Skapande av ATF plasmid Reporter <ol><li> Bestäm bindningsstället för ATF (mest troligt att komma från litteraturen). </li><li> Beställ önskat bindande region som oligonukleotider (eller Ultramers, om det behövs). Ordern som topp-och bottensträngar med korrekta överhäng för NotI och Xbal såsom visas i tabell 2. </li><li> Späd oligos till ekvimolära koncentrationer (100 M). </li><li> Fosforylera använda T4-polynukleotidkinas och därefter glödgning i en termocykler. Reaktionsbetingelserna är i tabell 3. </li><li> Digest ~ 1-2 pg av pMN8 med NotI-HF och Xbal under 1 timme vid 37 ° C (reaktionsbetingelser som anges i tabell 4). </li><li> Gel rena ryggraden bandet. </li><li> Späd den renade ryggrad till 10 ng / | il. </li><li> Späd den dubbelsträngade, fosforylbindningsställe till 5x den molära koncentrationen av ryggraden per il ated. </li><li> Med användning av T4 DNA-ligas, ligera bindningsställena i den digererade ryggraden vid rumstemperatur under 30 min (tabell 5). </li><li> För transformation, tillsätt hälften av ligeringsreaktionen till 50 pl standard, kemiskt kompetenta Escherichia coli såsom XL1-Blue eller DH5-alfa. </li><li> Värmechock celler för 45 sek i en 42 ° C vattenbad och sedan placera på is i 2 min. </li><li> Lägg till 900 l av SOC medium till transformationsreaktionen. </li><li> Odla vid 37 ° C under 1 h på en rulltrumma. </li><li> Sprid 100-200 | il celler per LB + AMP (100 | ag / ml) platta och inkubera över natten. </li><li> Väx upp E. coli i LB + AMP vätska och skörd plasmid-DNA. Sekvens kontrollera ny reporterplasmid från ligerings-kolonier med användning av primern 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Trans ny reporter plasmid i ATF-innehållande jäst strain från avsnitt 1 med litium-acetat omvandling. </li></ol> 3. Kvantifiera effekten av ATF Induktion på Gene Expression Använda GFP Reporter Förbereda proverna: <ol><li> Gör 25 mM β-östradiol lager (10 ml etanol + 0,0681 g av β-östradiol). Förvara i kylskåp. </li><li> Väx ATF + Reporter-innehållande stam över natten i 5 ml SC-URA. </li><li> Skaffa nio 250 ml skakkolvar och tillsätt 25 ml SC-URA till varje. </li><li> Lägg 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 pM eller 10 pM β-östradiol. Detta görs enklast genom att göra 10-faldig seriespädningar av 25 mM β-estradiol lager. För en slutlig koncentration av 10 mikroM β-estradiol, tillsätt 10 ìl av 25 mM β-estradiol lager till 25 ml av SC-URA. </li><li> Addera 125 pl av övernattskulturer att kolvarna (1:200 utspädning). </li><li> För de två återstående kolvar, ympa med en konstitutiv GFP producerar strain och en stam som saknar GFP. Dessa behövs för kalibrering av flödescytometern. </li><li> Skaka vid 200 rpm vid 30 ° C under 12-18 timmar. Obs: Den optimala inkubationstiden bestäms genom att identifiera när GFP induktion inte längre förändras efter tillägg av β-estradiol. </li><li> Ta 500 l av varje kultur och spinn ner i separata 1,7 ml mikrocentrifugrör. </li><li> Sug SC-URA. </li><li> Tvätta en gång i 1 ml PBS 0,1% Tween-20 och aspirera. </li><li> Tillsätt 1 ml PBS 0,1% Tween-20 och resuspendera. </li><li> Tillsätt 1 ml PBS 0,1% Tween-20 till Falcon-rör. </li><li> Lägg till de resuspenderade cellerna till 5 ml rör (slutlig volym = 2 ml) (kan lagras vid 4 ° C under flera dagar). </li><li> Tillval: Sonikera celler lätt för att uppbrottet eventuella hopklumpade celler. Flödescytometrianalys: Översikt: fluorescens 10.000-100.000 celler normalt analyseras per prov. Data kan bearbetas antingen i FlowJo eller använda egna skript i MATLAB ellerR. Se till att kalibrera spänningen hos GFP-kanal med hjälp av GFP-positiva och negativa kontroller. När FCS filer exporteras, ett manus som den i figur 6 tillsammans med funktions fca_readfcs ( <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> kan) användas för att behandla data. </li><li> Utför flödescytometri. <ol><li> Använd framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) för att identifiera jästceller. </li><li> Ställ in flödet till ~ 3000 celler / sek. </li><li> Mät GFP (FITC-kanal). </li><li> När data samlas in, export. FCS filer </li></ol></li><li> Ladda MATLAB. </li><li> Flytta. FCS-filer, fcs_readfcs.m och ett skript som liknar den från figur 6 till samma mapp. </li><li> Ändra den aktuella arbetskatalogen till den mapp som innehåller de uppgifter och skript. </li><li> Kör skriptet från figur 6 (notera: detlegend har manuellt angett att producera vad som framgår av Figur 7). </li></ol> 4. Kvantifiera effekten av ATF Induktion på celltillväxt <ol><li> Från frysta lager, strimma i både (1) en ATF-innehållande stam och (2) en ATF-saknande stam (såsom yMN15) på separata YPD-plattor. </li><li> Efter 2 dagar av tillväxt, ympa separata odlingsrör innehållande 5 ml YPD vätska med varje stam och växa över natten vid 30 ° C. </li><li> Utför 10-faldiga seriespädningar av en 0,25 mM β-östradiol stamlösning på upp till 10.000-faldigt (0,025 mikroM β-östradiol) i 100% etanol. </li><li> Tillsätt 40 l av övernattskulturer till 10 ml YPD vätska (1-250 utspädning). </li><li> För varje stam, tillsätt 96 | il av utspädda celler till 18 brunnar i en 96-brunnsplatta. </li><li> Lägg 4 pl av β-östradiol till cellerna. En viktig punkt är att se till varje brunn har samma mängd total etanol. (Alternativt en mo<html> re koncentrerad lager av β-östradiol kan användas och därefter spädas till den punkt effekten av etanol på tillväxt är inte mätbar). </li><li> Utför i tre exemplar. Tre av de brunnar för varje stam bör vara etanol-bara kontroller. </li><li> Täck 96-brunnsplatta i gaspermeabelt membran. </li><li> Övervaka tillväxt (OD 600) i plattläsare. </li><li> Kvantifiera de tillväxttal som använder valfritt antal standardmetoder som att hitta den maximala lutningen. OBS: Vi har haft god framgång med öppen källkod programpaket grofit 14, som löper i R programmeringsmiljö Det är värt att nämna att även om tillväxttakten beräknats från 96-brunnar analyser jämfört med skaka-kolvar (25 ml kulturer). inte nödvändigtvis är densamma (på grund av både skillnader i fysiologi och i instrumentering) har vi observerat att de relativa tillväxthastigheter är liknande (även om detta kanske inte alltid är fallet). </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Skapa Inducerbara Genomic alleler <ol><li> Erhåll pMN10, en noncentromeric plasmid med ATF-responspromotor från pMN8 fuserad till KanMX (i motsatt riktning). </li><li> Begränsning smälta vektor ryggrad och gel-extrakt, i avsnitt 2. </li><li> Glödgning, fosforylera, och Ligera oligos innehåller lämpliga bindningsställen som beskrivs i avsnitt 2. </li><li> Sekvens verifiera. Denna plasmid kommer nu att fungera som en DNA-mall för att skapa den inducerbara allelen. </li><li> Skaffa jäststam som uttrycker motsvarande ATF av intresse. </li><li> PCR-amplifiera KanMX-promotorkassetten (~ 2 kb) med användning av primers från tabell 6. </li><li> Förvandla PCR-produkten i ATF-uttryckande stammen med hjälp av litium-acetat metoden. </li><li> Platta på YPD och replik plattan på YPD + G418 följande dag. </li><li> Bekräfta lämplig insättning av promotor med användning av den framåtriktade primern (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) och en omvänd primer inre till the gen vars promotor har bytts ut. Den omvända primern är typiskt utformade för att vara mellan 200 till 300 bp nedströms om det första ATG 15. Den slutliga PCR-produkten är ~ 1,2 kb. </li></ol>

<ol>
	<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid,+tunable,+single-gene+specificity+in+yeast.">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic acids res. 41, e57 (2013).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131, 129-134 (1993).</li><li>Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+oestrogen+receptor+ligand-binding+domain+as+an+improved+switch+for+the+regulation+of+heterologous+proteins.">A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins.</a> Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Analysis+of+mRNA+Molecules+Using+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Vis. Exp. (76), e50382 (2013).</li><li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway.">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).</li><li>Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activator/repressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast.">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+aryl+hydrocarbon+receptors+for+bioassay+of+aryl+hydrocarbon+receptor+ligands+in+transgenic+tobacco+plants.">Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).</li><li>Hickman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+regulation+of+sulfur+and+phospholipid+metabolism+reflects+the+importance+of+methylation+in+the+growth+of+yeast.">Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).</li><li>Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+protein+depletion+by+genetically+controlled+deprotection+of+a+dormant+N-degron.">Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 267 (2009).</li><li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells.">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nat. methods. 6, 917-922 (2009).</li><li>Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=grofit:+Fitting+Biological+Growth+Curves+with+R.">grofit: Fitting Biological Growth Curves with R.</a> J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).</li><li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).</li><li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions.">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150, 647-658 (2012).</li><li>Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+specific+receptor-ligand+pairs+for+use+in+the+creation+of+gene+switches.">Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).</li><li>McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+orthogonal+ligand+specificity+in+a+single+scaffold.">Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold.</a> Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).</li><li>Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+pathways+that+couple+cell+growth+and+division+in+yeast.">Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast.</a> Science. 297, 395-400 (2002).</li><li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression.">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol. cell. 21, 319-330 (2006).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).</li><li>Polstein, L. R., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors.">Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).</li><li>Losi, A., Gartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+chromophores,+new+photoactivation+paradigms,+trendy+applications:+flavins+in+blue+light-sensing+photoreceptors.">Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors.</a> Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry.">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li><li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit.">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).</li></ol>

McIsaac, Noyes, och Botstein (med andra) har lämnat in en del av detta system som ett patentskriften.

De hormonbaserade omkopplare som beskrivs här har otaliga tillämpningar, från att studera nativ cellbiologi för att testa förmågan hos en DNA-bindande domän av intresse att rikta in en DNA-sekvens in vivo. Systemet har många önskvärda funktioner, bland annat en graderad respons på inducerare, snabba åtgärder, och stram reglering (dvs. Ingen mätbar leakiness, se Figur 7). Men det finns fortfarande utrymme för förbättringar och expansion. Senaste arbete i syntetisk biologi har betonat multiplexering syntetiska system och utöka repertoaren av väl karakteriserade, programmerbara DNA delar 16. Oberoende, villkorsuttryck distinkta mål gener kräver både flera inducerare och DNA-bindande domäner som saknar överlappande specificitet. Tillgängligheten av Engineered och naturligt förekommande receptorer, tillhandahåller en stor uppsättning av delar med vilka för att utveckla nya artificiella transkriptionsfaktorer. Utökarepertoar av inbördes ortogonala switchar har stort stöd genom riktad evolution närmar 17,18. Det pågående arbetet för att programmera om ligand-bindande specificiteten hos våra artificiella transkriptionsfaktorer kommer att presenteras i framtiden. Tidigare har de fenotypiska konsekvenser gendeletion / överuttryck har studerats utförligt i jäst 19,20. Det har dock inte varit helt okomplicerad att studera effekten av uttryck på olika fenotyper över en rad olika uttrycksnivåer. En primär funktion i systemet som presenteras häri är dess graderade karaktär (Figur 8). Samtidigt som ofta antas, kan förhållandet mellan genuttryck och fenotyper av intresse inte nödvändigtvis vara monoton. Artificiella transkriptionsfaktorer såsom Z 3 EV och Z 4 EV kommer att göra uppgiften att analysera de fenotypiska svar på förändringar i genuttryck okomplicerad. Slutligen protokollen diskuterared i detta manuskript är till konstruktion och karaktärisering av artificiella transkriptionsfaktorer som svarar på β-östradiol, men ett viktigt alternativ till kemiskt responsiva domäner är användning av ljus-responsiva domäner (såsom PhyB/Pif3, LOV, och Bluf), vars verksamhet är reversibla utan att störa odlingstillväxtmedium 21-23. Ljus-baserade system underlättar spatiotemporal kontroll av genuttryck, protein-proteininteraktioner, jontransport, och enzymatisk aktivitet, som redan har visat kraftfull 21-26. Sammanfattningsvis har vi presenterat metoder för snabb konstruktion av inducerbara, artificiella transkriptionsfaktorerna i jäst. Protokollet ger en mall för deras konstruktion tillsammans med besläktade GFP reportrar, samt metoder för att analysera reportern data med hjälp av flödescytometri och analysera effekten av ATF aktivering på tillväxt.

Utveckling av genetiska switchar i jäst är av stort intresse för både akademisk och industriell forskning. I det ideala fallet kan genetiska switchar användas för att aktivera en särskild gen (eller serie av gener) endast när så önskas av försöksledaren. En gen kodande sekvens placerad nedströms en syntetisk promotor uttrycks inte i frånvaro av ett inducerande molekylen: upon inducerare tillsats genen bör snabbt uttryckas. Det har endast nyligen visats att en sådan omkopplare kan konstrueras i jäst, där i frånvaro av inducerare visar stammen en deletion fenotyp, men i närvaro av inducerare, är expression aktiveras i proportion till nivån av inducerare i alla celler 1,2. Historiskt sett har villkorade expressionssystem i jäst förlitade sig på närings lyhörd DNA-sekvenser, inklusive status, FO, och GAL tagare (vars verksamhet är känsliga för extracellulära nivåer av metionin, fosfat ochgalaktos, respektive). Samtidigt kan uppnås villkorligt uttryck, det kommer på bekostnad av betydande pleiotropa effekter. Hormonreceptorer såsom de humana östrogenreceptorer har visat sig vara effektiva switchar i eukaryoter 3,4. I frånvaro av hormon, kan ett protein smält till en hormonreceptor sekvestreras i cytoplasman, där det interagerar med Hsp90 kaperon komplexet. Vid bindning lämplig ligand, genomgår receptorn en konformationsändring, vilket gör att frigöras från Hsp90 chaperonen komplexa och avslöjar en nukleär lokaliseringssignal. För att observera de lokaliserings dynamiken i ett särskilt hormon-receptor-innehållande protein, skapade vi en C-terminal fusion av Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, en syntetisk transkriptionsfaktor innehållande Gal4p DNA-bindande domän, den ligandbindande domänen av den humana östrogenreceptorn och VP16) med GFP 2. Nukleära lokaliseringsobserverades inom 8 min efter tillsats avmättande mängder av induceraren, beta-östradiol, till vilken vildtyp jäst är helt inerta. Vid denna tid, de flesta celler har klart synliga aktiva transkription platser för GEV mål gener (analyserade via fluorescens in situ hybridisering) samt fullt mogna mRNA 2,5. GEV mål gener ökat uttryck&gt; 2 gånger inom 2,5 min 2,6 (mätt med microarrays), vilket visar att det tar &lt;2,5 min för den chimära aktivator att translokera till kärnan, binder DNA och aktivera transkription. Medan flera andra på-switchar har tillämpats i jäst som utnyttjar olika små molekyler eller droger (inklusive de klassiska doxycyklin-baserade växlar från Escherichia coli 7,8 och en indigo baserad switch 9 från Arabidopsis thaliana), har ingen uppnådda hastigheten, specificitet, eller täthet av reglering som uppvisas av hormonbaserade växlar. Det är värt att nämna thatt snabba off-switchar har också utvecklats i jäst, och oftast fungerar genom att smälta en gen till ett proteas eller ubiquitin ligas inriktning sekvens 2,10,11,12. Förmågan att snabbt avlägsna ett målprotein från cellen underlättar studiet av essentiella gener samt gener som är benägna till genetisk undertryckande när raderas 10. De metoder som beskrivs i detta protokoll är för att bygga och karakterisera syntetiskt på-switchar i jäst. Först visar vi hur du snabbt skapar genomiskt integrerade fusionsproteiner som består av en DNA-bindande domän av intresse, ligandbindningsdomänen av mänsklig östrogenreceptorn, och VP16 (DBD-EV s). Efter våra protokoll, är fusionsproteinet uttrycks från en ÄRV1 promotor. Vi visar sedan hur man skapar ett besläktat reporter plasmid för ATF och testa dess funktionalitet med hjälp av flödescytometri. Även om vi ser framför oss de här reporterplasmider används med nya atfs (Figur 1), kan de be används som reportrar för en infödd transkriptionsaktivator också. Slutligen är information för att testa effekten av ATF aktivering på celltillväxt i 96-brunnar och för att iscensätta inducerbara iska alleler tillhandahålls.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Expand High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:88px;">Roche</td>
			<td style="width:88px;">11 732 650 001</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0202S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Competent E. coli</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">18258-012</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Estradiol</td>
			<td style="width:88px;">Tocris Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">2824</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">M0201</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">PBS</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">10010-23</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">Tween-20</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">9005-64-5</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">clonNAT</td>
			<td style="width:88px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:88px;">AB-102L</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">XbaI</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R0145S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">NotI-HF</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">R3189S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:88px;">NEB</td>
			<td style="width:88px;">B7204S</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Glucose</td>
			<td style="width:88px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:88px;">D15-500</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Bacto-Peptone</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">211677</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">210929</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Agarose</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">214010</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:88px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:88px;">04-355-222</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">G418</td>
			<td style="width:88px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:88px;">11811-031</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:88px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:88px;">27104</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:88px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">L-6883</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:88px;">Salmon sperm DNA</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">93283</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:88px;">PEG 3350</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-3640</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15</td>
			<td style="width:88px;">Noyes or Botstein labs</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Luria Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Material Name</td>
			<td style="width:88px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:88px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">LSRII Flow Cyometer&#160;</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">Various Models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;">MATLAB or FlowJo</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">R</td>
			<td style="width:88px;">Open Source</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">For analyzing growth-rate data from plate reader.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Falcon Tubes</td>
			<td style="width:88px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:88px;">352052</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:88px;">1.7 ml Eppendorf&#160; Tubes</td>
			<td style="width:88px;">GeneMate</td>
			<td style="width:88px;">C3262-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">250 ml Shake Flasks</td>
			<td style="width:88px;">Corning</td>
			<td style="width:88px;">4446-250</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">96-well, flat-bottom plates</td>
			<td style="width:88px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">3635</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:88px;">Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)</td>
			<td style="width:88px;">BioTek</td>
			<td style="width:88px;">H1MG</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Breathe-Easy Membranes</td>
			<td style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Z380059-1PAK</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:88px;">various companies</td>
			<td style="width:88px;">Various models</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">SC-Ura powder</td>
			<td style="width:88px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:88px;">114410622</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:88px;">5-FOA</td>
			<td style="width:88px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:88px;">F9001-1</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid synthesis and screening of chemically activated transcription factors with gfp-based reporters

Syntetisk biologi är att rationellt utforma och bygga syntetiska kretsar med önskade kvantitativa egenskaper, samt ge verktyg för att förhöra strukturen av inhemska styrkretsar. I båda dessa fall kan förmågan att programmera genuttryck på ett snabbt och avstämbar mode, utan ej åsyftade effekter, vara användbara. Vi har konstruerat jäststammar innehållande ACT1 promotor uppströms om en URA3 kassett följt av den ligandbindande domänen i den humana östrogenreceptorn och VP16. Genom att omvandla denna stam med en linjär PCR-produkt som innehåller en DNA-bindande domän och välja mot närvaron av URA3 kan en konstitutivt uttryckt artificiella transkriptionsfaktor (ATF) genereras genom homolog rekombination. Atfs konstruerade på detta sätt kan aktivera en unik målgen i närvaro av inducerare, vilket därigenom eliminerar både off-target aktivering och icke fysiologiska tillväxtförhållanden har hittats med vanligen använda conditional genexpressionssystem. En enkel metod för den snabba uppbyggnaden av GFP reporterplasmider som reagerar specifikt med en nativ eller artificiella transkriptionsfaktor av intresse är också anordnad.

<html> Figur 5 visar induktion av GFP genom Z 3 EV, Z 4 EO, eller GEV över tiden. Notera ökningen av GFP-produktion som svar på de atfs innehållande nonyeast DNA-bindande domäner. Vi spekulerade nyligen att detta resulterar från dessa faktorer som uppnådde singel-gen specificitet i jästgenomet 1. Ensam GEV induktion leder till aktivering / repression av hundratals gener, medan Z 3 EO och Z 4 EV endast aktivera uttrycket av en målgen placeras nedströms om en syntetisk promotor innehållande lämpliga bindningsställen (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;och 5&#39;- GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, respektive) 1. Figur 7 visar den snäva reglering av systemet (inga inducerare leder ingen detekterbar GFP) och att alla celler blir induceras som svar på inducerare förmåga Z 3 EV för att inducera GFP i en rad β-östradiol-koncentrationer visas i Figur 8. <html> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; alltid &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Figur 1. Artificiella transkriptionsfaktorer interagerar med Hsp90 i frånvaro av β-östradiol. När β-östradiol binder till ATF, Hsp90 dissocierar, vilket gör att ATF att gå in i kärnan och aktiverar uttryck från plasmiden reporter. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Figur 2. Schematisk bild av protokoll för ingenjörsstammar som innehåller artificiella transkriptionsfaktorer och bygga / testa besläktade GFP reportrar. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Den ACT1pr-URA3-EV sekvens i stammen yMN15 vid LEU2 locus. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> Figur 4. Konstruktion av PCR-primrar för amplifiering av ett DNA-bindande domänen av intresse med ytterligare sekvenshomologi för att generera ett nytt fusionsprotein när framgångsrikt omvandlats till yMN15. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> Figur 5. GFP induktion genom tre olika ATF-promotor par som svar på 1 ^ M β-estradiol. &lt;/ P&gt; <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Figur 6. Ett MATLAB-skript för bearbetning flödescytometri uppgifter. Detta skript anpassades från <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Figur 7. Induktion av GFP av Z 3 EV som svar på 0 μ M β-estradiol och 1 ^ M β-estradiol efter 18 timmar av induktion. Fluorescens var också meauppmätts från celler som saknar GFP för att illustrera den snäva reglering av Z 3 EV-system. Denna figur alstrades med användning av koden i figur 6. <img alt="Figur 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figur 8. Förhållandet mellan inducerare koncentration och uttryck utgång betygsätts med en Hill koefficient ~ 1. (A) Utdelning av GFP uttryck som en funktion av β-estradiol koncentration. (B) Den genomsnittliga fluorescensen av fördelningarna från (A). Uppgifterna var lämpligt att funktionen G (D) = G min + (G max-G min) D n / (K n + Dn) där D är β-estradiol dos, G min och G max är de minsta och maximala GFP värderingar, respectively, n är Hill-koefficienten, och K är β-östradiol dos som ger ½ (G max + G min). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsekvens </td><td> Namn </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Kontrollera Framåt </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD Kontrollera Reverse </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Primrar för att bekräfta korrekt fusion av DBD av intresse till östrogenreceptorn. Den framåtriktade primern är homolog med ÄRV1-promotorn och den omvända primern är homolog till östrogenreceptorn. För Typiska DBDS (~ 300 bp) är PCR-produkten &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsekvens </td><td> Namn </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBD binging webbplats ... t-3 &#39; </td><td> Topp oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA-bindningsställe omvänd ... gc-3 &#39; </td><td> Botten oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top oligo + 6x Zif268 bindningsställen </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> Botten oligo + 6x Zif268 bindningsställen </td></tr></tbody></table> Tabell 2. S TRUKTUR av primers för att skapa dsDNA med bindande platser av intresse. För att skapa Z 3 EV-lyhörd promotor, oligonukleotider Topp oligo + 6x Zif268 bindningsställen och Botten oligo + 6x Zif268 Bindning användes.Sekvenser för att skapa de rätta DNA överhäng är gemener. Zif268 konsensusbindningsställe, GCGTGGGCG, understryks i den övre oligo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Mängd </td></tr><tr><td> T4-polynukleotidkinas Buffert </td><td> 5 ^ il </td></tr><tr><td> T4-polynukleotidkinas (@ 10000 enheter / ml) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Topp oligo (100 pM) </td><td> 1,5 ^ il </td></tr><tr><td> Botten oligo (100 M) </td><td> 1,5 ^ il </td></tr><tr><td> Vatten </td><td> 41 | il </td></tr></tbody></table> Tabell 3. Fosforylerar och härdnings primers i en termocykler med hjälp av 50 pl reaktion som beskrivs ovan. Det finns två termosteg. Steg 1: 37 ° C 30 min (fosforylera) och steg 2: 95 ° C 30 sek (avgå 1 ° C var 30 sekunder förrän vid 4 ° C, Anneal). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Mängd </td></tr><tr><td> Xbal </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Notl-HF </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Plasmid-DNA </td><td> 5 | il (1-2 | ig) </td></tr><tr><td> 10x Cut Smart Buffert </td><td> 5 ^ il </td></tr><tr><td> Vatten </td><td> 38 | il </td></tr></tbody></table> Tabell 4. Restriktionsdigerering av plasmid pMN8 med Xbal och Notl. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Reagens </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Mängd </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4 ligas Buffer </td><td> 2 | il </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4-ligas </td><td> 0,2 ^ il </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / | il </td><td> 1 pl </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Bindande Sekvenser @ 5x molar koncentration / l </td><td> 1 pl </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Vatten </td><td> 15,8 | il </td></tr></tbody></table> Tabell 5. Ligera bindningsställen i plasmid-DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Primer </td><td> Beskrivning </td></tr><tr><td> ~ 40 bp uppströms om ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Framåt primem för amplifiering KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-omvända komplementet (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Omvänd primeren för amplifiering KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Framåt primer för att göra GCN4 promotor swap. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Omvänd primer för att göra GCN4 promotor swap. </td></tr></tbody></table> Tabell 6. PCR amplifiera KanMX-promotorn för framställning titratible allel.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters at JoVE.com

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Detta protokoll beskriver en experimentell procedur för snabb konstruktion av artificiella transkriptionsfaktorer (atfs) med besläktade GFP reportrar och kvantifiering av atfs förmåga att stimulera GFP uttryck via flödescytometri.

Snabb Syntes och Screening av kemiskt aktiverade transkriptionsfaktorer med GFP-baserade Reportrar

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Generation of Human CD40-activated B cells

Generering av Human CD40-aktiverade B-celler

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Övervakning av ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler Använda en Degron (DGN)-destabiliseras grönt fluorescerande protein (GFP)-baserad Reporter protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Synthesis of Nine-atom Deltahedral Zintl Ions of Germanium and their Functionalization with Organic Groups

Syntes av nio atom Deltahedral Zintl Joner av germanium och deras funktionalisering med organiska grupper

Although the first studies of Zintl ions date between the late 1890's and early 1930's they were not structurally characterized until many years later.1,2 ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Interaktion Analys med parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) för kartläggning kromatin Interaktioner och förstå transkriptionsreglering

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

En kemikaliescreening för Glukokortikoid Signa med en Zebrafish Larva luciferas Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Använda Coculture att upptäcka Kemiskt medierade mellan arter Interaktioner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolering från Cell Specifika Subpopulationer Använda Laser-capture Microdissection Kombinerat med Rapid immunomärkning

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...