Name: initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer
Uploaded: 2014-03-26T17:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer at JoVE.c

Bu çalışma NCI Bağış RO1CA157664 ve RO1CA124515 tarafından desteklenen ve Meme Kanseri Alliance ödül oldu. Biz Wistar Sitometrisi çekirdek tesisi, Wistar Görüntüleme tesisinden James Hayden, ve onların değerli teknik destek için Wistar Enstitüsü Hayvan Tesisi&#39;nin tüm personel Jeffrey Faust, David Ambrose ve Scott Weiss teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvan deneyleri Wistar Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1.. Transgenik Farelerin Üretimi ve Bakım <ol><li> C57BL / 6 fareleri, en az 10 nesil geri çaprazlanması ile tam bir C57BL / 6 arka plan 28 LSL-K-ras ve tm4Tyj 26 (karma bir arka plan üzerinde insan kanser konsorsiyum NCI fare modellerinde de elde edilmiş) 27 Trp53 tm1Brn Breed. Izlemek için tümör metastazı, cins B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) (tam bir C57BL / 6 arka plan üzerine Jackson Laboratuvarı elde LSL-EYFP) Cos / J çift transgenik LSL-K-ras G12D ile / p53 + loxP / loxP farenin. Not: Transgenik LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP farenin, onkojenik K-ras ve endojen p53 lokusunun bir transkripsiyonel susturulması alel yan loxP sitelerine sahip Cre aracılı eksizyon, bir K-ras onkojen aşırı ekspresyonu üzerine, böylece mutant ve p53 ablasyon achi olaneved. Not: LSL-EYFP fare YFP durdurma kaseti, kesilerek çıkarılacak olan dokularda YFP ekspresyonunda Cre aracılı eksizyon sonuçları üzerine geliştirilmiş bir sarı floresan proteini (YFP) bunun için bir gen kuşatan bir durdurma kodonu içerir. <ol><li> LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP fareleri veya LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / intraduktal enjeksiyonlar için loxP LSL-EYFP fareler elde edilmesi için transgenik fareler Breed. Not: K-ras bir homozigot delesyonu ile farenin rahimde kalıp LSL-K-ras G12D / + için Fare p53 loxP / loxP için heterozigot ve homozigot olarak yetiştirilmektedir. Intraduktal enjeksiyonlar için en az altı-haftalık naif bakire kadın kullanın. Not: genotipleme homozigot için primerler olan p53 alel floxed p53 - T010-FWD (5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 &#39;) ve p53-T011-REV (5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;). Onlar 391 bp vahşi bir tip allel üretmek ve p53 461 bp 29,30 de alel floxed. Not: K-ras &#39;ın mutant formu tespit etmek için primerler oIMR8273 (5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3&#39;) ve oIMR8274 (5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3 &#39;)&#39; dir. Onlar 600bp tespit mutant bandı üretmek. Not: YFP raportör üç transjenik fareleri için, primer (&#39;(5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3, yabani tip aleli) (5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3&#39;) ROSA kaseti tespit ve ortak bir alel için 5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 &#39;) floxed alel ve yabani tip aleli için 600 bp 320 bp bantların amplifikasyonu ile sonuçlanır. </li></ol></li></ol> 2. Cerrahi Hazırlık <ol><li> % 75 EtOH ile ve tüm enjeksiyonlar önce ve sonra bunları otoklavlamayın temiz cerrahi malzemeler. </li><li> Bir hayvan tesis içinde bir dezenfekte odada temiz derli toplu laboratuar bankta ameliyat. % 75 EtOH ardından geniş spektrumlu dezenfektan solüsyon ile cerrahi mikroskop aşamasında ve aramalar dahil tüm yüzeyleri silin. </li><li> Tartılır ve steril tuzlu su içinde ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) bir karışımı intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi. </li><li> Onlar anestezi altında devam ederken yavaşça 5 dakika boyunca rahatsız edilmeden kendi kafeslerine geri fareler yerleştirin. Bu süre zarfında virüs çökeltiler oluşturur (Protokolü 3). </li><li> Ayak sıkıştığı Ağrı ile yanıt eksikliği doğrulayın. Yavaşça aşırı kornea kurumasını önlemek için veteriner merhemi ile anestezi farelerin gözlerinizi kapayın. </li><li> Onlar kurtarmak için başlayana kadar, hipotermi önlemek cerrahi işlem sırasında düşük ısı ayarlanmış bir ısıtma pedi üzerine anestezi fareler yerleştirmek ve. </li><li> Ağrının tedavisi için, fareler, ameliyattan 24 saat sonra ve önce 1 mg / kg &#39;da deri altına meloksikam yönetmek. </li></ol> 3. Virüs Kristallerin Üretimi DİKKAT: Adenovirüs vektörleri, onlar değiştirilebilir ve çoğaltmak mümkün değildir olmasına rağmen, bir risk teşkilenfeksiyon. Dikkatli adenovirüs taşıyınız. Bütün personel uygun BSL2 kurallarına uygun olarak adenovirüs atmayın, intraduktal enjeksiyonundan sonra BSL2 maddeleri işlemek için kurumun kurallarına göre eğitilmelidir. <ol><li> Mağaza adenovirüs 3 mi adenovirüs partiküllerinin pfu 7 ila 10 x 2.5 ile 16 hayvanlara enjekte etmek için yeterli bir 4 x 10 8 pfu her biri, alikolar içinde dondurulmuş -80 ° C&#39;de virüs stokları konsantre edildi. </li><li> Enjeksiyonlar başlamadan önce yaklaşık 15-20 dk kadar kuru buz üzerinde adenovirüs alikotları saklayın. Not: tekrarlanan donma çözülme döngüleri kaçının, virüs titresi her döngüsü arasında önemli ölçüde düşer gibi. Not: Adenovirüs çökeltiler, bir protokol değiştirerek oluşturulan, daha önce tarif edilen 31. </li><li> Steril moleküler sınıf 50 ml su, 4 ° C&#39;de steril koşullar ve mağaza içinde sodyum bikarbonat ve filtre 244 mg takviyesi ile MEM tozun 504 mg sulandırın <ol> &lt;li&gt; 4 ° C&#39;de steril koşullar ve mağaza moleküler dereceli su ve filtre 50 ml kadar kalsiyum klorür ve 1.5 g eklenmesi ile kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın </li><li> 10 ml &#39;lik bir son hacim için, steril su içinde yeterli bir% 3 sükroz ile 4 x 10 8 pfu adenovirüs-Cre içeren alikotları karıştırın. Virüse MEM içinde 34 ml ilave edilir ve hafifçe karıştırın. Daha sonra, CaCl2 çözeltisi 4 ml yavaşça karıştırın ve 15-20 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Mağaza çökeltiler oluşturmak için hazır olana kadar kuru buz üzerinde adenovirüs. Çökeltiler meydana sürece, adenovirüsün çözülme ve uzun süreler boyunca buz ya da oda sıcaklığının üzerinde muhafaza kaçının. Not: Bu, hemen -80 ° çıkarıldıktan sonra çökelir bu adenovirüs kısım Çözülme ve yapmaya başlamak mümkün değilse önce ameliyatları için sukroz, MEM ve CaCl 2 karıştırmak da mümkündür Sakaroz, MEM, ve kalsiyum bu kısım adenovirüs eklemek için hazır olana kadar kuru buz üzerinde kaydedilebilir. Not: Virüs partikülleri yaklaşık olarak 1 saat boyunca stabildir. </li><li> , Her bir enjeksiyondan önce hafifçe emin virüs parçacıkları karıştırılır yapmak için tüp hafifçe vurun. 10 ml şırınganın içine virüs parçacıklarının 3 ml (2.5 x 10 7 pfu) yukarı çekmek ve intraduktal enjeksiyon için fare hazırlamak. </li></ol></li></ol> 4. Virüs Parçacıkların Intradüktal Enjeksiyon <ol><li> Yavaşça temiz bir diseksiyon mikroskop ışıklı sahneye sırtında fare yerleştirin. Ekstra bir ışık kaynağı ile karın tarafı aydınlatmak ve her meme çevreleyen (C57BL / 6 kadın üzerinde görünür) kürk küçük beyaz yamalar ile sol 4 inci veya sağ 9 inci inguinal meme bezi bulun. </li><li> Steril bir etanol batırılmış pamuk ile hafifçe ovmak meme uzak meme saç temizlemek için ve enjeksiyon yerinde sterilize etmek uçlu bir aplikatör. Onlar bulmak zor ise, hafifçe meme ortaya çıkarmak için tüy dökücü krem ​​veya kullanım makaslar kalın bir tabaka uygulayın. </li&gt; <li> Meme kapsayan keratin fişi, yoğun ölü deri hücrelerinin bir tabakasını kaldırmak. Meme maruz sonra, keratin fiş diseksiyon mikroskop altında kolayca görünür olmalıdır. </li><li> Ince cerrahi forseps ile meme güvenli ve keratin fişi kaldırmak için ışık güçle yukarı çekin. </li><li> Forseps arasında meme stabilize. </li><li> Yavaşça 90 ° kanal kanal cannulating, forseps arasındaki iğne takın. Meme dokusu yoluyla ve ventral vücut boşluğunun seröz zarlar içine nüfuz etmesini önlemek için hafifçe iğnenin (en fazla 2 mm) arasında konik geçen meme girin. <ol><li> Çok derin iğne takmayın. Enjeksiyon uygun derinlik sağlamak için, yavaşça yukarı çekilir gibi iğne kenarları boyunca meme yukarı çekme, kanal lümenine taktıktan sonra iğne yukarı çekin. Not: enjeksiyon görüntülenmesi zordur, bu nedenle PratikBu aşama için e tripan mavisi kullanarak önerilir. </li></ol></li><li> Iğne uygun meme kanalı içine yerleştirildiğinde, yavaşça şırınga tutan elin başparmağı ile şırınga saplayarak (adenovirüs-Kretasedekine 2.5 x 10 7 pfu) virüs çökeltilerin 3 ml bırakın. Sıvı ilave edilmektedir Emzik hafifçe şişirmek gerekir. </li></ol> 5. Farelerin Recovery <ol><li> Bu anestezi kurtarmak için başlayana kadar enjeksiyondan sonra ısıtma pedi üzerine geri fare yerleştirin. </li><li> Fare kurtarıldıktan sonra, temiz bir kafes içine geri yerleştirin ve tam iyileşme ve hareket için monitör. </li><li> 24 saat intraduktal enjeksiyondan sonra, deri altına 1 mg / kg &#39;da meloksikam yönetmek. </li></ol> 6. İzleme Tümör İlerlemesi <ol><li> Genişleme ve şişlik için günde 30 enjekte meme bezi palpe ediniz. <ol><li> Tümör gelişimini izlemek bir kez şişmiş ve genişlemiş meme Glan her 5-7 günd görülmektedir. </li></ol></li><li> Palpe tümörler (yaklaşık 50-60 gün sonrası adenoviral enjeksiyon) görünür bir tümör büyüme kinetiği için her 3-4 gün tümör hacimlerini ölçmek. </li><li> Tümör hacimleri, farelerin vücut ağırlığının% 10&#39;unu zaman fareler Euthanize. </li></ol>

<ol>
	<li>Youlden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+descriptive+epidemiology+of+female+breast+cancer:+an+international+comparison+of+screening,+incidence,+survival+and+mortality.">The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality.</a> Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).</li><li>Siegel, R., Naishadham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2012.">Cancer statistics, 2012.</a> Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).</li><li>Sorlie, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+patterns+of+breast+carcinomas+distinguish+tumor+subclasses+with+clinical+implications.">Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).</li><li>Gatza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway-based+classification+of+human+breast+cancer.">A pathway-based classification of human breast cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).</li><li>Bastien, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM50+breast+cancer+subtyping+by+RT-qPCR+and+concordance+with+standard+clinical+molecular+markers.">PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers.</a> BMC Med. Genom. 5, 44 (2012).</li><li>Montagna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+triple-negative+breast+cancer:+histologic+subtyping+to+inform+the+outcome.">Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome.</a> Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).</li><li>Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+of+mammary+carcinoma+after+mastectomy.">Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).</li><li>Rakha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prognostic+significance+of+lymphovascular+invasion+in+invasive+breast+carcinoma.">The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma.</a> Cancer. 118, 3670-3680 (2012).</li><li>Kim, I., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis.">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).</li><li>Archer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+receptor+status+defines+the+MMTV+promoter+chromatin+structure+in+vivo.">Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).</li><li>Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hormone+response+element+of+the+mouse+mammary+tumour+virus+DNA+mediates+the+progestin+and+androgen+induction+of+transcription+in+the+proviral+long+terminal+repeat+region.">The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region.</a> EMBO J. 6, 363-368 (1987).</li><li>Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+endogenous+whey+acidic+protein+(Wap)+gene+and+a+Wap-myc+hybrid+gene+in+primary+murine+mammary+organoids.">Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids.</a> Dev. Biol. , 327-337 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+Pten+accelerates+mammary+oncogenesis+in+MMTV-Wnt-1+transgenic+mice.">Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice.</a> BMC Mol. Biol. 2, 2 (2001).</li><li>Martelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymph+node+migration+of+MNP-+and+(111)In-labeled+dendritic+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+breast+cancer+(MMTV-Ras).">In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras).</a> Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).</li><li>Klover, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+STAT1+from+mouse+mammary+epithelium+results+in+an+increased+Neu-induced+tumor+burden.">Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden.</a> Neoplasia. 12, 899-905 (2010).</li><li>Moody, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+activation+of+Neu+in+the+mammary+epithelium+of+transgenic+mice+results+in+reversible+pulmonary+metastasis.">Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis.</a> Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+analysis+of+mutations+and+translocations+across+breast+cancer+subtypes.">Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes.</a> Nature. 486, 405-409 (2012).</li><li>Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+mutation+of+the+ras+family+genes+in+human+breast+cancer.">Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).</li><li>Malaney, S., Daly, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ras+signaling+pathway+in+mammary+tumorigenesis+and+metastasis.">The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).</li><li>Loboda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+of+RAS+pathway+dependence+predicts+response+to+PI3K+and+RAS+pathway+inhibitors+and+expands+the+population+of+RAS+pathway+activated+tumors.">A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors.</a> BMC Med. Genomics. 3, 26 (2010).</li><li>von Lintig, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+activation+in+human+breast+cancer.">Ras activation in human breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).</li><li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy.">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).</li><li>Eckert, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Ras+activation+in+human+breast+cancer+cell+signaling,+invasion,+and+anoikis.">Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis.</a> Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).</li><li>Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+or+RAS+pathway+mutations+in+human+breast+cancer+cell+lines.">Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines.</a> Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).</li><li>Jackson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras.">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).</li><li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer.">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).</li><li>Scarlett, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+progression+is+controlled+by+phenotypic+changes+in+dendritic+cells.">Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells.</a> Exp. Med. 209, 495-506 (2012).</li><li>Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+ligand-regulated+Cre+recombinase+mouse+line+shows+that+LoxP+recombination+is+position+dependent.">A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent.</a> EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).</li><li>Young, N., Crowley, D., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+cancer+mutations+reveals+critical+timing+of+p53+loss+in+sarcomagenesis.">Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis.</a> Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).</li><li>Dinulescu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+K-ras+and+Pten+in+the+development+of+mouse+models+of+endometriosis+and+endometrioid+ovarian+cancer.">Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer.</a> Nat. Med. 11, 63-70 (2005).</li><li>Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+preparing+fluorescent+and+neutral+red-stained+whole+mounts+of+mouse+mammary+glands.">Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).</li><li>Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+injection+of+LPS+as+a+mouse+model+of+mastitis:+signaling+visualized+via+an+NF-kappaB+reporter+transgenic.">Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic.</a> J. Vis. Exp. , e4030 (2012).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors.">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Bu prosedürün başarısı eğitimsiz deneyciler için zor olacak, intraduktal enjeksiyonlar sırasında tekniğine uygun menteşe. Laboratuvarımızda deneyimli araştırmacılar genellikle meme tümörü kitleler onlar adenoviral enjeksiyonları yönetmek kez% 79 edinin. Enjeksiyon ile ilgili sorunlar önemli ölçüde gecikmiş, değişken ya da yoktur tümör gelişimine neden olabilir. İğne çok derin ya da uygunsuz bir açıyla takılırsa, duktal kanal kaçırmış olabilir. Bu, meme dokusu yoluyla ve ventral vücut boşluğunun seröz zarlar içine nüfuz etmesini önlemek için, hafifçe iğnenin (en fazla 2 mm) arasında konik geçen meme girmek önemlidir. Aynı zamanda, virüs çökeltilerin daha büyük 3 ml iğne ya da enjeksiyon çok sığ yerleştirme meme bezi ve istenmeden tümör indüksiyonu dışında viral hazırlık dökülmesine neden olabilir. Bu sorunları aşmak için bir yolu biraz DEEPE meme içine iğne eklemek içinr 3 mm, ve yavaş yavaş eğimin ucundan 2 mm kadar geri kanalın dışına şırınga çekmek daha. Bu, meme dokusu yerine farelerin peritonal boşluğuna (Şekil 1A) çevreleyen kas hedeflenmesini sağlamak olacaktır. Virüs kanal içine atıldığı zaman, viral çökeltilerin ve herhangi bir dökülme kaybı vardır, böylece bu da şırınga kenarları boyunca meme uzatılır. Enjeksiyon görselleştirilmesi zordur ve bu aşama için uygulama önerilir. Biz tümör gelişiminin daha yüksek penetrans sonuçlanan, uygulamada aşağıdaki başarılı enjeksiyonları bir artış gözlemledik. Bu teknik, bakire kadın laktasyonda olmayan kullanır, çünkü altta yatan kanal kanal ortaya çıkarmak için meme kaplayan keratin fişi çıkarmak için çok önemlidir. Biz, kanal içinde tripan mavisi veya diğer bir steril enjekte izlenebilir boya ve duktal tr hedeflenmesi teyit etmek için tüm meme bağlar hazırlanmasıyla bu basamağının gerçekleştirilmesi tavsiyeee. Buna ek olarak, reaktiflerin enjeksiyonu intraduktal tarif diğer protokoller uygun tekniği geliştirmek için yararlı olabilecek, 33,34 yayınlanmıştır. Duktal lümen viral hazırlanması veya enfeksiyonu olan sorunlar da bir MCherry ifade adenovirüs kullanılarak incelenmiştir olabilir. Enjeksiyon tekniği duruma kadar transjenik olmayan farelerdeki bu amaçlar her biri için kullanılabilir. Herhangi bir meme bezi tümörleri başlatmak için kullanılabilir olsa da, biz bunu daha verimli hedefleme sonuçlanan bu bezlerin üzerinde uygun enjeksiyonları yapmak daha kolaydır çünkü inanıyorum meme bezi 4 veya 9, hedefleyerek en tutarlı büyüme oranları elde ettik kanal. Sol 4 th yakınlık veya drenaj kasık lenf düğümü doğru 9. inguinal meme bezleri, tümör ilerlemesi, farklı zamansal noktaları sırasında anti-tümör immün yanıtları incelemek için de yararlıdır. Distal siteleri modellemek ve gizli metastaz izlemek için transgenic fareler LSL-EYFP fareler ile geçti. Tümör ilerledikçe tümör katlanarak (Şekil 3A) büyümeye başlamadan önce, koltuk altı lenf düğümüne bağlanması tümör damar sistemi, en az yaklaşık 5 hafta tıkanmış hale gelir. Sonunda, 7-8 hafta sonra Lenfovasküler koltuk altı lenf düğümü (Şekiller 3A ve 3B) içinde tümör büyümesinin neden olur. Muhabiri fareler ve Kre-loxP teknolojisini kullanarak, YFP birleştirilmesi tümör ilerlemesi boyunca uzak bölgelere metastaz tümör hücreleri izlemek için bir platform oluşturur. Bu gizli metastaz teşvik hücresel ve epigenetik mekanizmaların tanıtılması amaçlanmıştır çalışmaları kolaylaştırabilir. Elimizde olanlar, göğüs tümörü hücre çizgileri duktal epitelyum hedeflenmesi teyit sitokeratin-8, mezotelin, östrojen reseptörü-α, ve HER2/neu ifade edilmiştir. Bununla birlikte, meydana mutasyonlara bağlı ve bağlı zorluk ve enjeksiyon değişkenliği olarak, öneririzModelin bir kez tümörler histolojik karakterizasyonu de laboratuarda kurulur. Meme kanseri gibi ölümcül ve yaygın bir hastalıktır 1,2 olduğundan, doğru tümör ve ev sahibi arasındaki karmaşık etkileşimi recapitulate hayvan modelleri kullanmak önemlidir. Burada meme tümörü tamamen çaprazlanmış, C57BL / 6 fare modeli açıklar. İlk olarak, ana hücrelerden tümör uyararak biz tümör tam bağışıklık mikro doğal olarak gelişmeye izin verir. Gelişmiş fare göğüs tümörlerinde bağışıklık mikro-ortam genel olarak (Şekil 4), insan meme kanseri gözlenen αβ popülasyonları ve γδ T hücreleri, miyeloid türevi bastırıcı hücreler ve makrofajlar tartışıldı. Biz yumurtalık tümörleri ikna etmek için adenovirüs-Cre kullanarak önce yayınlanmış gibi, biz viral enjeksiyon gelen tümör infiltratların ve tümör ilerlemesi 28 üzerinde önemsiz bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur. İkinci olarak, bağımsız bir endokrinonkojenlerin ifadesi tümör hücreleri hedef gen ifadesinin sürekli yüksek düzeyde olmasını sağlar. Üçüncü olarak, gizli mutasyonlar yararlanarak, biz tümör evrim kesin zamansal izlemeyi kolaylaştırmak için Tümörgenez zamanlamasını kontrol edebilirsiniz. Bu modelin uygulamalar tümör hücresi biyolojisi hakkında araştırma, tümör mikro-, anti tümör immün yanıtları ve yeni terapötiklerin daha etkinliği değerlendirilmesinde faktörlere çalışmaları. Cre-loxP sisteminin durumu sayesinde, bu teknik, göğüs tümörlerinin başlatılmasında ve ilerlemesinde ek mutasyonlar çeşitli bir dizi araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir. Bu modelin kullanımı ile meme kanseri biyoloji anlayışı geliştirmek ve sonunda metastatik meme kanseri tedavisinde yönelik yeni terapötik yol umuyoruz.

Meme kanseri dünyada 1,2 ve kansere bağlı ölümlerin 2 ikinci önde gelen nedeni genelinde kadınlarda en sık görülen kanseridir. Kompleks genetik 3,4, 5 histolojik ve klinik fenotipleri 6 meme kanseri, çeşitli alt tipleri karakterize etmek için kullanılır ve genellikle hayatta kalma tahmin etmek için bir araç olarak kullanılır. Meme kanseri olan kadınların büyük bir kohort analizi ölen hastaların (yaklaşık% 80) en çok primer tümörün 7 10 yıl sonrası çıkarıldıktan içinde nüks ettiğini belirtti. Invaziv meme karsinomlarının bir çoğunluğu için, Lenfovasküler güçlü bir kötü sonuç ve hastalığın 8 daha agresif klinik seyri korelasyon olduğu gösterilmiştir. Çünkü meme kanserinin genetik ve fenotipik karmaşıklık, hastalığın bütün seyrini özetlediği bir hayvan modeli yoktur. İnsan göğüs tümörü hücre çizgileri sık olmuşturksenograft ya da bağışıklık eksikliği olan farelerde invaziv ve metastatik meme kanseri ortotopik 9 model olarak kullanılmıştır. Her ne kadar bu detaylı bir çapraz tür aşı olduğu için, bu modeller, tüm tümör mikro etkilerini bozar, bağışıklık baskısı yokluğunda meydana gelir ve. Bu tür kemirgen meme tümörü virüsü (MMTV) ve kesilmiş süt suyu asidik protein (WAP) gibi meme özel promotörler ile tahrik indüklenebilir genetik mutasyonlar göğüs kanserinin genetik yapısı hakkında bilgi muazzam bir katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu promotörlerin dokuya özgü sentezleme tipik insan göğüs kanserinde aşırı ifade onkogenlerin ekspresyonunu ayna yok kaynaklı genetik mutasyon değişken ekspresyonu ile sonuçlanan, endokrin sistem 10-16 için kendi yanıt tarafından tehlikeye girer. Onkogenlerin MMTV tahrik ifade endokrin kontrol üstesinden gelmek için, Moody ve ark. Memede Neu aşırı ifade eden bir koşullu, doksisiklin uyarılabilir modeli oluşturdukepitel 17. Bu model regresyon ve nüks çalışma Tümör oluşumundan sonra Neu deinducing için yararlıdır, ancak tutarlı, uzun vadeli onkogen ifade için sürekli doksisiklin uygulanmasını gerektirir. Mevcut çok sayıda alakalı göğüs tümör modellerinin ayrıntılı bir tartışması Vargo-Gogola et al. 10 ile inceleme bulunabilir Amacımız, tam bir C57BL / 6 arka plan üzerinde izlenebilir, meme kanseri, bir fare modeli geliştirmek için olduğu, mutasyon olayları, modeller bağışıklık basınç mevcudiyetinde bir olgunlaşmamış tümör oluşumu kalıcı indüksiyonundan sonra. Bu TP53 of floxed alelleri ve K-ras bir onkojenik biçimi ve YFP içeren transjenik farelerin meme kanallarına Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs getirmiştir. Cre ifade TP53, bir çok meme kanserlerinde 18&#39;de sık mutasyona uğramış gen ablates ve spesifik olarak YFP ifade ek olarak K-ras bir onkojenik allel indüklermeme duktal epitelyum içinde. K-ras mutasyonu, meme kanseri hastalarının 19,20 sadece% 6.5 &#39;de meydana gelen, meme kanseri sık olmasına rağmen, insan meme tümörleri içinde Ras sinyal yolağının konstitütif aktivasyonu Her2/neu ve EGFR sonucunda yukarı kinazların aşın 21-23. Birçok meme tümör hücre hatlarında Ras sinyal yolunun aktivasyonu, aynı zamanda 24,25 bildirilmiştir. Tümör oluşumu başlangıcı ve cinsel olarak olgun, bakire dişi farelere Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs intraduktal enjeksiyon tekniği anlatacağız. Meme kanseri Bu model, 7-8 hafta koltuk altı lenf düğümü Lenfovasküler invazyon ve metastaz ile yavaş tümör progresyonunun yaklaşık 8 hafta sonra katlanarak büyümeye açık lezyon gelişir. Bu fareler tam bir C57BL / 6 arka plan üzerinde ve YFP ifade tümör hücrelerinin uzak lenf düğümlerinde izlenebilir, çünkü bu model ce incelemek için ilgili bir araç sağlarllular ve immünolojik gizli metastaz mekanizmaları ve metastatik duktal meme kanserinin tedavisi için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için yardımcı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:251px;">Trp53tm1Brn transgenic mice 
			Krastm4Tyj transgenic mice</td>
			<td style="width:145px;">Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:251px;">B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice</td>
			<td style="width:145px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:141px;">006148</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers p53loxp/loxp</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3&#39; 
			5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers LSL-K-ras G12D/+</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3&#39; 
			5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3&#39; 
			5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3&#39; 
			5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Mesothelin expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3&#39; 
			5&#39;-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Progesterone Receptor expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3&#39; 
			5&#39;-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Cytokeratin 8 expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3&#39; 
			5&#39;-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Erbb2 expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3&#39; 
			5&#39;-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Estrogen Receptor A expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3&#39; 
			5&#39;-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			Estrogen Receptor B expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3&#39; 
			5&#39;-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Primers for detection of 
			B-Actin expression</td>
			<td style="width:145px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:289px;">5&#39;-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3&#39; 
			5&#39;-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Adenovirus-CRE</td>
			<td style="width:145px;">Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa</td>
			<td style="width:141px;">Ad5CMVCre</td>
			<td style="width:289px;">Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Adenovirus-mCherry</td>
			<td style="width:145px;">Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa</td>
			<td style="width:141px;">Ad5CMVmCherry</td>
			<td style="width:289px;">Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:145px;">Hamilton company</td>
			<td style="width:141px;">701RN</td>
			<td style="width:289px;">10ml syringe, RN series 
			Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:251px;">Custom needle</td>
			<td style="width:145px;">Hamilton company</td>
			<td style="width:141px;">7803-05</td>
			<td style="width:289px;">33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:251px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:145px;">Dumont</td>
			<td style="width:141px;">52100-58</td>
			<td style="width:289px;">Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">MEM powder</td>
			<td style="width:145px;">Cellgro</td>
			<td style="width:141px;">50 012 PB</td>
			<td style="width:289px;">Store at 4C in powder and reconstituted form</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:141px;">S233</td>
			<td style="width:289px;">Add to MEM and filter stearilize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:251px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">C4901</td>
			<td style="width:289px;">Minimum 96%, anhydrous</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer

Meme kanseri sonunda uzak dokularda ve anti-tümör bağışıklık çöküşüne üstel tümör büyümesi ve metastaz ile sonuçlanan, gelişmekte olan tümör ve immün sistemi arasında karmaşık bir hücre etkileşimleri içeren bir heterojen bir hastalıktır. Birçok yararlı hayvan modelleri meme kanseri çalışma var, ama hiçbiri tamamen insanlarda meydana hastalığın ilerlemesini recapitulate. Latent metastaz oluşumuna neden olabilir ve azalmış sağkalım hücresel etkileşimler daha iyi anlamak amacıyla, biz, bağışıklık-kompetan farelerde cinsel olgunluk sonra gelişir ve tahrik edilir YFP ifade duktal karsinom, indüklenebilir bir fare modeli oluşturduk adres tutarlı, endokrin bağımsız onkojen ifadesi ile. YFP, p53 aktivasyonu ablasyon ve K-ras bir onkojenik biçimi ifadesi cinsel olarak olgun, bakire dişi farelerin meme kanalı içine Cre rekombinaz-sentezleyen bir adenovirüs teslimatı ile elde edilmiştir. Tümörler6 hafta onkojenik olayların başlamasından sonra görünmeye başlar. Tümörler belirgin hale sonra onlar katlanarak büyümeye başlamadan önce, bunlar yaklaşık iki hafta boyunca yavaş yavaş ilerleme. 7-8 hafta sonrası adenovirüs enjeksiyon sonrası, damar uzak aksiller lenf düğümlerine YFP + tümör hücrelerinin nihai lenfovasküler işgali ile, uzak lenf bezlerine tümör kitlesini bağlayan görülmektedir. Infiltratif lökosit popülasyonları αβ ve γδ T hücreleri, makrofajlar ve MDSCs varlığı da dahil olmak üzere insan göğüs karsinom, bulunanlara benzemektedir. Bu eşsiz modeli invasif göğüs kanserinin tedavisi için yeni bir immünoterapötik müdahaleler tasarımı için kullanışlı olmanın yanı sıra latent metastaz ve uyuşukluk dahil hücresel ve imünolojik mekanizmalar çalışma kolaylaştıracaktır.

Memesel duktal ağacın başarılı hedefleme önce tripan mavisi (uygun enjeksiyon tekniği (Şekil 1A) veya (uygun hazırlama ve viral enfeksiyonu kontrol etmek için mCherry sentezleyen bir adenovirüs doğrulamak için enjeksiyonundan sonra 32 tarif edildiği gibi, meme bezinin tüm bağlar hazırlanması ile görselleştirilebilir duktal epitelyum hücrelerinin, Şekil 1 B). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1.jpg" /> Şekil 1.. Trypan mavi veya adenovirüs-mCherry. A) enjeksiyonu ile meme bezlerinin Intradüktal hedeflenmesi bir bütün montaj, tripan mavi 3 saat sonrası enjeksiyon hazırlandı ile daha önce meme bezi 4. enjeksiyonundan sonra meme bezinin 32, rapor gibi görselleştirmek / onayla tüm duktal hedeflemeağaç. Görüntüler mCherry ifade adenovirüs 2.5 x 10 7 pfu enjekte edilerek adenovirüs ile duktal epitel 4X büyütme. B) Enfeksiyon vardır. Fareler intraduktal enjekte edildi ve 4 gün sonra enjeksiyon, meme bezinin bir bütün montaj duktal ağacın viral enfeksiyon teyit etmek için hazırlanmıştır. Görüntü 4X büyütme. MG LD süt veren, ya da ana kanal, ve TD terminali kanal olduğunu, meme bezi olduğunu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Tümörler p53 loxP indüklenen zaman / loxP LSL-K-ras G12D / + transgenik fareler, tümör meme bezleri, genişlemiş ve şişmiş olacak yaklaşık 40 gün kadar belirgin olmaz. Bu gözlenmektedir zaman her 5-7 gün tümör büyümesini izleme, palpations başlamak gereklidir. Elimizde olanlar, meme bezinin sertleşme zaman tümör gelişme başlangıcı öncesinde. Tümörler, ek bir 2 hafta boyunca yavaş yavaş ilerleme olacaktır. Günde 56 civarında başlayarak, tümörler (Şekil 2B) katlanarak büyümeye başlayacak. Bu noktada (Şekil 2A ve 3A) normal tümör ilerlemesi, fare değişkenliğe hafif fare olacak, çünkü kinetik çalışmalar, arzu edilir ise, her 3 günde tümör hacimleri ölçmek için çok önemlidir. Büyük abdominal kitleler tümörler vücut ağırlığının% 10&#39;dan fazla aşıyorsa, farenin ötenazi gereken sonra (Şekil 2A, 2B ve 3A) gün 80 tarafından anlaşılacaktır. bir tümör taşıyan fareden üç klon cDNA analizi, mezotelin ekspresyonunu ortaya, sitokeratin-8, Her2/neu, östrojen reseptörü ve-α (Şekil 2C). <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2.jpg" /> P53 loxP in&gt; Şekil 2,. Tümör gelişimi / loxP LSL-K-ras G12D / + fareler 80 gün Cre sentezleyen adenovirüs ile enjekte edildikten sonra tümörlerin adenovirüs-Cre. A) iki örnekle intraduktal enjekte edilir. Fareler / Cre ifade adenovirüs 2.5 x 10 7 PFU verildi ve 80 gün sonrası tümör-inisiyasyon, geniş kitleler palpe hayvan. B) Tipik tümör kinetik ve p53 LoxP uyarılan tümörler için palpasyon çizelgesi karın tarafında çıkıntılı görüntülendi olabilir loxP LSL-K-ras G12D / + fareler. C) bir p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + fare aynı homojenize tümöründen türetilen üç tümör hücre klonlarının karakterizasyonu. RNA ekstre edildi ve RT-PCR analizi için sentezlenmiş cDNA, mezotelin, sitokeratin-8, Her2/neu, progesteron reseptörü, estrojen reseptörü-α ve β östrojen reseptörü-β-aktin için spesifik primerler kullanılarak edildi.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. Insan göğüs kanserinde hücresel mikro benzer şekilde, biz αβ ve γδ T hücrelerin infiltrasyonunu hem de tümörlere myeloid türevi bastırıcı hücreler ve makrofajlar (Şekil 4) gözlemledik. Aksiller lenf nodu için drenaj damarsal tümörler enjeksiyonu yapıldı, tüm meme dokusu (Şekil 3A) kapsayacak şekilde büyüdü önce yutmak başlayacak. Tümör hücrelerinin Lenfovasküler ve metastaz LSL-EYFP fareler ile LSL-K-ras G12D / + p53 loxp / loxp fareler geçerek izlenebilir. Cre aracılı eksizyon sonra YFP (yüksek ve düşük) ifade eden hücreler, tümörde tespit edilir ve drenaj lenf bezlerine (Şekil 3B) metastaz takip edilebilir. Distal aksiller lenf nodu metastazı teyit edildibaşarılı bir şekilde tümör-taşıyan LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP fare (veriler gösterilmemiştir), bu siteden bir tümör hücre çizgisi kültürlenmesiyle. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3.jpg" /> Koltuk altı lenf düğümü tümörü ve latent metastaz Şekil 3.. Birleşimi. Tümör progresyonu farklı oranlarda üç gelişmiş göğüs tümörlerinin A) Örnek. Sonunda ok, form ve ile gösterilen bir katı madde kütlesi, bütün abdominal meme dokusu boyutuna büyür. Tümör meme dokusu ile sınırlı kalır ve istila veya periton boşluğu kapsayan kas takmak için gözlenmez. Beyaz ok uçları ile gösterilen inguinal ve aksiller lenf düğümleri arasındaki yüzeysel epigastrik ven belirgin dolgunluğu var. 7-8 hafta sonra, the koltuk altı lenf nodu nedeniyle YFP pozitif tümör hücrelerinin metastaz akış sitometrisi ile koltuk altı lenf düğümünde görselleştirilebilir ok. ve B ile belirtilen tümör hücrelerinin lenfovasküler invazyon) için genişlemiş olmaya başlar. LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP farenin adenovirüs-Cre intraduktal teslimi ile tümörler ve YFP aktivasyonunu uyarmak için kullanıldı. Koltuk altı lenf düğümü, 80 gün sonra adenoviral enjeksiyon halinde tümör hücrelerinin istilasını Lenfovasküler doğrulamak için, belirtilen lenf düğümleri ve organların hasat edildi ve lenfosit işaretçileri için boyanmış ve YFP ifadesi için incelendi. CL lenf nodu drenajı kontralateral nontumor temsil eder. Sonuçlar, tümör hücrelerinin uzak koltuk altı lenf bezine akın eden olduğunu belirten, CD45 negatif tümör hücreleri üzerindeki yolluk temsil eder. Sayılar toplam nüfus yüzde YFP pozitif hücrelerini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" target="_blank">larg görüntülemek için buraya tıklayın</a>er görüntü. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4.jpg" /> Şekil 4. Bağışıklık fare transgenik meme tümörlerinde infiltratları. Fare meme tümörleri homojenize ve CD45, CD3, γδTCR, CD11b ve Gr1 için boyandı. Sayılar tüm tümör (63.5) pozitif lökositlerin yüzde temsil toplam CD3 + (46.7), toplam CD3 negatif (40.1), toplam CD3 + γδ + (T hücreleri γδ, 13), CD3 + γδnegative (24), toplam GR1 yüksek CD11 (MDSC, 28.6) ve toplam CD11 GR1 düşük (makrofajlar, 18.5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Nedeniyle fare ve intraduktal enjeksiyon tekniği anatomisine biz hedefleme o bulmakf meme bezleri 4 ve 9 (Şekil 5) en tutarlı sonuçlar ve güvenilir enjeksiyonları verir. Ancak, herhangi bir bezi ameliyat teknisyeni tercihine bağlı olarak hedeflenebilir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5.jpg" /> Şekil 5,. Meme kanalları Numaralandırma. Meme kanalları 4 ve 9 diyagram üzerinde kırmızı renkte ve fare üzerindeki oklar ile gösterilmiştir. Bizim ellerde, biz enjeksiyonları, bu meme kanallarına gerçekleştirmek için biz de benzer kinetik ile geliştirilen tümörleri hedef. Ancak tüm diğer meme dokuları kolay olduğunu buldu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer at JoVE.c

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Klinik açıdan uygun bir metastatik meme kanseri duktal meme sistemi sonuçları içine adenovirüs-Cre ile gizli mutasyonlar aktivasyonu. YFP bir promoter dahil edilmesi uzak metastatik tümör hücrelerinin izleme sağlar. Bu model, latent metastazı, anti-tümör bağışıklık ve meme kanseri tedavisi için yeni immünoterapiler tasarımı için incelemek için yararlı olan.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Boyuna MRG Ardından Meme Kanseri Beyin Metastaz bir Fare Modeli geliştirmek için ultrason görüntüleme eşliğinde intrakardiyak enjeksiyon

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Meme Kanseri Hücrelerinde östrojen düzenlenmiş microRNA profil

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Meme Kanserinde Östrojen Reseptör Sinyali tarafından Metabolik Yönetmelik Sistem Biyolojisi

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...