Name: ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly
Uploaded: 2014-04-17T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly at JoVE.com

O apoio financeiro foi fornecido a JMS do NIH em Biomecânica Medicina Regenerativa Programa de Formação de T32 (2T32EB003392), a QJ do Fellowship Dowd-ICES e AWF de New Innovator Award do Diretor NIH (1DP2HL117750).

1. Fabricação de Molde Mestre usando fotolitografia <ol><li> As nanofibras de proteínas ECM, nanofabrics e nanoestruturas a ser fabricados são primeiramente projetados usando software Computer Aided Design (CAD). Este arquivo CAD é então transferido para um photomask. O tipo de fotomáscara dependerá da resolução das características; com um photomask baseada em transparência adequada para o recurso tamanhos até ~ 10 m. Características menores &lt;10 m exigirá um cromo em photomask vidro. Todas as nanofib...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix+and+the+cytoskeleton.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Discher, D. 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O método aqui apresentado SIA imita montagem matriz mediada por células e permite que a engenharia de proteínas ECM nanofibras e nanoestruturas com tamanho ajustável, organização e composição. Apesar de não ser idêntico ao ECM gerado pelo celular, SIA cria ECM composta de fibrilas da proteína em nanoescala 20 que sofrem de dobramento reversível / desdobramento durante tensão mecânica 21 e podem ligar células 20. Isto proporciona uma capacidade única para construir materia...

A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é composta de proteínas multifuncionais envolvidos na regulação física e química de vários processos celulares, incluindo adesão, proliferação, diferenciação e apoptose 1-3. O ECM é sintetizada, montado e organizado pelas células e as fibras de proteína constituintes têm composições únicas, tamanho da fibra, geometrias e arquiteturas interligadas que variam com o tipo de tecido e estágio de desenvolvimento. Trabalhos recentes têm demonstrado que o ECM pode fornecer pistas instrutivas para orientar células para formar tecidos artificiais 4, sugerindo que recapitulando a ECM em termos de composição e estrutura pode permitir o desenvolvimento de materiais biomiméticos para aplicações em engenharia de tecidos e biotecnologia. Um número de métodos de fabrico têm sido desenvolvidos para manipular andaimes poliméricos que podem imitar aspectos da ECM em tecidos. Por exemplo, eletrofiação e separ faseção têm ambos demonstraram a capacidade para formar matrizes porosas de fibras com diâmetros que variam entre dezenas de micrómetros deslocamento de dezenas de nanómetros de 5-7. Ambas as técnicas têm também mostrado que as matrizes altamente porosas de nanofibras pode suportar a adesão de células e infiltração no andaime 8. No entanto, estas abordagens estão limitadas nas geometrias possíveis orientações de fibra, e 3D arquitecturas que podem ser criados. Electrospinning normalmente produz andaimes com fibras ou orientadas aleatoriamente ou altamente alinhadas ao passo que a separação de fase produz andaimes com fibras orientadas aleatoriamente. Também existem limitações sobre o material, com investigadores tipicamente utilizando polímeros sintéticos, tais como poli (ε-caprolactona) 8 e poli (ácido láctico-co-glicólico), 9, que são posteriormente revestidos com proteínas de ECM para promover a adesão celular. Biopolímeros naturais também são utilizados, incluindo o colágeno tipo I 10, 11 gelatina, fibrinogênio 12,quitosana 13 e 14 de seda, mas representam apenas um pequeno subconjunto das proteínas encontradas no tecido nativo. A maioria dos tecidos contêm um meio maior de proteínas da MEC e polissacarídeos incluindo a fibronectina (FN), laminina (LN), o colagénio tipo IV e ácido hialurónico que são difíceis ou impossíveis de fabricar utilizando nanofibras de métodos já existentes. Para enfrentar esse desafio, temos focado nossos esforços de pesquisa sobre imitando a forma como as células sintetizar, montar e organizar fibrilas da proteína ECM em seus arredores. Enquanto o processo de fibrilogénese específica varia para diferentes proteínas da MEC, tipicamente uma alteração conformacional na molécula de proteína da MEC é desencadeada por um enzimática ou interacção mediada por receptor, o que expõe locais de auto-montagem crípticos. Aqui usamos FN como um sistema modelo para entender melhor o processo fibrilogênese. Resumidamente, FN homodímeros se ligam a receptores de integrina sobre a superfície celular através da sequência de aminoácidos RGD no 10 tipo IIRepito unidade. Uma vez ligado, as integrinas se afastam via contração actomiosina e desdobrar os dímeros FN para expor sites de auto-montagem enigmáticas. A exposição a estes locais de ligação de NF-FN permite que os dímeros de FN para montar em uma fibrila insolúvel direita na superfície da célula 15. Trabalho em sistemas livres de células demonstrou que os sítios de ligação FN-FN enigmáticas pode ser revelado através de desdobramento usando desnaturantes 16 ou tensão superficial em um ponto sólido-líquido interface de ar 17-19. No entanto, as fibras de FN criada por estas técnicas são restritas para os tamanhos e geometrias de fibras específicas e está tipicamente ligado a uma superfície. Aqui nós descrevemos um conjunto iniciou-superfície denominado abordagem (SIA) 20, que supera estas limitações, utilizando interações proteína de superfície para criar nanofibras sem pé insolúveis, nanofabrics (folhas 2D) e outras nanoestruturas compostas de proteínas individuais ou múltiplas de ECM (Figura 1 ). Neste process, proteínas da MEC são absorvidos a partir de uma conformação compacta, globular em solução e parcialmente desnaturado (desdobrado) em um, polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) selo padronizado. As proteínas são então transferidas ECM neste estado num poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície através microcontact impressão 22. Quando hidratado com água de 40 ° C a PIPAAm continua a ser um sólido, mas, quando arrefecida a 32 ° C que passa através de uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), onde ela se torna hidrofílico, incha com água e, em seguida, dissolve-se, libertando as nanoestruturas ECM montados fora de a superfície. O método SIA fornece controle sobre as dimensões com precisão à escala nanométrica. Ao controlar os parâmetros-chave, tais como a composição, a geometria da fibra, e arquitetura, é possível recapitular muitas propriedades da ECM encontradas in vivo e desenvolver suportes avançados para aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é sintetizada e montada pelas células para formar um fibrilar 3D, rede com proteína fortemente regulada diâmetro da fibra, da composição e organização. Além de proporcionar um suporte estrutural, as propriedades físicas e químicas do ECM desempenham um papel importante em vários processos celulares, incluindo adesão, diferenciação e apoptose. In vivo, a ECM é montado expondo críptico automontagem locais (fibrilogênese) dentro de proteínas . Este processo varia para diferentes proteínas, mas a fibronectina (FN) fibrilogênese é bem caracterizado, e serve como um sistema modelo para a montagem de ECM mediada por células. Especificamente, as células utilizam receptores de integrina sobre a membrana celular para ligar dímeros de FN e forças contrácteis gerado-actomiosina para desdobrar e expor os locais de ligação para a montagem em fibras insolúveis. Este processo mediado por receptores de células permite montar e organizar o ECM do tecido celular para scales. Aqui, apresentamos um método denominado montagem iniciou-superfície (SIA), que recapitula a montagem da matriz mediada por células usando interações proteína-superfície a se desdobrar proteínas da MEC e montá-las em fibras insolúveis. Primeiro, proteínas da MEC são adsorvidos um polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) superfície onde eles parcialmente desnaturar (desdobrar) e expor domínios de ligação enigmáticas. As proteínas desdobradas em seguida, são transferidos em bem definidas micro e nanopatterns através de impressão em uma microcontacto poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície. Dissolução termicamente acionado do PIPAAm leva à montagem final e liberação de proteínas insolúveis nanofibras ECM e nanoestruturas com geometrias bem definidas. Arquiteturas complexas são possíveis por padrões de engenharia definidos nos selos PDMS utilizados para impressão microcontact. Além disso a FN, o processo de PEI poderá ser usado com laminina, fibrinogénio e colagénios do tipo I e IV para criar multi-componente nanostruc ECMturas. Assim, o SIA pode ser utilizado para manipular os materiais à base de proteínas de ECM com o controlo preciso sobre a composição de proteína, fibra de geometria e arquitectura de andaime, a fim de recapitular a estrutura e composição da MEC in vivo.

SIA é capaz de ECM engenharia nanofibras de proteínas com um controle preciso sobre as dimensões das fibras. Para demonstrar isto, matrizes de nanofibras FN com dimensões planares de 50 x 20 um foram modelados para uma lamela PIPAAm revestido (Figura 2A). Após a liberação, as fibras contratados porque estavam sob uma pré-estresse inerente ao modeladas na superfície PIPAAm (Figura 2B). Análise das nanofibras FN revelou que foram pré-autorização monodisperso com um compriment...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

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