Name: methods for quantitative detection of antibody-induced complement activation on red blood cells
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00
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1. Preparazione di bromelina trattati globuli rossi <ol><li> Globuli rossi Lavare 0 tipizzate 3x con 1x PBS (centrifugazione a 664 xg per 2-5 min). </li><li> Incubare 1 volume di eritrociti concentrati con due volumi di una soluzione bromelina 0,5% per 10 min a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule 3x 1x PBS. </li><li> Le cellule possono essere memorizzati come una soluzione al 3% a 4 ° C in PBS 1x per almeno una settimana. </li></ol> 2. C3 e C4 Deposizione Analisi su globuli rossi di FACS <o...

<ol>
	<li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge.">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li><li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia.">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li><li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests.">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li><li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+antiglobulin+test:+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis.">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li><li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective.">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li><li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies.">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li><li>Berentsen, S., Tj&#248;nnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia.">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li><li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia.">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li><li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warm+autoimmune+hemolytic+anemia:+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment.">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li><li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing.">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li><li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia.">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li><li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry,+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination.">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li></ol>

I dosaggi di cui sopra sono riproducibili e robusto. Essi sono di facile esecuzione ed è possibile effettuare loro con molti campioni Allo stesso tempo (in una piastra a 96 pozzetti). Pertanto, questo approccio sarebbe idoneo per un sistema completamente automatico, ad esempio un sistema robot ELISA. Contrariamente alle tecniche attualmente utilizzate, questi test sono quantitative e questo permette, ad esempio nello studio degli effetti di inibitori del complemento. Inoltre, l&#39;interpretazione è ...

Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) può essere indotta da trasfusione di globuli rossi che esprimono un antigene che non è presente in globuli rossi del destinatario. Questi anticorpi ALLO possono causare gravi reazioni trasfusionali emolitiche acute dovute a completare l&#39;attivazione sul seguente trasfusione 5. In auto-immune anemia emolitica (MEA), i pazienti hanno auto-anticorpi contro i propri globuli rossi. Questo porta alla clearance accelerata delle cellule attraverso l&#39;interazione di IgG legati a globuli rossi con Fcy-recettori sulla fagociti nella milza e / o in caso di auto-anticorpi capaci di attivare il complemento attraverso recettori del complemento nel fegato 6,7. Attivazione del complemento fulminante con conseguente emolisi intravascolare è rara, ma spesso fatale. Accelerata, integrare mediata distruzione RBC indotta da entrambi risultati-allo o autoanticorpi in anemia acuta e ipossia tissutale, quindi, potenzialmente fatale. Gli auto-anticorpi in MEA sono classificati in anticorpi caldi e freddi, depending della temperatura ottimale si legano a RBC (rispettivamente 37 ° C o inferiori,). Gli anticorpi caldi sono generalmente di isotipo IgG e gli anticorpi fredde del isotipo IgM 8,9. MEA può essere secondaria ad es lymphoprolyferative disturbi, malattie del tessuto connettivo, tumori solidi, infezioni o droghe, ma nel 50% dei casi è idiopatica MEA 9. Rilevamento di gammaglobuline (ad es. IgG o IgM) e complementare legato a globuli rossi del paziente viene eseguita mediante un diretto all&#39;antiglobulina semiquantitativa (Coombs) Test (DAT). Nella DAT globuli rossi del paziente vengono incubati con anticorpi anti-IgG o anti-C3d. Presenza di RBC agglutinazione dimostra la presenza di componenti del complemento montati o IgG vincolante. Rilevamento di-allo o autoanticorpi nel siero del paziente viene eseguita mediante il test indiretto (IAT). Nel IAT, globuli rossi prova bromelina trattati vengono incubati con siero del paziente, lavate e poi incubate con anti-hUman IgG. Nel caso in cui i globuli rossi sono stati sensibilizzati con anticorpi anti-IgG RBC presenti nel agglutinazione siero del paziente si verificherà. Anticorpi IgM anti globuli rossi saranno direttamente portare a agglutinazione su di incubazione di globuli rossi prova bromelina trattati con siero del paziente. RBC agglutinazione nel test di Coombs diretto o in IAT è valutata visivamente sia dall&#39;occhio in una provetta o caricando il campione su una piccola colonna Sephadex separa RBC agglutinate e singoli per dimensione 1. Un&#39;altra tecnica frequentemente utilizzata per misurare l&#39;attivazione del complemento su globuli rossi è il saggio emolitico 1, in cui viene valutata la capacità del siero del paziente per indurre (complemento-mediata) emolisi dei globuli rossi bromelina trattati 10. Il test è notato come positivo quando il surnatante dopo centrifugazione è macchiato rosso causa emoglobina rilasciata e considerato negativo se rimane incolore. Sia il test antiglobulina e il saggio emolitico sono semiquantitativa, poiché la massima Serum diluizione è indicato in cui il test è ancora positivo. Il test di Coombs e il saggio emolitico sono test affidabili che sono abitualmente utilizzati nella diagnostica. Poiché questi saggi sono semiquantitativa e dipendente dall&#39;esperienza del tecnico esecuzione del saggio non sono adatti per studiare le sottili differenze di attivazione del complemento di globuli rossi, come necessario quando valutare l&#39;efficacia di inibitori del complemento. Pertanto, abbiamo sviluppato due analisi quantitative per determinare l&#39;attivazione del complemento da anticorpi (auto-) per i globuli rossi, che descriveremo in questo articolo. In primo luogo, abbiamo sviluppato un saggio per misurare la deposizione di frammenti attivazione del complemento C3 e C4 su globuli rossi (Figura 1A). In questo saggio, bromelina trattati umane di tipo-0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi), siero fresco AB (fonte complemento) e anti-C5 anticorpo monoclonale (Eculizumab). Durante questa incubation, C3 e C4 deposizione si verifica se il siero del paziente contiene completano l&#39;attivazione di anticorpi anti-RBC. Per evitare di lisi da attivazione del complemento a valle viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti-C5 blocco. Successivamente, C3 e C4 deposizione sul globuli rossi viene rilevato mediante FACS utilizzando anticorpi monoclonali fluorescente o frammenti Fab-reagiscono con C3 e C4, rispettivamente. Gating sul singolo globuli rossi è importante per garantire l&#39;affidabilità dei risultati. I vantaggi di questa tecnica sono che è necessaria una piccola quantità di materiale paziente, l&#39;attivazione del complemento in una fase iniziale della cascata è valutato e il metodo è riproducibile e quantitativa. Un ulteriore vantaggio di guardare sia C3 e C4 è che una distinzione può essere fatta tra l&#39;attivazione classica e lectina pathway (sia C3 e C4 deposizione) e l&#39;attivazione della via alternativa (solo C3 deposizione). L&#39;uso di GR bromelina trattato invece di eritrociti non trattati aumenta la sensibilità del comedire. Il secondo saggio è basato sul dosaggio emolitica attualmente utilizzato (Figura 1B). Umani bromelina trattati tipo 0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi) e siero fresco AB (fonte complemento). Se complemento è attivato da anticorpi anti-RBC paziente, si verificherà dose-dipendente di lisi, porta al rilascio di emoglobina. La quantità di emoglobina rilasciata viene quantificato misurando la sua assorbanza a 414 nm nel supernatante dopo la filatura le eritrociti intatti e frammentati. L&#39;assorbanza è correlata alla quantità di emolisi verificato. In contrasto con il dosaggio attualmente in uso, questo protocollo permette un obiettivo, valore quantitativo di emolisi che è molto riproducibile e non dipende dalla persona interpretazione del saggio. Un&#39;applicazione di questi metodi è stato descritto in 11, in cui l&#39;uso potenziale di C1-inibitore come inibitore del complemento in MEA era studied.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:316px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Barbital</td>
			<td style="width:195px;">Fagron</td>
			<td style="width:119px;">0261</td>
			<td>This chemical is subject to drug regulation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Barbital</td>
			<td style="width:195px;">Fagron</td>
			<td style="width:119px;">0263</td>
			<td>This chemical is subject to drug regulation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.0470.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.0238.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488 amine reactive dye</td>
			<td style="width:195px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">46402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 650 amine reactive dye</td>
			<td style="width:195px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#945;C5 (Eculizumab)</td>
			<td style="width:195px;">Alexion Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS (Canto)</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any FACS can be used that has the appropiate lasers.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Labsystems</td>
			<td style="width:119px;">1500-193</td>
			<td>Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD FACSDiva software v 6.1.2</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">643629</td>
			<td>Any compatible FACS analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bromelain</td>
			<td style="width:195px;">Sanquin</td>
			<td style="width:119px;">K1121</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for quantitative detection of antibody-induced complement activation on red blood cells

Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) possono portare ad attivazione del complemento con un conseguente approvazione accelerata attraverso recettori del complemento nel fegato (emolisi extravascolare) o portano alla lisi intravascolare dei globuli rossi. Alloanticorpi (ad esempio ABO) o gli anticorpi degli antigeni RBC (come si è visto in anemia emolitica autoimmune, MEA) che portano alla attivazione del complemento sono potenzialmente dannose e possono essere - soprattutto quando conduce alla lisi intravascolare - fatale 1. Attualmente, l&#39;attivazione del complemento a causa di (auto-anticorpi) in globuli rossi viene valutata in vitro utilizzando il test di Coombs riflettendo complemento deposizione su RBC o da un saggio emolitico nonquantitative riflettendo RBC lisi 1-4. Tuttavia, per valutare l&#39;efficacia di inibitori del complemento, è obbligatorio avere tecniche quantitative. Qui descriviamo due tali tecniche. In primo luogo, un test di rilevare C3 e C4 deposizione su globuli rossi che è indotto da anticorpi nel siero del paziente è prepresentate. Per questo, analisi FACS è usato con anticorpi anti-C3 o anti-C4 fluorescente. Accanto, un saggio emolitico quantitativo è descritto. Emolisi In questo saggio, complemento-mediata indotta dal siero del paziente viene misurata facendo uso di rilevazione spettrofotometrica della emoglobina rilasciata. Entrambi questi saggi sono molto riproducibile e quantitativa, facilitando studi di attivazione del complemento anticorpo-indotta.

Figura 2A mostra un grafico rappresentante dispersione di globuli rossi. Gating Adatto per singoli globuli rossi può essere visto in de FSC-W - FSC-A plot (P1). Solitamente circa il 95% dei globuli rossi rientrano in questa porta P1 (singole cellule), ma quando viene usata una percentuale di siero del paziente, questo può cadere al 70-80%, specialmente quando anti-RBC IgM è presente nel siero del paziente. Risultati rappresentativi per l&#39;effetto del siero del paziente...

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Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Qui si descrivono due saggi per misurare l&#39;attivazione del complemento indotta da anticorpi contro le cellule rosse del sangue. Il principale vantaggio rispetto ai test attuali è la loro da interpretare facile natura quantitativa e.

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