Name: cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR at JoVE.com

وأيد المشروع التي وصفها عدد جائزة R01MH079751 (PI: F. بيروتزي) من المعهد الوطني للصحة العقلية. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للصحة العقلية أو المعهد الوطني للصحة.

يصف بروتوكول التالية الإجراء العادي لعزل الحمض النووي الريبي من CSF و ملفه الشخصي microRNAs باستخدام لوحات PCR جاهزة. علما بأن استخراج مرحلة العضوية هو اختياري، والتي يتم إضافتها على الحمض النووي الريبي الناقل للعينة خلال استخراج ضمان الانتعاش القصوى من الحمض النووي الريب...

<ol>
	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

MicroRNAs هي الرناوات غير المكودة الصغيرة التي تنظم التعبير الجيني عن طريق تثبيط الترجمة و / أو تعزيز تدهور مرنا 2. بسبب ارتفاع الاستقرار في ظروف خالية من الخلايا، وقد تم الكشف عن microRNAs في كثير من سوائل الجسم. علاوة على ذلك، ارتبط الشخصي التعبير متميزة من microRNAs مع المر...

MicroRNAs تنتمي لعائلة صغيرة (21-23 الإقليم الشمالي في الطول) غير المكودة الرنا التي تنظم التعبير الجيني آخر ما بعد transcriptionally. microRNAs يمكن يفرز في الفضاء خارج الخلية حيث تبدو مستقرة نسبيا. مع تحديد التغيرات في التعبير ميرنا يمكن أن يكون خطوة مهمة نحو تحديد المؤشرات الحيوية، وأداء لمحات ميرنا والتعامل مع كمية كبيرة من البيانات قد تكون مخيفة. هنا، نحن تصف بروتوكول لتحديد التغيرات في التعبير ميرنا في السائل النخاعي (ينطبق على سوائل الجسم الأخرى) من قبل في الوقت الحقيقي PCR الحساسة. نحن أيضا وصف استخدام البرمجيات لتحليل البيانات، بما في ذلك التحليل الإحصائي وتمثيل رسومي للنتائج. الإجراء بأكمله من السهل نسبيا ومباشرة، واعتمادا على عدد من العينات المراد لمحة وعدد من آلات PCR الوقت الحقيقي متاحة، أيضا سريع نسبيا. الجزء التجريبي يتطلب الدقة في التعامل معالحمض النووي الريبي وpipetting لفي لوحات 384 جيدا، في حين أن قسم تحليل البيانات باستخدام GENEX يتطلب بعض المعرفة الأساسية في مجال المعلوماتية والإحصاءات.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> MicroRNAs (miRNAs) تشكل طبقة قوية من تنظيم الجينات من خلال توجيه RISC لاستهداف مواقع تقع على mRNAs و، وبالتالي، من خلال تحوير قمعهم متعدية. وقد تبين أن التغيرات في التعبير ميرنا أن تشارك في تطوير جميع الأمراض المعقدة الكبرى. علاوة على ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة التي miRNAs يمكن يفرز في البيئة خارج الخلية وتدخل إلى مجرى الدم وسوائل الجسم الأخرى حيث يمكن أن تعمم مع ارتفاع الاستقرار. لا تزال وظيفة مثل هذه miRNAs تعميم بعيد المنال إلى حد كبير، ولكن قد يؤدي النهج إنتاجية عالية منهجية، مثل ميرنا صفائف التنميط، إلى التعرف على التواقيع ميرنا في العديد من الحالات المرضية، بما في ذلك الاضطرابات العصبية وعدة أنواع من السرطان. في هذا السياق، وتحديد ميرنا الشخصي التعبير في السائل النخاعي، كما ورد في دراستنا الأخيرة، يجعل miRNAs المرشحين جذابة للتحليل العلامات البيولوجية. _content &quot;&gt; هناك العديد من الأدوات المتاحة لالتنميط microRNAs، مثل ميكروأرس، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR)، وتسلسل عميق. هنا، نحن تصف طريقة حساسة لملف microRNAs في السوائل المخية التي كتبها الكمي في الوقت الحقيقي PCR. نحن استخدام Exiqon الرنا الميكروي جاهزة للاستخدام الألواح الإنسان PCR الأول والثاني V2.R، والذي يسمح الكشف عن 742 microRNAs الإنسان فريدة من نوعها. أجرينا صفائف في أشواط ثلاث نسخ، ونحن المصنعة وتحليل بيانات باستخدام برنامج GENEX المهنية 5. باستخدام هذا البروتوكول، لدينا لمحة بنجاح microRNAs في أنواع مختلفة من خطوط الخلايا والخلايا الأولية، CSF، والبلازما، والأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين.

النتائج من هذه الدراسة قد نشرت سابقا 1. الشكل 1 يبين النتائج من تحليل microRNAs المرجعية المرشحة باستخدام تطبيق geNorm. وفقا لذلك، وهما microRNAs، مير 622 ومير 1266، كما تم تحديد الجينات المرجعية، وكانت تستخدم لتطبيع القيم ميرنا. ل...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR at JoVE.com

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

نحن تصف بروتوكول الوقت الحقيقي PCR لملف microRNAs في السائل النخاعي (CSF). باستثناء بروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي، ويمكن تمديد هذا الإجراء إلى الحمض النووي الريبي المستخرج من مخالطة سوائل جسمه الأخرى، الخلايا المستزرعة، أو عينات الأنسجة.

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

في الوقت الحقيقي بيوفيدباك الرنين المغناطيسي الوظيفي استهداف القشرة الأمامية المدارية للقلق التلوث

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

حركة إعادة التدريب في الوقت الحقيقي باستخدام ملاحظات من الأداء

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR لتحديد الجهات المانحة Engraftment خلية في التنافسية نموذج الفئران زرع نخاع العظم

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

في الوقت الحقيقي السمسة فحوصات في الدم الكامل بالبشر

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

الكمي قداس الطيفية من التنميط Proteomes خلايا السرطان المستمدة من السائل والأورام الصلبة

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

في الوقت الحقيقي الأشعة السينية التصوير من الرئة أحجام السوائل في الأطفال حديثي الولادة الرئة ماوس

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...