Name: methods for quantitative detection of antibody-induced complement activation on red blood cells
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells at JoVE.com

SZ och DW får en obegränsad bidrag på ViroPharma.

1. Framställning av bromelain-behandlade röda blodkroppar <ol><li> Tvätta 0-typade röda blodkroppar 3x med 1x PBS (centrifugering vid 664 xg under 2-5 minuter). </li><li> Inkubera en volym av packade röda blodkroppar med två volymer av en 0,5% bromelain lösning under 10 min vid 37 ° C. </li><li> Tvätta cellerna 3x med 1x PBS. </li><li> Cellerna kan lagras som en 3% lösning vid 4 ° C i 1 x PBS under minst en vecka. </li></ol> 2. C3 och C4 Deposition Analys på de röda blodkropparna gen...

<ol>
	<li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge.">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li><li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia.">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li><li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests.">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li><li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+direct+antiglobulin+test:+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis.">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li><li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective.">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li><li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies.">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li><li>Berentsen, S., Tj&#248;nnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia.">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li><li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia.">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li><li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warm+autoimmune+hemolytic+anemia:+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment.">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li><li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing.">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li><li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia.">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li><li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry,+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination.">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li></ol>

Ovanstående analyser är reproducerbar och robust. De är lätt att utföra och det är möjligt att utföra dem med många prover samtidigt (i en 96-brunnars platta). Därför skulle detta synsätt också vara lämpliga för ett helautomatiskt system, t.ex. ett ELISA robotsystem. I motsats till de för närvarande använda tekniker, är dessa analyser är kvantitativ och detta kommer att hjälpa till exempel i studien av effekten av komplement-inhibitorer. Dessutom är tolkningen syfte, vilket är en...

Antikroppar mot röda blodkroppar (RBC) kan induceras genom transfusion av röda blodkroppar som uttrycker ett antigen som inte finns på mottagarens röda blodkropparna. Dessa allo antikroppar kan orsaka allvarliga akuta hemolytiska transfusionsreaktioner på grund av komplementaktivering på följande transfusion 5. I autoimmun hemolytisk anemi (AIHA), patienter har autoantikroppar mot sina egna röda blodkropparna. Detta leder till snabbare avslut av celler via interaktion av IgG bundet till röda blodkroppar med Fcy-receptorer på fagocyter i mjälten och / eller, i händelse av auto-antikroppar som kan aktivera komplement via komplementreceptorer i levern 6,7. Fulminant komplementaktivering som resulterar i intravaskulär hemolys är sällsynt men ofta dödlig. Accelerated, komplement medierad RBC förstörelse inducerad av antingen allo-eller autoantikroppar ger akut blodbrist och därmed potentiellt dödlig hypoxi. De autoantikroppar i AIHA klassificeras i varma och kalla antikroppar, depending på den optimala temperaturen de binder till röda blodkroppar (37 ° C eller lägre, respektive). De varma antikroppar vanligtvis av IgG isotyp och kalla antikroppar av IgM isotyp 8,9. AIHA kan vara sekundära till t.ex. lymphoprolyferative sjukdomar, bindvävssjukdomar, solida tumörer, infektioner eller droger, men i 50% av fallen AIHA är idiopatisk 9. Detektion av gammaglobuliner (t ex. IgG-eller IgM) och komplement bundet till patientens RBC genomföres med hjälp av en semikvantitativ direkt antiglobulin (Coombs)-testet (DAT). I DAT patientens röda blodkropparna inkuberas med anti-IgG-eller anti-C3d. Förekomst av RBC agglutination påvisar förekomst av bifogade komplementkomponenter eller IgG-bindning. Detektion av allo-eller autoantikroppar i patientens serum utföres medelst indirekt antiglobulintest (IAT). I IAT är bromelain-behandlade prov RBC inkuberades med patientserum, tvättades och inkuberades sedan med anti-Human IgG. Vid RBC har sensibiliserats med anti-RBC-IgG närvarande i patientens serum agglutination kommer att ske. IgM-antikroppar mot röda blodkroppar kommer direkt att leda till agglutination vid inkubation av bromelain-behandlade prov RBC med patientserum. RBC agglutination i direkt Coombs test eller i IAT är visuellt bedöms antingen genom ögat i ett provrör eller genom att ladda provet på en liten Sephadex kolonn separera agglutinerade och enstaka röda blodkropparna efter storlek 1. En annan ofta använd teknik för att mäta komplementaktivering på röda blodkroppar är det hemolytiska analysen 1, i vilken kapaciteten hos patientserum för att inducera (komplementmedierad) hemolys av bromelain-behandlade röda blodkroppar 10 bedöms. Testet noteras som positivt när supernatanten efter centrifugering är färgade röda på grund av utsläppt hemoglobin och anses vara negativt om det förblir färglös. Både antiglobulintestet och hemolytiska analysen är semikvantitativ, eftersom den högsta Serum späd betecknas där testet är fortfarande positivt. Den antiglobulintest och hemolytiska analysen är robusta analyser som rutinmässigt används i diagnostik. Eftersom dessa analyser är semikvantitativ och beroende på erfarenheterna av teknikern som utför analysen de inte är lämpliga att studera subtila skillnader i komplementaktivering på RBC, som behövs vid utvärderingen av effekten av komplementhämmare. Därför utvecklade vi två kvantitativa analyser för att avgöra komplementaktivering av (auto-) antikroppar mot röda blodkroppar, vilket vi kommer att beskriva i denna uppsats. Först utvecklade vi en analys för att mäta nedfallet av aktiverings fragment av komplement C3 och C4 på röda blodkropparna (Figur 1A). I denna analys är humana bromelain-behandlade typ-0 RBC inkuberades med värmeinaktiverat patientserum (anti-RBC-antikropp-källa), färska AB-serum (komplementkälla) och anti-C5 monoklonala antikroppen (Eculizumab). Under denna incubation kommer C3 och C4 nedfall uppstå om patienten serum innehåller komplement aktivera anti-RBC-antikroppar. För att förhindra att RBC-lys genom nedströms komplementaktivering en blockerande anti-C5 monoklonala antikroppen tillsätts. Härnäst C3 och C4 avsättning på RBCs detekteras genom FACS med användning av fluorescensmärkta monoklonala antikroppar eller Fab-fragment som reagerar med C3 och C4, respektive. Gating på enstaka röda blodkroppar är viktigt att säkerställa tillförlitligheten i resultaten. Fördelar med denna teknik innefattar att en liten volym av patientmaterial krävs, komplementaktivering i ett tidigt skede av kaskaden bedöms och metoden är reproducerbar och kvantitativ. En ytterligare fördel med att titta på både C3 och C4 är att kan man skilja mellan det klassiska och lektin väg aktivering (både C3 och C4 nedfall) och den alternativa vägen aktiveras (endast C3 nedfall). Användningen av bromelain-behandlade röda blodkroppar i stället för obehandlade RBC ökar känslighet somsäga. Den andra analysen är baserad på den för närvarande använda hemolytiska analysen (Figur 1B). Mänskliga bromelain behandlad typ-0 RBK inkuberas med värmeinaktivpatientserum (anti-RBC antikroppskälla) och färsk AB-serum (komplementkälla). Om komplement aktiveras av patientens anti-RBC-antikroppar, kommer dosberoende RBC lys uppstå, vilket leder till frisättning av hemoglobin. Mängden utsläppt hemoglobin kvantifieras genom att mäta dess absorbans vid 414 nm i supernatanten efter spinning ner de intakta och fragmenterade RBK. Absorbansen korrelerar med mängden uppstått hemolys. I motsats till den för närvarande använda analysen, ger detta protokoll för en objektiv, kvantitativ värde på hemolys som är mycket reproducerbar och inte är beroende av den person som tolkar analysen. En tillämpning av dessa metoder har beskrivits i 11, där den potentiella användningen av C1-inhibitor som komplementhämmare i AIHA var studied.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="845">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:316px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Barbital</td>
			<td style="width:195px;">Fagron</td>
			<td style="width:119px;">0261</td>
			<td>This chemical is subject to drug regulation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Barbital</td>
			<td style="width:195px;">Fagron</td>
			<td style="width:119px;">0263</td>
			<td>This chemical is subject to drug regulation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.0470.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.06404.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1.0238.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488 amine reactive dye</td>
			<td style="width:195px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">46402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 650 amine reactive dye</td>
			<td style="width:195px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">62265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#945;C5 (Eculizumab)</td>
			<td style="width:195px;">Alexion Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS (Canto)</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any FACS can be used that has the appropiate lasers.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Labsystems</td>
			<td style="width:119px;">1500-193</td>
			<td>Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD FACSDiva software v 6.1.2</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">643629</td>
			<td>Any compatible FACS analysis software can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bromelain</td>
			<td style="width:195px;">Sanquin</td>
			<td style="width:119px;">K1121</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for quantitative detection of antibody-induced complement activation on red blood cells

Antikroppar mot röda blodkroppar (RBC) kan leda till komplementaktivering vilket resulterar i en accelererad clearance via komplementreceptorer i levern (extravaskulär hemolys) eller som leder till intravaskulära lys av de röda blodkropparna. Alloantikroppar (t.ex. ABO) eller autoantikroppar mot RBC antigener (som sett i autoimmun hemolytisk anemi, AIHA) leder till komplementaktivering är potentiellt skadliga och kan vara - speciellt när leder till intravaskulära lys - fatal 1. För närvarande, komplementaktivering på grund av (auto)-antikroppar på RBC utvärderas in vitro med hjälp av Coombs test reflekterar komplement nedfall på RBC eller genom en nonquantitative hemolytisk analys avspeglar RBC lys 1-4. Men för att bedöma effekten av komplementhämmare, är det obligatoriskt att ha kvantitativa metoder. Här beskriver vi två sådana tekniker. För det första är pre en analys för att detektera C3 och C4 avsättning på röda blodkroppar som är inducerade av antikroppar i patientserumpresenteras. För detta är FACS-analys används tillsammans med fluorescensmärkta anti-C3-eller anti-C4-antikroppar. Därefter görs en kvantitativ hemolytisk analys beskriven. I denna analys, komplementmedierad hemolys inducerad av patientserum mäts som utnyttjar spektrofotometrisk detektion av den frigjorda hemoglobinet. Båda dessa analyser är mycket reproducerbar och kvantitativ, underlätta studier av antikropp-inducerad komplementaktivering.

Figur 2A visar ett representativt spridningsdiagram för RBK. Lämplig gating för enstaka röda blodkropparna kan ses i de FSC-W - FSC-A plot (P1). Vanligtvis cirka 95% av de röda blodkropparna faller inom denna P1 gate (enstaka celler), men när en stor andel av patientserum används, kan det sjunka till 70-80%, speciellt när anti-RBC IgM är närvarande i patientens serum. Representativa resultat för effekt av AIHA patientserum på C4 avsättning visas i figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells at JoVE.com

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Här beskriver vi två analyser för mätning av komplementaktivering inducerad av antikroppar mot röda blodkroppar. Den stora fördelen över de aktuella analyserna är deras kvantitativa och lätt att tolka naturen.

Metoder för kvantitativ detektion av antikroppsinducerad komplementaktivering på röda blodkroppar

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Utarmning av specifika cellpopulationer med Komplettera Utarmning

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolering av Mouse bukhålan celler

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Upptäckt av Neu1 Sialidase aktivitet i regleringen av Toll-like receptor aktivering

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Protokoll för rekombinant RBD-baserade SARS Vaccines: Protein Förberedelser, Animal Vaccination och neutralisering Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...