Name: ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly
Uploaded: 2014-04-17T16:00:00
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Le soutien financier a été fourni à JMS du NIH biomécanique dans le programme de formation T32 médecine régénérative (2T32EB003392), à QJ du Dowd-CIEM bourse et à la FAE de New Innovator Award du directeur des NIH (1DP2HL117750).

1. Fabrication de moule Master en utilisant la photolithographie <ol><li> Les nanofibres de protéines ECM, nanofabrics et nanostructures à être fabriqués sont d&#39;abord conçus à l&#39;aide Conception Assistée par Ordinateur (CAO). Ce fichier CAO est ensuite transféré à un photomasque. Le type de photomasque dépendra de la résolution des caractéristiques; avec un masque photographique basée sur la transparence adéquate pour fonction de tailles jusqu&#39;à ~ 10 um. Caractéristiques petits &lt;10 um, i...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix+and+the+cytoskeleton.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Discher, D. 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La méthode présentée ici SIA imite assemblage de la matrice à médiation cellulaire et permet l&#39;ingénierie des ECM nanofibres de protéines et de nanostructures avec la taille accordable, l&#39;organisation et la composition. Bien que n&#39;étant pas identique à ECM généré cellulaire, SIA crée ECM composée de fibrilles protéiques nanométriques 20 qui subissent pliage réversible / dépliage pendant contrainte mécanique 21 et peuvent se lier les cellules 20. Ceci permet...

La matrice extracellulaire (ECM) dans les tissus est composée de protéines multifonctionnelles impliquées dans la régulation physique et chimique des processus cellulaires multiples, y compris l&#39;adhérence, la prolifération, la différenciation, l&#39;apoptose et 3.1. L&#39;ECM est synthétisé, assemblé, et organisée par les cellules et les fibrilles protéiques constitutifs ont des compositions uniques, la taille des fibres, des géométries et des architectures interconnectés qui varient selon le type de tissu et le stade de développement. Des travaux récents ont montré que l&#39;ECM peut fournir des indices instructifs pour guider les cellules pour former des tissus modifiés 4, ce qui suggère que récapitulant l&#39;ECM en termes de composition et de la structure pourrait permettre le développement de matériaux biomimétiques pour des applications de génie tissulaire et de la biotechnologie. Un certain nombre de méthodes de fabrication ont été développés pour concevoir des échafaudages polymères qui peuvent imiter les aspects de l&#39;ECM dans les tissus. Par exemple, électrofilature et la phase separation ont démontré à la fois la capacité de former des matrices poreuses de fibres avec des diamètres allant de quelques dizaines de micromètres à plusieurs dizaines de duvet 5-7 nanomètres. Les deux techniques ont également montré que des matrices très poreuses de nanofibres peuvent supporter l&#39;adhérence cellulaire et l&#39;infiltration dans l&#39;échafaud 8. Cependant, ces approches sont limitées dans les géométries possibles de fibres, les orientations et les architectures 3D qui peuvent être créés. Électrofilage produit typiquement échafaudages avec des fibres orientées de façon aléatoire soit ou très alignés tandis que la séparation de phase produit échafaudages avec des fibres orientées de façon aléatoire. Il existe aussi des limitations concernant les matériaux, typiquement avec des chercheurs utilisant des polymères synthétiques, tels que le poly (ε-caprolactone) 8 et le poly (acide lactique-co-glycolique) 9, qui sont ensuite revêtu avec des protéines de la MEC pour favoriser l&#39;adhérence cellulaire. Biopolymères naturels sont également utilisés, y compris le collagène de type I 10, 11 de la gélatine, du fibrinogène 12,chitosane 13 et 14 soie, mais ne représentent qu&#39;une petite partie des protéines trouvées dans le tissu natif. La plupart des tissus contiennent un plus grand milieu de protéines et de polysaccharides y compris la MEC de la fibronectine (FN), la laminine (LN), le collagène de type IV et d&#39;acide hyaluronique qui sont difficiles ou impossibles à fabriquer des nanofibres en utilisant des procédés existants. Pour relever ce défi, nous avons concentré nos efforts de recherche sur imitant la façon dont les cellules synthétisent, former et organiser des fibrilles de protéines ECM dans leur environnement. Alors que le processus de fibrillogénèse spécifique varie pour différentes protéines de la MEC, typiquement un changement conformationnel dans la molécule de protéine d&#39;ECM est déclenchée par une interaction enzymatique ou médiée par les récepteurs, ce qui expose des sites cryptiques d&#39;auto-assemblage. Ici, nous utilisons FN comme un système modèle pour mieux comprendre le processus de fibrillogenèse. Brièvement, des homodimères FN se lient à des récepteurs d&#39;intégrine sur la surface cellulaire par l&#39;intermédiaire de la séquence d&#39;acides aminés RGD dans le 10 type IIJe le répète unité. Une fois lié, les intégrines s&#39;écartent par actomyosin contraction et se déroulent les dimères FN pour exposer les sites d&#39;auto-assemblage cryptiques. L&#39;exposition de ces sites de liaison FN-FN permet aux dimères FN à assembler en un fibrilles insolubles à droite sur la surface de la cellule 15. Travail dans les systèmes sans cellules a démontré que les sites de liaison FN-FN cryptiques peuvent être révélées par dépliage utilisant dénaturants 16 ou tension de surface à un-liquide-solide sur l&#39;interface radio 17-19. Cependant, les fibres FN créés par ces techniques sont limitées à des tailles et géométries de fibres spécifiques et sont généralement liés à une surface. Nous décrivons ici un appelé ensemble de la surface à l&#39;initiative approche (SIA) 20 qui surmonte ces limitations en utilisant des interactions protéine-surface pour créer de libre-debout nanofibres insolubles, nanofabrics (feuilles 2D) et d&#39;autres nanostructures composées de protéines de la MEC simples ou multiples (figure 1 ). Dans cette process, protéines de la MEC sont adsorbées à partir, une conformation globulaire compact en solution et partiellement dénaturé (déplié) sur un polydiméthylsiloxane hydrophobe (PDMS) des motifs timbre. Les protéines de la MEC sont ensuite transférés dans cet état ​​sur ​​un poly sensible à la chaleur (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface par microcontact impression 22. Lorsqu&#39;il est hydraté avec 40 ° C de l&#39;eau au PIPAAm reste d&#39;un solide, mais lorsqu&#39;il est refroidi à 32 ° C, il passe par une température de solution critique inférieure (LCST) où elle devient hydrophile, gonflant à l&#39;eau puis se dissout, libérant les nanostructures ECM assemblés hors de la surface. La méthode SIA permet de contrôler les dimensions avec une précision nanométrique. En contrôlant les paramètres clés tels que la composition, la géométrie de la fibre, et de l&#39;architecture, il est possible de récapituler nombreuses propriétés de l&#39;ECM trouvés in vivo et de développer des échafaudages avancés pour des applications de génie tissulaire et de la biotechnologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

La matrice extracellulaire (ECM) dans les tissus est synthétisée et assemblée par les cellules pour former un fibrillaire 3D, réseau de protéines étroitement régulé avec le diamètre des fibres, de la composition et son organisation. En plus de fournir un support structurel, dont les propriétés physiques et chimiques de l&#39;ECM jouent un rôle important dans de multiples processus cellulaires, y compris l&#39;adhérence, la différenciation et l&#39;apoptose. In vivo, l&#39;ECM est assemblé en exposant cryptique d&#39;auto-assemblage (fibrillogenèse) des sites au sein de protéines . Ce processus varie pour des protéines différentes, mais la fibronectine (FN) fibrillogénèse est bien caractérisée et sert de système modèle pour l&#39;ensemble de l&#39;ECM à médiation cellulaire. Plus précisément, les cellules utilisent des récepteurs de l&#39;intégrine sur la membrane des cellules pour se lier dimères FN et les forces contractiles actomyosine généré à déplier et exposer les sites de liaison pour l&#39;assemblage sous forme de fibres insolubles. Ce processus médiée par le récepteur des cellules permet d&#39;assembler et d&#39;organiser l&#39;ECM à partir du cellulaire à sca tissulaireles. Ici, nous présentons une méthode appelée surface initiative assemblage (SIA), qui récapitule assemblage de la matrice à médiation cellulaire utilisant des interactions protéine-surface à déplier protéines de la MEC et les assembler en fibres insolubles. Tout d&#39;abord, les protéines de la MEC sont adsorbées sur un polydiméthylsiloxane hydrophobe (PDMS) de surface où ils dénaturent partiellement (dépliante) et exposent domaines de liaison cryptiques. Les protéines dépliées sont ensuite transférés dans bien définis micro-et nanomotifs grâce à l&#39;impression par microcontact sur un poly sensible à la chaleur (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Dissolution thermique déclenché de la PIPAAm conduit à l&#39;assemblage final et la libération de protéines insolubles nanofibres de ECM et nanostructures avec des géométries bien définies. Architectures complexes sont possibles en ingénierie défini motifs sur les PDMS cachets utilisés pour l&#39;impression par microcontact. En plus de FN, le processus SIA peut être utilisé avec la laminine, le fibrinogène et les collagènes de type I et IV de créer plusieurs composants ECM nanostructurestures. Ainsi, SIA peut être utilisé pour fabriquer des matériaux à base de protéines ECM avec un contrôle précis de la composition des protéines, la géométrie de la fibre et de l&#39;architecture de l&#39;échafaudage pour récapituler la structure et la composition de la MEC in vivo.

SIA est capable de ECM d&#39;ingénierie nanofibres de protéines avec un contrôle précis sur les dimensions des fibres. Pour le démontrer, des tableaux de nanofibres FN avec des dimensions planes de 50 x 20 um ont été modelés sur une lamelle enduit PIPAAm (figure 2A). Lors de la libération, les fibres contractées parce qu&#39;ils étaient sous une pré-stress inhérent quand modelé sur la surface PIPAAm (figure 2B). Analyse des nanofibres FN a révélé qu&#39;ils étaient pr?...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Procédé pour obtenir des nanofibres et des nanostructures complexes de protéines de matrice extracellulaire uniques ou multiples est décrite. Cette méthode utilise les interactions protéine-surface pour créer des matériaux à base de protéines sans date avec la composition accordable et de l&#39;architecture pour une utilisation dans une variété d&#39;applications d&#39;ingénierie tissulaire et de la biotechnologie.

Nanofibres ECM de protéines et Utilisation de l&#39;assemblage de la surface à l&#39;initiative Nanostructures Engineered

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