Name: cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR at JoVE.com

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Das folgende Protokoll beschreibt die Standard-Verfahren, um RNA aus GFK und Profil microRNAs mit fertigen PCR-Platten isolieren. Beachten Sie, dass die organische Extraktionsphase ist optional, und daß ein Träger-RNA wird während der Extraktion gewährleistet eine maximale Rückgewinnung der RNA zu der Probe gegeben. Folglich gibt es keine Notwendigkeit, um die RNA zu quantifizieren. Insgesamt kann ein Durchschnitt von 6-8 Platten an einem Tag ausgeführt werden, wenn die cDNA am Tag zuv...

<ol>
	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression regulieren, durch die Hemmung der Translation und / oder die Förderung der mRNA-Abbau 2. Aufgrund ihrer hohen Stabilität in zellfreien Bedingungen haben microRNAs in vielen Körperflüssigkeiten nachgewiesen worden. Außerdem hat deutliche Expressionsprofil miRNAs mit Stufe und / oder Progression bei einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten 3-9 korreliert. Es gibt verschiedene Tools zur Verfügung, u...

MicroRNAs gehören zu der Familie der kleinen (21-23 nt Länge) nicht-kodierenden RNAs die Genexpression posttranskriptional regulieren. Mikro-RNAs in den extrazellulären Raum, in dem sie erscheinen, relativ stabil zu sein, sezerniert werden. Während Bestimmung von Veränderungen in der miRNA-Expression kann ein wichtiger Schritt zur Identifizierung von Biomarkern sein, die Durchführung miRNA-Profile und Handhabung einer großen Menge von Daten kann einschüchternd sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll von Änderungen in miRNA-Expression in der Zerebrospinalflüssigkeit von einem empfindlichen Echtzeit-PCR (für andere Körperflüssigkeiten) zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Verwendung von Software für die Datenanalyse, einschließlich der statistischen Auswertung und grafische Darstellung der Ergebnisse. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und unkompliziert und in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben, die profiliert werden und die Anzahl von Echtzeit-PCR-Maschinen verfügbar sind, auch relativ schnell. Der experimentelle Teil erfordert Genauigkeit bei der HandhabungRNA und Pipettieren in 384-Well-Platten, während der Datenanalyse Abschnitt mit Genex erfordert einige Grundkenntnisse in Informatik und Statistik.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> MicroRNAs (miRNAs) sind eine starke Schicht der Genregulation Führungs RISC zu Seiten mRNAs Ziel befindet und somit durch Modulation ihrer translationale Repression. Änderungen in der miRNA-Expression wurde gezeigt, dass bei der Entwicklung von allen großen komplexen Erkrankungen beteiligt sein. Darüber hinaus zeigten neuere Erkenntnisse, dass miRNAs an die extrazelluläre Umgebung sezerniert werden und in die Blutbahn und anderen Körperflüssigkeiten, wo sie mit hoher Stabilität zirkulieren kann. Die Funktion eines solchen zirkulierenden miRNAs bleibt weitgehend ungeklärt, aber systematische Hochdurchsatz-Methoden, wie z. B. miRNA-Profiling Arrays haben zur Identifizierung von miRNA-Signaturen in verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen und einige Krebsarten führen. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung von miRNA-Expressionsprofils in der Cerebrospinalflüssigkeit, wie in unserer jüngsten Studie berichtet, macht miRNAs attraktive Kandidaten für Biomarker-Analyse. _content &quot;&gt; Es gibt verschiedene Tools für die Profilierung von microRNAs, wie Microarrays zur Verfügung, quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) und deep sequencing. Hier beschreiben wir eine empfindliche Methode, um microRNAs in Liquor durch quantitative Echtzeit-PCR-Profil. Wir verwendet die Exiqon microRNA ready-to-use PCR menschlichen Platten I und II V2.R, die ermöglicht den Nachweis von 742 einzigartige menschliche microRNAs. Wir führten die Arrays in dreifacher Ausfertigung läuft und wir verarbeitet und analysiert Daten mit der Genex Professional 5 Software. Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich in verschiedenen Arten von Zelllinien und Primärzellen, Liquor, Plasma und Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben Profil microRNAs.

Die Ergebnisse dieser Studie wurden bereits veröffentlicht worden 1. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse aus der Analyse der Kandidatenreferenz microRNAs mit geNorm Anwendung. Dementsprechend zwei microRNAs, miR-622 und miR-1266, wurden als Referenzgene identifiziert und wurden verwendet, um miRNA Werte normalisieren. Für die CSF-Studie hatten wir drei Gruppen von Proben: HIV-(n = 10), HIVE (n = 4) und HIV + ohne Enzephalitis (HIV +, n = ...

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Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Forschung

Medizin

Real-time fMRI Biofeedback Targeting the Orbitofrontal Cortex for Contamination Anxiety

Real-time fMRI Biofeedback Targeting des orbitofrontalen Cortex für die Kontamination Anxiety

We present a method for training subjects to control activity in a region of their orbitofrontal cortex associated with contamination anxiety using ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

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MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Movement Umschulung mit Echtzeit-Feedback von Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

Echtzeit-Röntgenbildgebung von Lungenflüssigkeitsvolumen in Neonatal Mauslunge

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...