Name: visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking
Uploaded: 2014-03-10T20:30:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

אנו מכירים ג&#39;סטין פינקני ויוהנס Hohlbein לעזרה בבנייה של מיקרוסקופ העידו ושיימוס הולדן עבור תוכנת הלוקליזציה. רודריגו רייס-למוט הוא הודה למתן א זן חיידק. המחקר מומן על ידי הבריאות-F4-2008-201,418 נציבות האירופיות תכנית המסגרת השביעית גרנט FP7/2007-2013, בריטניה ביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה המועצה למחקר גרנט BB/H01795X/1, והמועצה האירופית למחקר גרנט 261,227 לANK. DJS מומן על ידי Wellcome Trust Program גרנט WT083469. SU נתמכה על ידי דוקטורט MathWorks.

<ol>
	<li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy.">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy.">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li><li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li><li>Wieser, S., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do's+and+Don't's.">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li><li>Arnauld, S., Nicolas, B., Herv&#233;, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li><li>Elmore, S., M&#252;ller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli.">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li><li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins.">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו דנים כמה שיקולים מרכזיים להצלחה של הניסוי. בחירה וביטוי של חלבון היתוך הניאון: יש לוח גדול של חלבוני ניאון photoactivatable וphotoswitchable 17. הבחירה הספציפית תלויה במאפייני מיקרוסקופ, במיוחד הלייזרים והמסננים זמינים. השילוב של 405 ננומטר ו561 ננומטר הוא אידיאלי עבור חלבוני ניאון photoactivatable משותפים. בחרנו PAmCherry 6 כי זה monomeric ולא הראיתי צבירה בתאים. יתר על כן, photoactivation בלתי הפיך מאפשר לספור את מספר fluorophores הופעל כדי למדוד מספרי עותק חלבון לכל תא. במקום להביע את חלבון ההיתוך מפלסמיד, אנו מעדיפים החדרה הכרומוזומלי של הגן המקודד לחלבון ההיתוך במוקד wild-type. זה מבטיח החלפה של החלבון של עניין להשלים עם הניאון version ושמירה על רמת ביטוי wild-type. שיעור photoactivation: חשוב להתאים את קצב כזה photoactivation כי בממוצע פחות ממולקולה אחת לכל תא נמצאת במצב הניאון בכל מסגרת של הסרט. זה תלוי בעוצמת 405 ננומטר ומספר המולקולות עזב כדי להיות מופעל. בצפיפויות הדמיה נמוכות מאוד, עם זאת, לא כל המולקולות יהיו צילמו לפני סוף הסרט או סרטים ארוכים מאוד צריכים להיות נרכשים. מספר המסגרות שנרשמו לכל סרט תלוי במספר העותק של חלבוני היתוך לכל תא וכל החיים הממוצעים photobleaching של PAmCherry בתנאי העירור בשימוש. עותק מספר Pol1 הוא ~ 400 מולקולות / הערך הממוצע של התפלגות החיים photobleaching מעריכי תא 1 והיה ~ 4 מסגרות. על ידי הגדלת עוצמת 405 ננומטר בהדרגה, ההפעלה מופצת באופן שווה על פני 10,000 המסגרות של הסרט. לכן, כל תא הוא occupמטען על ידי מולקולות ניאון עבור סכום כולל של ~ 1,600 מסגרות, להבטיח חפיפה מועטת של PSFs וסיבוכים מעקב בסרט של 10,000 מסגרות. עוצמות זמן חשיפה ועירור: בראש ובראשונה, זמני חשיפה צריכה להיות קצר מספיק כדי להתבונן PSFs החד בתנועה קצת טשטוש. עם זאת, יש לבחור את מסגרת הדולר להניב תנועה מולקולרית נצפית בין מסגרות רצופות מעבר לחוסר ודאות הלוקליזציה, אחרת פוטונים חיוניים מבוזבזים על ידי oversampling המסלול. התנועה של מולקולות מאוגדים יש נדגם במרווחי זמן ארוך מספיק כדי להיות מובחן מהתנועה הנראית של מולקולות מחויבות בשל אי וודאות הלוקליזציה באופן ברור. כשהזמן החשיפה מוגדר, צריכה להיות מותאמת עוצמת כוחות הביטחון הפלסטיניים. דיוק הלוקליזציה של כוחות הביטחון הפלסטיניים עולה עם מספר הפוטונים זוהו על משך הזמן של מסגרת. עוצמות עירור גבוהות יותר להגדיל את bu שיעור פליטת הפוטוןt גם שיעור photobleaching ואות רקע. השתמש בעוצמת העירור הנמוכה ביותר שנותנת את דיוק הלוקליזציה הרצויה. לPol1-PAmCherry בחרנו 15.26 msec / מסגרת ו3.5 עירור mW 561 ננומטר (400 W / 2 סנטימטר). זה חשוב כדי לאשר תא כדאיות לתנאי הדמיה מסוימים על ידי ניטור צמיחת תאים ומורפולוגיה לפני ואחרי רכישת נתונים (ראה מידע נוסף בUphoff et al. 7). Pol1 מפגין זמן מחייב של ~ 2 שניות למצע ה-DNA ומרווחות in vivo 7, ולכן אנו מצפים שרוב המולקולות להיות גם במדינה המאוגדת או לא מאוגדת עבור כל משך הזמן של מסלול. מולקולות Bound מופיעות בעצם נייחות כי יש לי אתרי כרומוזום מקדם הדיפוזיה כמה סדרי גודל נמוך יותר (~ 10 -5 מיקרומטר 2 / sec, אלמור ואח&#39;. 18) מאשר דיפוזיה Pol1 בציטופלסמה (~ 1 מיקרומטר 2 </sעד&gt; / sec). ניתוח דיפוזיה: * D מקדם הדיפוזיה לכאורה מחושב מMSD של שירים בודדים, בממוצע למינימום של 4 שלבים (5 מסגרות) כדי להפחית את השגיאה הסטטיסטית. שים לב ש~ 75% ממולקולות אקונומיקה בתוך פחות מ -5 מסגרות לתנאי ההדמיה מתוארות. מסלולים קצרים כל כך לא מספקים ודאות סטטיסטית מספיק כדי להבחין מולקולות מאוגדת ומאוגדות. עם זאת, שברים היחסי של מולקולות מאוגדים ולא מאוגדים שידווחו על פעילות החלבון אינם תלויים במספר הכולל של מסלולים מנותחים. זה שימושי כדי להסביר את שגיאת לוקליזציה כוחות הביטחון הפלסטיניים (loc σ) בחישוב * D בגלל חוסר הוודאות מוסיפה צעד אקראי לכאורה זה לזה לוקליזציה של מולקולה 15. כדי לשפר את הסיווג של מולקולות מאוגדים ולשדר, אנו ממליצים על חישוב D בוט *שעות מההתקות בשלב יחיד וההתקות לאורך הזמן של שתי מסגרות. אז זה אפשרי לקבוע שני ספים נפרדים D *: * D (15 אלפיות שני) &lt;0.15 מיקרומטר 2 / sec ו* D (30 אלפיות שני) &lt;0.075 מיקרומטר 2 / sec. שים לב ש* D הוא מקדם הדיפוזיה ברורה שהוא מושפע כליאת תא של המסילה ותנועת טשטוש עקב דיפוזיה בזמן החשיפה. כדי לחלץ מקדמי דיפוזיה משוחד מדויקים, היא הוכיחה שימושית כדי להשוות את ההצעה שנצפתה לנתונים מלאכותיים המבוססים על 5,7 מודל תנועה הבראונית סטוכסטיים. גם נתוני סימולציה יכולים לשמש כדי לבדוק את נהלי ניתוח נתונים. יישומים אפשריים של שיטה זו: אנחנו תיארתי גישה כללית המאפשר הדמיה וכימות אינטראקציות-DNA חלבון in vivo על ידי השינוי בניידות של חלבון על כריכה לכרומוזום. הפעילויות של ה-DNA אומחייב חלבוני RNA המעורבים בתיקון, שכפול, שעתוק, ותחזוקת כרומוזום לכן יכולים להיות מיושמים בזמן אמת ברמת התא הבודד עם רזולוציה מרחבית מתחת לגבול ההשתברות האופטית. מעקב מולקולה בודדת photoactivated מרחיב שיטות מעקב קונבנציונליות, כי הם מוגבלים לכמה מולקולות שכותרת לכל תא. שיטה חלופית המודדת דיפוזיה מולקולרית in vivo היא שחזור הקרינה לאחר Photobleaching (FRAP). בעוד FRAP הוא שימושי מאוד למדידת מאפייני הדיפוזיה העולמית בתאים גדולים, הוא מוגבל ביכולתה כדי לפתור כמה מינים מולקולריים עם mobilities שונה בסביבה מרחבית הטרוגנית, במיוחד לתאי חיידקים קטנים. יש לנו ליישם מולקולה בודדת photoactivated מעקב כדי למדוד את פעילות ה-DNA מחייבת ומגוירים subcellular של מגוון רחב של חלבונים שונים בE. coli כולל Pol1, האנזים DNA, חלבון ה-FIS, ה-DNAפולימראז III 7, כמו גם תחזוקה המבנית של חלבוני כרומוזומים MukB, E, ו-F 19. אנו צופים את השיטה גם יכולה להיות מותאמת לסוגי תאים אחרים.

פרוטוקול זה מתאר מדידה הישירה של אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חי Escherichia coli. הטכניקה מנצלת את השינוי במקדם הדיפוזיה של חלבון יחיד שכותרתו fluorescently כפי שהוא קושר את כרומוזום (איור 1). כדי להדגים את השיטה שאנו משתמשים DNA פולימרז (Pol1), חלבון קושר DNA טיפוסי שממלא את פערי דנ&quot;א בשכפול גדיל מפגר ומסלולי תיקון כריתת 1. כניסתו של מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה סופר מאפשרת הדמיה של מבנים מולקולריים בתאים עם רזולוציה ננומטר. Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית (PALM) מעסיק חלבוני ניאון שיכול להיות מופעל ממדינה חשוכה ראשונית למצב ניאון (איור 2). רק קבוצת משנה של כל המולקולות שכותרתו מופעלת בכל עת כדי לקבוע את עמדותיהם באופן רציף, באופן בלתי תלוי tהוא בסך הכל ריכוז של מולקולות שכותרתו במדגם 2. דיוק הלוקליזציה לכל מולקולה בעיקר תלוי בגודל של פונקצית התפשטות נקודת הניאון (כוחות הביטחון הפלסטיניים), מספר הפוטונים שנאספו, ואות רקע 3. יישומים של שיטה זו רבים להתמקד בויזואליזציה המשופרת של מבנים הסלולר. ההבנה שניתן לשלב PALM עם מולקולה בודדת מעקב 4 נפתחו אפיקים חדשים לעקוב באופן ישיר את התנועה של מספרים שרירותיים של חלבונים שכותרתו בתאים חיים. רגישות מוגברת והחלטה זמנית של מיקרוסקופים הקרינה מאפשרים כעת מעקב של חלבוני ניאון לשדר אחת בציטופלסמה חיידקי 5. כאן, אנחנו מעסיקים PAmCherry, חלבון פלואורסצנטי מהונדס שאופן בלתי הפיך ממיר ממדינת nonfluorescent ראשונית למצב ניאון על הקרנה עם 405 ננומטר אור 6. fluorophores PAmCherry הופעל יכול להיות תמונהד על ידי עירור ב 561 ננומטר ולעקוב אחריו במשך כמה מסגרות עד photobleaching. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה לזיהוי אירועים-DNA מחייבת חולפים של חלבונים בודדים באמצעות שילוב של Pol1 וPAmCherry. טיפול בתאים עם methanesulfonate מתיל (MMS) גורם נזק מתילציה דנ&quot;א שהפך למצעי DNA ומרווחים על ידי אנזימים לתיקון בסיס כריתה. השיטה שלנו מראה ברורה מחייבת של מולקולות Pol1 אחת בתגובה לנזק MMS 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1444">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:477px;"></td>
			<td style="width:467px;">created by Lambda-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM vitamins</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11120-052</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>certified molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>BB024060SC</td>
			<td style="width:467px;">remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl methanesulfonate (MMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129925</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PALM setup</td>
			<td>home-built</td>
			<td></td>
			<td>described in Uphoff et al. 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>for data analysis and visualization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Localization software</td>
			<td style="width:187px;">custom-written, available online</td>
			<td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td>
			<td style="width:467px;">MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tracking software</td>
			<td>available online</td>
			<td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td>
			<td style="width:467px;">MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &#38; Grier 1996 if used in publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

אינטראקציות החלבון-DNA הן בלב של תהליכים תאיים רבים יסודיים. לדוגמא, שכפול הדנ&quot;א, השעתוק, ותיקון, והארגון של כרומוזום נשלטים על ידי חלבוני קושרי DNA שמזהים מבני DNA ספציפיים או רצפים. בניסויים במבחנה סייעו לייצר מודלים מפורטים עבור הפונקציה של סוגים רבים של חלבוני ה-DNA מחייבת, ובכל זאת , המנגנונים של תהליכים אלה והארגון שלהם בסביבה המורכבת של התא החי המדויקים יישארו הרבה פחות מובן. לאחרונה הציגו שיטה לכימות פעילות ה-DNA-תיקון בתאי חיידקי Escherichia חיים באמצעות photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת. הגישה הכללית שלנו מזהה אירועים-DNA מחייבת פרט על ידי השינוי בניידות של חלבון יחיד על קשר עם כרומוזום. את החלק היחסי של מולקולות מאוגדים מספק מדד כמוני ישיר לפעולת החלבוןivity ושפע של מצעים או אתרי קישור ברמת התא הבודד. כאן, אנו מתארים את הרעיון של השיטה ונדגים הכנת מדגם, רכישת נתונים, ונהלי ניתוח נתונים.

הרעיון של מולקולה בודדת photoactivated מעקב כדי לחקור אינטראקציות-DNA חלבון in vivo מודגם באיור 1. חלבוני היתוך PAmCherry מזוהים בE. החי coli תאים באופן רציף על ידי photoactivating מולקולות בודדות stochastically עם ננומטר אור 405 בתדר של מולקולה פחות מאחוז אחד לכל תא בכל פעם. מולקולות הופעל הם צילמו תחת עירור ננומטר הרציף 561. תנועה מולקולרית בתא יכולה להיות במעקב על ידי חיבור מגויר סמוך בסדרה של מסגרות עד photobleaching בלתי הפיך. בגלל דיפוזיה של חלבוני ה-DNA מחייבת מואטת על כריכת כרומוזום, מקדם הדיפוזיה לכאורה D * המתקבל למסלול ישירות מדווח על אינטראקציות החלבון-DNA בודדים. איור 2 מדגים photoactivation של חלבוני היתוך Pol1-PAmCherry בא &#39;בשידור חי תאי coli. השפעת עוצמת 405 ננומטר on הצפיפות של מולקולות ניאון שניתן לראות באיור 4. שים לב שהצפיפות אינה נקבעה אך ורק על ידי עוצמת 405 ננומטר אלא גם במספר המולקולות שאינן זמינים עבור הפעלה; הבריכה של מולקולות הנותרות יאזל במהלך סרט PALM. ניתוח לוקליזציה מתבצע לכל מסגרת של סרט PALM כפי שמודגם באיור 5. מדדנו את רמת דיוק הלוקליזציה באמצעות מולקולות נייחות בתאים קבועים או מולקולות מאוגדות בתאים חיים. הגדרות הרכישה שלנו נתנו דיוק לוקליזציה של loc = 40 ננומטר σ, בהסכם עם התחזית התיאורטית 3. מגוירי Pol1 וכתוצאה מכך לכבוש את האזור המרכזי של התא (איור 6 א), באופן רחב משחזר ארגון המרחבי של א &#39; coli nucleoid 7. רוב Pol1 עוקב בתאי ניזוק להציג difהיתוך כפי שמוצג באיור 6 ג. תא טיפוסי מכיל כמה מאה מסלולים Pol1 (איור 6 ד &#39;), עולים בקנה אחד עם מספר העותק של כ 400 מולקולות Pol1 לE. . תא coli 1 נתוני 6B ו6E-F לספק הדרכה בבחירת חלון מעקב פרמטר מתאים - אם חלון המעקב הוא גדול מדי, מולקולות שונות נוטה יותר להיות בטעות קשורה למסלול, אם חלון המעקב הוא קטן מדי, מסלולים בצעדים ארוכים יותר יהיה מפוצל. עקומת MSD לPol1 עולה באופן ליניארי לפעמים בפיגור קצר ומרווה בזמנים השהיה ארוכות יותר בשל תא כליאה (איור 6G). סוגים שונים של תנועה מולקולרית יכולים להיות מזוהים על ידי ניתוח MSD. תנועת בימוי נותנת עקומת parabolic; תנועה הבראונית מאופיינת בקו ישר; עקומת הדיפוזיה מוגבלת מגיעה לרמה; קיזוז של עקומת MSD עבור חלקיקים נייחים מייצגת את lחוסר ודאות ocalization (איור 6 שעות). ניתן למצוא מידע נוסף על טיפים למעקב ופתרון בעיות חלקיק יחיד בArnauld et al. 16 אנחנו מוחלים בעבר את השיטה כדי למדוד את פעילות ה-DNA-תיקון Pol1 בתגובה לנזקי DNA אקסוגני אלקילציה 7. D היסטוגרמה * של Pol1 עוקבת בתאי ניזוק מראה אוכלוסייה דומיננטית של לשדר מולקולות (איורים 7 א-C). חלק קטן של מולקולות Pol1 כפותות .2.7% הוא סביר מעורב בשכפול גדיל מפגר ותיקון של נזק לדנ&quot;א אנדוגני. תחת נזק מ&quot;מ MMS רציף 100, האוכלוסייה של מסלולים עם D * ~ 0 מיקרומטר עליות 2 / sec ל13.8% (איור 7D). מסלולים אלה מייצגים מולקולות Pol1 בודדות ביצוע סינתזת תיקון דנ&quot;א כדי למלא פערי נוקלאוטיד יחיד כחלק ממסלול תיקון בסיס כריתה. עמדותיהם של מסלולים כרוכים מראות את מיקומם של הפרטנזק לדנ&quot;א ותיקון אתרים (איור 7E-F). <img alt="איור 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> איור 1. ייצוג גרפי של השיטה. () PAmCherry החלבון פלואורסצנטי ניתן photoactivated ממדינת nonfluorescent ראשוני על הקרנה עם 405 ננומטר אור. המדינה בהירה היא נרגשת ב561 ננומטר ופולטת הקרינה סביב 600 ננומטר עד מלביני fluorophore באופן בלתי הפיך. (ב) שליטה על שיעור photoactivation מאפשרת הדמיה רק חלבון יחיד הופעל stochastically היתוך PAmCherry לכל תא בכל עת תוך הבריכה הגדולה באופן שרירותי של מולקולות שעדיין לא הופעלו או כבר מולבנת נותר במצב חשוך. (ג) עמדתה של מולקולת הניאון נקבעה ממרכז כוחות הביטחון הפלסטיניים וTR המבודדיםacked במשך כמה מסגרות עד photobleaching. מסלולים (ד &#39;) של מולקולות רבות נרשמים באופן רציף. (EF) האינטראקציה של חלבון קושר DNA עם רצף יעד כרומוזומליות או מבנה עוצרת את תנועת diffusive האקראית. מולקולות מאוגדים ולא מאוגדים נבדלות במקדם דיפוזיה לכאורה D * חולץ משירים בודדים. את החלק יחסי של מולקולות מאוגדים וכתוצאה מכך נותן מדד כמוני לפעילות של חלבון ה-DNA מחייבת in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2. Photoactivation של Pol1-PAmCherry בא &#39;בשידור חי תאי coli. ברים סולם: 1 מיקרומטר. שרטוטים מוצגים מתחת לכל פנל. (<html> א) מועבר בתמונת מיקרוסקופ אור של תאים משותקים על כרית agarose. (ב) Phototactivating fluorophore PAmCherry אחת בתא אחד. (ג) שיעור photoactivation גבוה יותר מגדיל את מספר מולקולות ניאון. הקרינה המשולבת PAmCherry מסרט PALM (ד &#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> איור 3. תרשים סכמטי של הרשת PALM מינימאלית לחלבוני photoactivating והיתוך PAmCherry ההדמיה D1:. מראה Dichroic (למשל 550 ארוך לעבור ננומטר). D2: מראה Dichroic (למשל 570 ארוך לעבור ננומטר). L1: עדשת collimating. L2: עדשת TIR. L3: עדשת צינור.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. נציג תמונות מסרט PALM עם 15.26 msec / מסגרת סולם ברים:. 1 מיקרומטר. (א) המועברים בתמונת אור של תאים משותקים על כרית agarose. (ב) תמונת רקע כהה שנמדדה על המצלמה EMCCD עם הלייזרים כבויה. תמונה (C) עירור רקע תחת עירור 561 ננומטר רציף לפני photoactivation. עוצמת ננומטר (DF) מוגבר 405 מובילה לשיעורים גבוהים יותר של photoactivation PAmCherry, צילמו תחת עירור ננומטר הרציף 561. האזורים התאגרפו מוצגים מוגדל להלן. (ד &#39;) בעצימות נמוכה ננומטר 405 פעילים (&lt;μW 1) מעט מאוד מולקולות ניאון לFOV. (ה) בינונית 405תוצאות photoactivation עוצמת ננומטר (~ 2 μW) בצפיפות כוחות הביטחון הפלסטיניים טובה ללוקליזציה ומעקב וניתוח. העצמה גבוהה 405 ננומטר (~ 10 μW) (F) מפעיל מולקולה יותר מאחד ניאון בחלק מהתאים, אשר מטשטשת לוקליזציה ומעקב וניתוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. איור של ניתוח הלוקליזציה. ברים סולם: 1 מיקרומטר () סינון הלהקה עובר מסיר רעש פיקסל מזויף ומשטח הדרגתיים בעוצמה על פני שדה הראייה.. (ב) PSFs מועמד מזוהה בתמונה המסוננת בהתבסס על סף המוגדרים על ידי משתמש, כי הוא נבחר כדי למזער לתגליות שליליות חיוביות ושקר שקר. Threshold תואם את עוצמת המינימום של פיקסל מועמד מחולקת בסטיית תקן הרקע (יחס אות לרעש, יחס אות לרעש). פיקסל המקומי הבהיר שעובר את הסף משמש כניחוש ראשוני לוקליזציה (צלב כתום) לשני ממדים בכושר גאוס סגלגל (C). סולם ברים: 0.5 מיקרומטר. לוקליזציה וכתוצאה מכך הרזולוציה סופר (צלב כחול) יש דיוק ממוצע של loc σ = 40 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. איור 6 איור של ניתוח מעקב סולם ברים: 1 מיקרומטר. (א) כל הגרסות המגוירות המזוהה של Pol1-PAmCherry בתא ירושלים. (ב) מספר המסלולים לזהותאד בתא, למשל כפונקציה של חלון המעקב. חלונות מעקב קטנים לפצל מסלולי מולקולה, מה שמוביל לartifactual מספר גבוה של מסלולים. הקו המקווקו מציין הבחירה שלנו לפרמטר חלון מעקב (0.57 מיקרומטר, 5 פיקסלים) - זה נותן פשרה טובה בין איתור ההתפלגות המלאה של צעדים ושמירה על המסלולים של מולקולות שונות בשלמותה. (ג) אחר דוגמא של מולקולת Pol1-PAmCherry אחת. (ד) כל המסלולים נמדדו מוצגים בצבעים אקראיים. ממצאי מעקב (ה) אם חלון המעקב נבחר גדול מדי (כאן 0.8 מיקרומטר, 7 פיקסלים) או הצפיפות של PSFs לכל מסגרת היא גבוהים מדי. (F) התפלגויות מצטברת של אורכי צעד לחלונות מעקב: 0.34 מיקרומטר (3 פיקסלים, קו אדום), 0.57 מיקרומטר (5 פיקסלים, קו כחול), ו0.80 מיקרומטר (7 פיקסלים, קו ירוק). שימו לב ש0.34 מיקרומטר חלון המעקב חותך את צעדים ארוכים יותר מ0.34 מיקרומטר אשר באופן ברורחותך את ההתפלגות המלאה של צעדים. חלון המעקב 0.57 מיקרומטר מזהה כמעט אותה ההתפלגות של צעדים כפי שעושה 0.80 מיקרומטר חלון המעקב. עקומה (G) MSD מציגה דיפוזיה מוגבלת של Pol1. עקומות (H) סכמטי MSD לתנועה מכוונת, תנועה בראונית, דיפוזיה מוגבלת, וחלקיקים נייחים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. מדידה ישירה של פעילות תיקון DNA של Pol1 בא &#39;בשידור חי . Coli תאי סולם ברים: 1 מיקרומטר. (א) היסטוגרמה של * D מקדם הדיפוזיה לכאורה לכל המסלולים של 4 או יותר שלבים בFOV של תאים שלא נפגעו (N = 4,162 שירים). האוכלוסייה של מולקולות מסווגות כb<html> ound מסומן באדום. מסלולים (BC) של Pol1-PAmCherry מוצגים בתמונה מיקרוסקופית אור מועבר. מסלולים מסווגים כמחויב על פי מקדם הדיפוזיה שלהם מוצגים באדום. (ד) D * היסטוגרמה למסלולי Pol1 נמדדו בתאים משותקים על כרית agarose עם 100 מ&quot;מ MMS וטופחו במשך 20 דקות לפני ההדמיה (N = 2,128 שירים). האוכלוסייה של מולקולות מאוגדים העוסקות בתיקון DNA מוצגת באדום. (EF) Pol1-PAmCherry עוקב על תמונה במיקרוסקופ אור מועברת מראה את המסלולים של אירועי תיקון DNA Pol1 אחת באדום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="וידאו 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> סרט 1. בניית התקנת PALM העידו.&quot;Target =&quot; _blank JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בוידאו.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...