Name: initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer
Uploaded: 2014-03-26T17:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer at JoVE.c

Este trabalho foi financiado pelo NCI Grants RO1CA157664 e RO1CA124515, e um prêmio Aliança cancro da mama. Gostaríamos de agradecer Jeffrey Faust, David Ambrose e Scott Weiss da instalação Wistar Citometria de Fluxo core, James Hayden a partir da instalação Wistar Imaging, e todo o pessoal do Biotério do Instituto Wistar, pelo apoio técnico inestimável.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Instituto Wistar. 1. Geração e manutenção de Transgênicos Ratos <ol><li> Breed LSL-K-ras 26 e tm4Tyj Trp53 tm1Brn 27 (obtida a partir de modelos do rato do NCI consórcio cancro humano num fundo misto) para um total de C57BL / 6 do fundo 28 por retrocruzamento, pelo menos 10 gerações com C57BL / 6. Para acompanhar a metástase do tumor, raça B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, obtido a partir O Laboratório Jackson, em um total de C57BL / 6 fundo) com duplo transgênico G12D LSL-K-ras / + camundongos p53 loxP / loxP. Nota: Ratos transgénicos LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP têm sítios loxP flanqueando um alelo transcricionalmente silenciados de oncogénicos K-ras e o locus de p53 endógeno, de modo que após a excisão mediada por Cre, a sobre-expressão de um K-ras oncogénicas mutante e ablação de p53 é achieved. Nota: O rato LSL-EYFP contém um codão de terminação que flanqueiam um gene para a proteína melhorada amarelo fluorescente (YFP) que após a Cre-mediadas resultados excisão na expressão da YFP nos tecidos em que o batente está YFP excisadas. <ol><li> Raça camundongos transgênicos para obter LSL-K-ras G12D / + p53 camundongos loxP / loxP ou LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP camundongos LSL-EYFP para injeções intraductais. Nota: Os ratos são criados como homozigotos para p53 loxP / loxP e heterozigotos para LSL-K-ras G12D / + porque os ratos com uma deleção homozigota do K-ras morrem no útero. Use fêmeas virgens ingênuas, pelo menos, seis semanas de idade para injeções intraductais. Nota: Os iniciadores para a genotipagem de alelos homozigóticos floxed p53 são p53 - T010-FWD (5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 &#39;) e p53-T011-rev (5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;). Eles produzem um alelo tipo selvagem em 391 pb e o p53 floxed alelo 461 pb 29,30. Nota: Os primers para detectar a forma mutante de K-ras são oIMR8273 (5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 &#39;) e oIMR8274 (5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;). Eles produzem a banda mutante detectada em 600 pb. Nota: Para os ratinhos transgénicos triplos YFP repórter, os iniciadores para detectar a cassete ROSA (5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 &#39;), o alelo de tipo selvagem (5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3 &#39;), e um alelo partilhado (5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 &#39;) resulta na amplificação de bandas de 320 pb para o alelo floxed e 600 pb para o alelo de tipo selvagem. </li></ol></li></ol> 2. Preparação Cirúrgica <ol><li> Materiais cirúrgicos limpos com 75% EtOH e autoclave-los antes e depois de todas as injeções. </li><li> Realizar a cirurgia em uma bancada limpa laboratório organizado em um quarto higienizado dentro de uma instalação animal. Limpe todas as superfícies, incluindo o palco e mostradores do microscópio cirúrgico com uma solução desinfetante de amplo espectro seguido por 75% EtOH. </li><li> Pesar e anestesiar os ratos por injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (80-100 mg / kg) e xilazina (8-10 mg / kg) em solução salina estéril. </li><li> Delicadamente, coloque os ratos de volta para suas gaiolas em repouso por 5 min enquanto eles vão sob anestesia. Durante esse tempo, gerar precipitados de vírus (ver protocolo 3). </li><li> Verifique a falta de resposta à dor por toe beliscar. Delicadamente, cobrir os olhos de ratos anestesiados com pomada veterinária para evitar excessiva secagem da córnea. </li><li> Para evitar a hipotermia, coloque camundongos anestesiados em uma almofada de aquecimento definido para fogo baixo durante o procedimento cirúrgico e até que eles começam a se recuperar. </li><li> Para a gestão da dor, administrar meloxicam ratinhos subcutaneamente a 1 mg / kg antes da cirurgia e 24 h depois. </li></ol> 3. Geração de vírus precipitados CUIDADO: vetores adenovírus, embora tenham sido modificados e são incapazes de se replicar, apresentam o risco deinfecção. Manipular o adenovírus com cautela. Todo o pessoal deve ser devidamente treinados de acordo com as diretrizes da instituição para lidar com agentes BSL2 Após a injeção intraductal, alienar adenovírus, de acordo com as diretrizes BSL2. <ol><li> Armazenar adenovírus concentrada estoques de virus à temperatura de -80 ° C congelado em alíquotas de 4 x 10 8 pfu cada, suficiente para a injecção de 16 animais, com 3 ml de 2,5 x 10 7 pfu de partículas de adenovírus. </li><li> Armazenar alíquotas de adenovírus em gelo seco até cerca de 15-20 minutos antes de começar as injeções. Nota: Evitar congelar descongelar repetidamente, como título do vírus cai significativamente entre cada ciclo. Nota: Adenovirus precipitados são formados por modificação de um protocolo previamente descrito 31. </li><li> Reconstituir 504 mg de pó de MEM com 50 ml de água estéril de grau molecular, com suplemento de 244 mg de bicarbonato de sódio e filtrar em condições estéreis e armazenar a 4 ° C. <ol> &lt;li&gt; Preparar a solução de cloreto de cálcio por adição de 1,5 g de cloreto de cálcio a 50 ml de água de grau molecular e filtro em condições estéreis e armazenar a 4 ° C. </li><li> Misturar aliquotas contendo 4 x 10 8 pfu de adenovirus-Cre com suficiente sacarose a 3% em água estéril para um volume final de 10 ml. Adicionar 34 ml de MEM ao vírus e misturar suavemente. Em seguida, adicionar 4 ml de solução de CaCl2, mistura suavemente e incuba-se a temperatura ambiente durante 15-20 min. </li><li> Loja adenovírus em gelo seco até que esteja pronto para formar precipitados. Evitar o descongelamento do adenovírus e armazenando em gelo ou à temperatura ambiente durante períodos prolongados, a menos que se formam precipitados. Nota: É também possível misturar a sacarose, MEM e CaCl2 antes de cirurgias que não é possível para descongelar a alíquota adenovírus e começar a fazer precipita imediatamente após a remoção a partir de -80 ° C. Esta alíquota de sacarose, MEM e cálcio podem ser salvos em gelo seco até que esteja pronto para adicionar o adenovírus. Nota: as partículas de vírus são estáveis ​​durante cerca de 1 hora. </li><li> Antes de cada injecção, agite suavemente o tubo para garantir que as partículas do vírus são misturados. Elaborar 3 ml (2,5 x 10 7 ufc) de partículas de vírus para dentro da seringa de 10 ml e preparar o mouse para a injeção intraductal. </li></ol></li></ol> 4. Injeção Intraductal de partículas virais <ol><li> Delicadamente, coloque o mouse sobre a sua volta para o palco iluminado de um microscópio de dissecação limpa. Iluminar o lado abdominal com uma fonte de luz extra e localizar a esquerda ou para a direita 4 º 9 º da glândula mamária inguinal pelas pequenas manchas brancas da pele (visível em C57BL / 6 fêmeas) ao redor de cada mamilo. </li><li> Esfregue o mamilo delicadamente com um algodão embebido etanol estéril ponta do aplicador para limpar o cabelo longe do mamilo e para esterilizar o local da injeção. Se eles são difíceis de localizar, aplique suavemente uma espessa camada de um creme depilatório ou usar tesouras para expor os mamilos. </li&gt; <li> Retire o bujão de queratina, uma camada de células da pele mortas densas, que está cobrindo o mamilo. Uma vez que o bico está exposta, a camada de queratina deve ser facilmente visível ao microscópio de dissecção. </li><li> Fixe o mamilo com pinça cirúrgica finas e puxar para cima com força leve para retirar a ficha de queratina. </li><li> Estabilizar o mamilo entre a pinça. </li><li> Insira cuidadosamente a agulha entre a pinça, canulação do canal duto a 90 °. Introduzir o mamilo ligeiramente após o bisel da agulha (não mais do que 2 mm) para impedir a penetração através do tecido mamário e nas membranas serosas da cavidade ventral. <ol><li> Não insira a agulha muito profundo. Para garantir uma profundidade de injeção, puxe a agulha para cima depois de inseri-lo no lúmen do ducto, tirando o mamilo ao longo das bordas da agulha, uma vez que é puxado para cima. Nota: A visualização da injeção é difícil, por isso practice para este passo é recomendável utilizar azul de tripano. </li></ol></li><li> Quando a agulha é colocada adequadamente no interior da conduta mamária, libertar os 3 ml de precipitados de vírus (2,5 x 10 7 pfu de adenovirus Cre) mergulhando suavemente a seringa, com o polegar da mão que segura a seringa. O bocal deve ligeiramente inflar enquanto o líquido é adicionado. </li></ol> 5. Recuperação de Ratos <ol><li> Colocar o rato volta para o bloco de aquecimento, depois da injecção, até que começa a recuperar da anestesia. </li><li> Uma vez que o mouse é recuperado, colocá-lo de volta em uma gaiola limpa e monitor para a recuperação total e movimento. </li><li> 24 horas após a injecção intraductal, subcutaneamente administrar meloxicam em 1 mg / kg. </li></ol> 6. Monitoramento Tumor Progressão <ol><li> Palpar a glândula mamária injetado no dia 30 para o alargamento e inchaço. <ol><li> Monitorar a progressão do tumor a cada 5-7 dias, uma vez por Glan mamária inchada e alargadad é observado. </li></ol></li><li> Medir volumes tumorais cada 3-4 dias para cinética de crescimento do tumor, uma vez tumores palpáveis ​​aparecer (injeção de cerca de 50-60 dias após adenovírus). </li><li> Eutanásia ratinhos, quando os volumes de tumor superior a 10% do peso corporal dos ratinhos. </li></ol>

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O sucesso deste processo depende de técnica adequada durante injeções intraductais, que vai ser difícil para os experimentadores não treinados. Investigadores experientes em nosso laboratório normalmente obter massas tumorais de mama de 79% das vezes eles administram injeções de adenovírus. Problemas com a injeção pode resultar em um atraso significativo, variável ou o desenvolvimento do tumor ausente. Se a agulha é inserida muito profundo ou em um ângulo impróprio, o canal ductal pode ser desperdiçada. É importante para entrar no bocal ligeiramente após o bisel da agulha (não mais do que 2 mm), para evitar a penetração através do tecido mamário e nas membranas serosas da cavidade ventral. Além disso, a colocação muito raso da agulha, ou a injecção de mais do que 3 ml de precipitados de vírus pode resultar em derrame de preparação viral fora da glândula mamaria e a indução de tumores não intencionais. Uma maneira de superar esses problemas é inserir a agulha no mamilo ligeiramente deeper a 3 mm, e tirar lentamente a seringa de volta para fora do duto até os 2 mm da ponta do bisel. Isto irá assegurar que o tecido mamário é orientada, em vez de o músculo que envolve a cavidade peritoneal de ratos (Figura 1A). Isso também vai esticar o bocal ao longo das bordas da seringa de modo que, quando o vírus é expelido para dentro da conduta, não há derrame e perda de precipitados virais. A visualização da injecção é difícil e prática para este passo é recomendável. Temos observado um aumento na injeção de sucesso seguindo a prática, resultando em uma penetração maior de desenvolvimento do tumor. Porque esta técnica utiliza não lactantes fêmeas virgens, que é crítico para remover a camada de queratina que cobre o bocal para revelar o canal de conduta subjacente. Recomendamos praticar esta etapa pela injeção de azul tripano ou algum outro corante rastreável estéril dentro do duto e preparar montagens mamárias inteiras para confirmar a segmentação do tr ductalee. Além disso, outros protocolos de injecção que descrevem intraductal de reagentes foram publicados 33,34, o que pode ser útil para desenvolver a técnica adequada. Problemas com a preparação virai ou infecção do lúmen ductal também pode ser investigada por meio de um adenovírus que expressa mCherry. Ratinhos não transgénicas podem ser usadas para cada um destes fins, até a técnica de injecção é optimizado. Embora qualquer glândula mamaria podem ser usados ​​para iniciar tumores, obtivemos as taxas de crescimento mais consistentes por segmentação da glândula mamária ou 4 9, que se acredita é porque é mais fácil de realizar injecções apropriadas sobre estas glândulas, resultando em uma segmentação mais eficiente do duto. A proximidade da esquerda ou direita 4 ª 9 ª glândulas mamárias inguinais para o nodo de drenagem linfática inguinal também é útil para avaliar as respostas imunes anti-tumor em diferentes pontos temporais de progressão tumoral. Para modelar e controlar a metástase latente para locais distantes, tcamundongos ransgenic foram cruzados com camundongos LSL-EYFP. Como o tumor progride, a vasculatura do tumor ligar para o nódulo linfático axilar irá tornar-se ligeiramente inchado em cerca de cinco semanas, antes do tumor começa a crescer exponencialmente (Figura 3A). Eventualmente, depois de 7-8 semanas, a invasão linfovascular irá resultar em crescimento do tumor dentro do nódulo linfático axilar (Figuras 3A e 3B). Usando ratos repórter e tecnologia Cre-loxP, incorporação de YFP cria uma plataforma para rastrear células tumorais metástase para locais distantes em todo progressão do tumor. Isso pode facilitar estudos que visam elucidar os mecanismos celulares e epigenéticos que promovem a metástase latente. Em nossas mãos, as linhas de células de tumor de mama expressa citoqueratina-8, mesothelin, o estrogênio receptor-α, e Her2/neu, confirmando a segmentação do epitélio ductal. No entanto, dependendo das mutações induzidas e devido à dificuldade e à variabilidade de injecções, recomendamosCaracterização histológica de tumores, uma vez que o modelo é bem estabelecido no laboratório. Como o câncer de mama é uma doença tão mortal e penetrante 1,2, é importante o uso de modelos animais que recapitulam com precisão a complexa interação entre o tumor eo hospedeiro. Aqui nós descrevemos um totalmente retrocruzadas C57BL / 6 modelo murino de tumor de mama. Em primeiro lugar, através da indução de tumores a partir de células nativas, que permitem que o tumor a evoluir naturalmente num microambiente imunológico completo. O microambiente imunológico dos tumores mamários de ratinho avançados recapitula as populações de células γδ αβ e T, células supressoras mielóides derivadas e macrófagos comumente observados no cancro da mama humano (Figura 4). Como já publicado anteriormente usando adenovírus-Cre para induzir tumores de ovário, verificou-se que a injeção viral teve efeito negligenciável sobre os infiltrados tumorais correspondentes e progressão do tumor 28. Em segundo lugar, endócrino independenteexpressão de oncogenes garante que as células tumorais têm persistentemente elevados níveis de expressão do gene alvo. Em terceiro lugar, tirando proveito de mutações latentes, podemos controlar o tempo de tumorigénese para facilitar a localização temporal precisa da evolução do tumor. Aplicações deste modelo incluem a pesquisa em biologia de células tumorais, os estudos sobre factores no microambiente tumoral, as respostas imunes anti-tumorais, e ainda a avaliação da eficácia dos novos agentes terapêuticos. Através da disponibilidade do sistema Cre-loxP, esta técnica pode ser usado como uma plataforma para investigar uma gama diversificada de mutações adicionais no início e progressão de tumores da mama. Esperamos que a utilização deste modelo irá melhorar a compreensão da biologia do câncer de mama e, eventualmente, levar a novas terapias destinadas a tratar o cancro da mama metastático.

O câncer de mama é a neoplasia maligna mais comumente ocorrem em mulheres em todo o mundo e 1,2 a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer 2. Complexo genética 3,4, 5 histológica, e fenótipos clínicos 6 são usados ​​para caracterizar os vários subtipos de cancro da mama e muitas vezes são utilizados como um meio para prever a sobrevivência. A análise de um grande grupo de mulheres com cancro da mama indicam que a maioria (cerca de 80%) dos pacientes que morreram tinham recorrência dentro de 10 anos de pós a remoção do tumor primário 7. Para a maioria dos carcinomas da mama invasivos, invasão linfática foi mostrado para ser fortemente correlacionada com um mau resultado e curso clínico mais agressivo da doença 8. Por causa da complexidade genética e fenotípica de cancro da mama, não existe um modelo animal que recapitula todo o curso da doença. Linhagens de células tumorais de mama humanos têm sido freqüentementeusado como xenotransplante ou ortotópico 9 modelos de câncer de mama invasivo e metastático em ratos imunodeficientes. Embora informativo, estes modelos de ocorrer na ausência de pressão imunológica e porque é um enxerto de espécies cruzadas, distorcem os efeitos de toda a micro-ambiente do tumor. Mutações genéticas induzidas impulsionado por promotores específicos mamárias como o vírus murino mamária tumoral (MMTV) e proteína de soro de leite ácido (WAP) têm contribuído uma quantidade enorme de conhecimento sobre a natureza genética do câncer de mama. No entanto, a expressão do tecido específico destes promotores é comprometida pela sua capacidade de resposta para o sistema endócrino 10-16, resultando na expressão variável de mutações genéticas induzidas que não reflectem a expressão de oncogenes, tipicamente sobre-expresso em cancro da mama humano. Para superar o controle endócrino de expressão MMTV conduzido de oncogenes, Moody et al. Geraram um, doxiciclina modelo induzida condicional superexpressão Neu no peitoepitélio 17. Este modelo é útil para deinducing Neu após a formação do tumor para estudar a regressão e recidiva, mas requer uma administração constante de doxiciclina, a expressão do oncogene consistente a longo prazo. Uma discussão abrangente dos muitos modelos de tumores de mama relevantes disponíveis podem ser encontrados na revisão de Vargo-Gogola et al. 10 O nosso objectivo foi desenvolver um modelo de rato de cancro da mama sobre um total rastreabilidade C57BL / 6 do fundo que, após a indução permanente de eventos mutacionais, modelos a formação de um tumor incipiente na presença de pressão imunológica. Nós introduzimos um adenovírus expressando Cre-recombinase nos ductos mamários de camundongos transgênicos contendo alelos floxed no gene TP53, e uma forma oncogênico do K-ras, e YFP. Expressão Cre ablates Tp53, um gene freqüentemente mutado em muitos cânceres de mama 18 e induz a um alelo oncogênico do K-ras, além de expressão YFP especificamenteno epitélio mamário ductal. Embora mutações no K-ras não são freqüentes no câncer de mama, ocorrendo em apenas 6,5% dos pacientes com câncer de mama 19,20, a superexpressão de quinases a montante, tais como Her2/neu e EGFR resultado na ativação constitutiva da via de sinalização Ras em tumores de mama humanos 21-23. A activação da via de sinalização de Ras em muitas linhas de células de tumor da mama, também tem sido relatado 24,25. Vamos descrever o início da formação do tumor ea técnica de injeção intraductal de um adenovírus expressando Cre-recombinase em sexualmente maduros, camundongos fêmeas virgens. Este modelo de câncer de mama se desenvolve lesões evidentes que crescem exponencialmente após cerca de 8 semanas de progressão tumoral lento, com invasão linfática e metástase para o linfonodo axilar por 7-8 semanas. Porque estes ratos são em um total C57BL / 6 fundo e YFP-expressando células tumorais são rastreáveis ​​em linfonodos distais, este modelo oferece uma ferramenta relevante para o estudo da cemecanismos llular e imunológicos de metástase latente e vai ajudar a desenvolver novas abordagens terapêuticas para o tratamento de câncer de mama ductal metastático.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:251px;">Trp53tm1Brn transgenic mice 
			Krastm4Tyj transgenic mice</td>
			<td style="width:145px;">Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:251px;">B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice</td>
			<td style="width:145px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:141px;">006148</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers p53loxp/loxp</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3&#39; 
			5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers LSL-K-ras G12D/+</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3&#39; 
			5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3&#39; 
			5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3&#39; 
			5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Mesothelin expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3&#39; 
			5&#39;-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Progesterone Receptor expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3&#39; 
			5&#39;-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Cytokeratin 8 expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3&#39; 
			5&#39;-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Erbb2 expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3&#39; 
			5&#39;-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Estrogen Receptor A expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3&#39; 
			5&#39;-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Estrogen Receptor B expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3&#39; 
			5&#39;-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			B-Actin expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3&#39; 
			5&#39;-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Adenovirus-CRE</td>
			<td style="width:145px;">Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa</td>
			<td style="width:141px;">Ad5CMVCre</td>
			<td style="width:289px;">Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Adenovirus-mCherry</td>
			<td style="width:145px;">Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa</td>
			<td style="width:141px;">Ad5CMVmCherry</td>
			<td style="width:289px;">Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:145px;">Hamilton company</td>
			<td style="width:141px;">701RN</td>
			<td style="width:289px;">10ml syringe, RN series 
			Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Custom needle</td>
			<td style="width:145px;">Hamilton company</td>
			<td style="width:141px;">7803-05</td>
			<td style="width:289px;">33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:145px;">Dumont</td>
			<td style="width:141px;">52100-58</td>
			<td style="width:289px;">Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">MEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Cellgro</td>
			<td style="width:141px;">50 012 PB</td>
			<td style="width:289px;">Store at 4C in powder and reconstituted form</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:141px;">S233</td>
			<td style="width:289px;">Add to MEM and filter stearilize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">C4901</td>
			<td style="width:289px;">Minimum 96%, anhydrous</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer

O cancro da mama é uma doença heterogénea, envolvendo interacções celulares complexas entre o tumor e o desenvolvimento do sistema imunitário, o que resultou no crescimento de tumores e metástase exponencial de tecidos distais e o colapso de imunidade anti-tumor. Existem diversos modelos animais úteis para o estudo do cancro da mama, mas nenhum recapitular completamente a progressão da doença que ocorre em seres humanos. A fim de obter uma melhor compreensão das interacções celulares que resultam na formação de metástases latente e diminuiu a sobrevivência, nós geramos um modelo de ratinho transgénico indutível da YFP expressando carcinoma ductal que se desenvolve após a maturação sexual em ratos imuno-competentes e é conduzido por, expressão consistente oncogene independente de endócrino. A ativação da YFP, ablação de p53, e expressão de uma forma oncogênico do K-ras foi conseguido através da entrega de um adenovírus expressando Cre-recombinase no duto mamário sexualmente maduros, camundongos fêmeas virgens. Tumorescomeçam a aparecer 6 semanas após o início dos acontecimentos oncogénicos. Após os tumores se tornam aparentes, que progridem lentamente durante cerca de duas semanas antes de começar a crescer exponencialmente. Depois de 7-8 semanas pós-injeção de adenovírus, vasculatura é observado que liga a massa do tumor para os linfonodos distais, com eventual invasão linfática das células tumorais YFP + para os linfonodos axilares distais. Populações de leucócitos que se infiltram são semelhantes aos encontrados em carcinomas da mama humanos, incluindo a presença de células, macrófagos e MDSCs αβ e γδ T. Este modelo único vai facilitar o estudo dos mecanismos celulares e imunológicos envolvidos na metástase latente e dormência, além de ser útil para a concepção de intervenções imunoterápicos novela para tratar o câncer de mama invasivo.

Direccionamento de sucesso da dutal mamária pode ser visualizada através da preparação de peças inteiras da glândula mamaria como anteriormente descrito 32 após a injecção de azul de tripano (para verificar a técnica apropriada de injecção (Figura 1A) ou um adenovírus expressando mCherry (para verificar a preparação virai adequada e infecção de células epiteliais do dueto, Figura 1B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1.jpg" /> Figura 1. Segmentação Intraductal das glândulas mamárias por injeção com o azul ou o adenovírus-mCherry tripan. A) Todo um monte, conforme relatado anteriormente 32, da glândula mamária após a injeção de glândula mamária # 4 com azul de tripan foi preparado de 3 horas após a injeção de visualizar / confirmar direcionamento de todo o ductalárvore. As imagens são de ampliação 4X. B) A infecção do epitélio ductal com adenovírus, injetando 2,5 x 10 7 pfu de adenovírus expressando mCherry. Os camundongos foram injetados intraductalmente e 4 dias após a injeção, toda uma montagem da glândula mamária foi preparado para confirmar a infecção viral da árvore ductal. Imagem ampliação 4X. MG é glândula mamária, LD é o lactífero, ou duto principal, e TD é o ducto terminal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Quando os tumores são induzidos em p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + camundongos transgênicos, os tumores não será aparente até por volta do dia 40, quando as glândulas mamárias se tornará alargada e inchado. É necessário começar palpations quando esta é observada, a monitorização do crescimento do tumor a cada 5-7 dias. Nas nossas mãos, o endurecimento da glândula mamaria sempre precede o início do desenvolvimento tumoral. Tumores progredirá lentamente durante um período adicional de 2 semanas. Começando por volta do dia 56, os tumores começam a crescer exponencialmente (Figura 2B). Neste ponto, é crítico para medir os volumes dos tumores a cada 3 dias, se os estudos cinéticos são desejados porque haverá ligeira rato para rato variabilidade na progressão do tumor, o que é normal (Figuras 2A e 3A). Grandes massas abdominais serão evidentes por dia 80 (Figura 2A, 2B e 3A), após o que os ratos devem ser sacrificados se tumores exceder mais de 10% do seu peso corporal. análise de cDNA de três clones de um rato portador de tumor revelou expressão de mesotelina, citoqueratina-8, Her2/neu, receptor de estrogénio e α (Figura 2C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2.jpg" /> Desenvolvimento&gt; Figura 2. Tumoral p53 em loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + ratinhos injectados com adenovírus intraductalmente-Cre. A) Dois exemplos de tumores 80 dias após a injecção com adenovírus que expressa Cre. Os ratinhos receberam 2,5 x 10 7 PFU de adenovírus que expressa Cre e 80 dias pós-iniciação do tumor, grandes massas palpáveis ​​pode ser visualizado saliente do lado abdominal do animal. B) cinética típica de tumor e programação palpação para tumores induzidos em p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + mice. C) Caracterização de três clones de células de tumor derivadas do mesmo tumor homogeneizada de um loxP p53 / loxP LSL-K-ras G12D / rato +. Extraiu-se RNA e cDNA sintetizados por análise de RT-PCR utilizando iniciadores específicos para β-actina, mesotelina, citoqueratina-8, Her2/neu, receptor de progesterona, receptor de estrogénio α, e receptores de estrogénio β.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. Semelhante ao microambiente celular no cancro da mama humano, observou-se a infiltração de células T e αβ γδ bem como mielóides derivadas de células supressoras e macrófagos para os tumores (Figura 4). Vasculatura drenagem para o linfonodo axilar começará a absorver antes que os tumores têm crescido a abranger todo o tecido mamário, onde a injeção foi realizada (Figura 3A). Invasão linfática e metástase das células tumorais pode ser rastreado pelo cruzamento de camundongos LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP com camundongos LSL-EYFP. Após a excisão mediada por Cre, as células tumorais que expressam YFP (alto e baixo) são detectados no tumor e pode ser rastreada metástase para o nódulo linfático axilar de drenagem (Figura 3B). Metástase para linfonodo axilar distal foi confirmadopor cultura com êxito de uma linha de células de tumor a partir deste local de um portador de tumor LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP do rato (dados não mostrados). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3.jpg" /> Figura 3. Formação de tumores e metástase latente para o linfonodo axilar. A) Exemplo de três tumores de mama avançados, com diferentes taxas de progressão do tumor. Uma massa sólida, indicada pela seta, as formas e, eventualmente, cresce para o tamanho de todo o tecido mamário abdominal. O tumor permanece confinado para o tecido mamário e não se observa para invadir ou anexar ao músculo que cobre a cavidade peritoneal. Não é evidente o ingurgitamento da veia epigástrica superficial entre os nódulos linfáticos inguinais e axilares, indicados por pontas de seta brancas. Depois de 7-8 semanas, the linfonodo axilar começa a tornar-se ampliado devido à invasão linfática das células tumorais, indicado pela seta. B) metástase de células tumorais positivas YFP pode ser visualizado no linfonodo axilar por citometria de fluxo. Camundongos LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP foram usados ​​para induzir tumores e ativação de YFP pela entrega intraductal de adenovírus-Cre. Para verificar a invasão linfática das células tumorais no linfonodo axilar, 80 dias após a injecção adenovírus, os linfonodos e órgãos indicados foram colhidos e corados para marcadores de linfócitos e examinados para expressão YFP. CL representa não tumorais contralateral drenagem de linfonodos. Os resultados representam gating em células tumorais CD45 negativas, indicando que as células tumorais estão invadindo o linfonodo axilar distal. Os números representam cento YFP células positivas da população total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver larg</a>imagem er. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4.jpg" /> Figura 4. Imune infiltra em tumores de mama de camundongos transgênicos. Tumores de mama rato foram homogeneizadas e coradas para CD45, CD3, γδTCR, CD11b e GR1. Os números representam a percentagem de leucócitos positivos no tumor inteira (63,5), o total de células CD3 + (46.7), negativa total de CD3 (40.1), o total de células CD3 + γδ + (γδ células T, 13), CD3 + γδnegative (24), GR1 total elevado CD11b (MDSC, 28,6) e totais CD11b GR1 baixas (macrófagos, 18,5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Devido à anatomia do mouse e técnica de injeções intraductais, encontramos o direcionamentof glândulas mamárias 4 e 9 (Figura 5) produz os resultados mais consistentes e injeções de confiança. No entanto, qualquer glândula pode ser segmentada, dependendo da preferência do técnico realizar a cirurgia. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5.jpg" /> Figura 5. Numeração dos ductos mamários. Ductos mamários 4 e 9 são destacadas em vermelho no diagrama e indicado com setas no mouse. Em nossas mãos, descobrimos que as injeções eram mais fácil de executar nesses ductos mamários, no entanto, todos os outros tecidos mamários que direcionados desenvolveram tumores com cinética semelhante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

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Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Ativação de mutações latentes com adenovírus-Cre no sistema ductal resultados mamárias em um câncer de mama metastático clinicamente relevante. Incorporação de um promotor YFP permite o rastreamento de células tumorais metastáticas distais. Este modelo é útil para estudar metástase latente, a imunidade anti-tumor, e para a concepção de novas imunoterapias para tratar o câncer de mama.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Biologia de sistemas de regulação metabólica pelo receptor de estrogênio sinalização no cancro da mama

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...