Name: visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking
Uploaded: 2014-03-10T20:30:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

हम स्थानीयकरण सॉफ्टवेयर के लिए कहे गए माइक्रोस्कोप और सीमस होल्डन के निर्माण के साथ मदद के लिए जस्टिन Pinkney और जोहानिस Hohlbein को स्वीकार करते हैं. रॉड्रिगो रेयेस-Lamothe ई. प्रदान करने के लिए आभार व्यक्त किया जाता है कोलाई तनाव. अनुसंधान यूरोपीय आयोग के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम अनुदान FP7/2007-2013 स्वास्थ्य F4-2008-201418, ब्रिटेन जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद अनुदान BB/H01795X/1, और ANK के लिए यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान 261227 द्वारा वित्त पोषित किया गया. डीजे एक वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम अनुदान WT083469 द्वारा वित्त पोषित किया गया. र एक MathWorks डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

<ol>
	<li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy.">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy.">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li><li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li><li>Wieser, S., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do's+and+Don't's.">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li><li>Arnauld, S., Nicolas, B., Herv&#233;, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li><li>Elmore, S., M&#252;ller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli.">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li><li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins.">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li></ol>

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

हम प्रयोग की सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण विचार पर चर्चा की. चुनाव और फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति: photoactivatable और photoswitchable फ्लोरोसेंट प्रोटीन 17 की एक बड़ी पैलेट है. विशिष्ट विकल्प माइक्रोस्कोप विशेषताओं, उपलब्ध विशेष रूप से लेज़रों और फिल्टर पर निर्भर करता है. 405 एनएम और 561 एनएम का संयोजन आम photoactivatable फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए आदर्श है. हम यह मोनोमेरिक है क्योंकि PAmCherry 6 चुना है और कोशिकाओं में कोई एकत्रीकरण दिखाया. इसके अलावा, अपरिवर्तनीय photoactivation सेल प्रति प्रोटीन प्रतिलिपि संख्या को मापने के लिए सक्रिय fluorophores की संख्या की गणना की अनुमति देता है. इसके बजाय एक प्लाज्मिड से संलयन प्रोटीन व्यक्त की, हम जंगली प्रकार ठिकाना पर संलयन प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग के गुणसूत्र सम्मिलन पसंद करते हैं. इस फ्लोरोसेंट ve के साथ ब्याज की प्रोटीन की पूरी प्रतिस्थापन सुनिश्चित करता हैrsion और जंगली प्रकार अभिव्यक्ति के स्तर को बनाए रखने. Photoactivation दर: यह औसत पर सेल प्रति कम से कम एक अणु फिल्म के किसी भी फ्रेम में फ्लोरोसेंट राज्य में है कि इस तरह के photoactivation दर को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह 405 एनएम तीव्रता पर निर्भर करता है और अणुओं की संख्या को सक्रिय करने के लिए छोड़ दिया. बहुत कम इमेजिंग घनत्व में, हालांकि, नहीं सभी अणुओं फिल्म के अंत से पहले imaged किया जाएगा या बहुत लंबे फिल्मों का अधिग्रहण किया जाना है. फिल्म के प्रति दर्ज की फ्रेम की संख्या संलयन सेल प्रति प्रोटीन और इस्तेमाल उत्तेजना की स्थिति में PAmCherry का मतलब photobleaching जीवनकाल की प्रतिलिपि संख्या पर निर्भर करता है. Pol1 की प्रतिलिपि संख्या ~ है 400 अणुओं / सेल 1 और घातीय photobleaching जीवनकाल वितरण का मतलब मूल्य ~ 4 फ्रेम था. धीरे - धीरे 405 एनएम तीव्रता में वृद्धि करके, सक्रियण समान रूप से फिल्म के 10,000 तख्ते पर वितरित किया जाता है. इसलिए, प्रत्येक कोशिका occup हैPSFs और 10,000 फ्रेम की एक फिल्म में नज़र रखने की जटिलताओं के कम ओवरलैप सुनिश्चित करने, ~ 1600 तख्ते की कुल के लिए फ्लोरोसेंट अणु द्वारा आइईडी. एक्सपोजर समय और उत्तेजना तीव्रता: अग्रणी, जोखिम बार थोड़ा गति धुंधला साथ तेज PSFs निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त रूप से कम करने की आवश्यकता है. हालांकि, फ्रेम दर स्थानीयकरण अनिश्चितता परे लगातार फ्रेम के बीच नमूदार आणविक गति उपज के लिए चुना जाना चाहिए, अन्यथा महत्वपूर्ण फोटॉनों ट्रैक oversampling द्वारा बर्बाद कर रहे हैं. अनबाउंड अणुओं की गति स्थानीयकरण अनिश्चितता की वजह से बंधे हुए अणुओं के स्पष्ट प्रस्ताव से स्पष्ट रूप से अलग होने के लिए पर्याप्त रूप से लंबे समय के अंतराल पर जांचा जाना चाहिए. जोखिम समय सेट किया जाता है, पीएसएफ तीव्रता समायोजित किया जाना चाहिए. एक पीएसएफ का स्थानीयकरण सटीक एक फ्रेम की अवधि के दौरान पता चला फोटॉनों की संख्या के साथ बढ़ जाती है. हायर उत्तेजना तीव्रता फोटान उत्सर्जन दर बू वृद्धिटी भी photobleaching दर और पृष्ठभूमि संकेत. वांछित स्थानीयकरण सटीक देता है कि सबसे कम उत्तेजना तीव्रता का प्रयोग करें. Pol1-PAmCherry के लिए हम 15.26 मिसे / फ्रेम और 3.5 मेगावाट 561 एनएम उत्तेजना (400 डब्ल्यू / 2 सेमी) चुना. यह (Uphoff एट अल. 7 में पूरक जानकारी देखें) डाटा अधिग्रहण से पहले और बाद सेल के विकास और आकृति विज्ञान की निगरानी के द्वारा विशेष इमेजिंग स्थितियों के लिए सेल व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है. Pol1 विवो 7 में एक दरारयुक्त डीएनए सब्सट्रेट करने के लिए ~ 2 सेकंड के लिए एक बाध्यकारी समय को दर्शाती है, इसलिए हम अणुओं के बहुमत एक ट्रैक की पूरी अवधि के लिए बाउंड या अनबाउंड राज्य में या तो होने की उम्मीद है. गुणसूत्र साइटों कोशिका द्रव्य में Pol1 प्रसार (~ 1 माइक्रोन 2 की तुलना में एक प्रसार गुणांक परिमाण कम के कई आदेशों (~ 10 -5 माइक्रोन 2 / सेक, Elmore एट अल. 18) है क्योंकि बाध्य अणुओं अनिवार्य रूप से स्थिर दिखाई देते हैं </sऊपर&gt; / सेक). प्रसार विश्लेषण: स्पष्ट प्रसार गुणांक डी * व्यक्तिगत पटरियों के एमएसडी से गणना की है, सांख्यिकीय त्रुटि को कम करने के लिए 4 कदम (5 फ्रेम) की एक न्यूनतम से अधिक औसत. उस ~ अणुओं की 75% वर्णित इमेजिंग स्थितियों के लिए कम से कम 5 फ्रेम के भीतर ब्लीच नोट. इतने कम पटरियों बाध्य और अपार अणुओं भेद करने के लिए पर्याप्त सांख्यिकीय निश्चितता प्रदान नहीं करते हैं. हालांकि, प्रोटीन गतिविधि पर रिपोर्ट है कि बाध्य और अपार अणुओं के रिश्तेदार अंशों का विश्लेषण पटरियों की कुल संख्या की स्वतंत्र हैं. अनिश्चितता एक अणु 15 में से प्रत्येक के स्थानीयकरण के लिए एक स्पष्ट यादृच्छिक कदम कहते हैं, क्योंकि यह डी * की गणना में पीएसएफ स्थानीयकरण त्रुटि (σ एलओसी) के लिए खाते में करने के लिए उपयोगी है. बाध्य और diffusing के अणुओं के वर्गीकरण में सुधार, हम डी * बॉट की गणना करने की अनुशंसादो फ्रेम के समय के साथ एकल कदम विस्थापन व विस्थापन से घंटे. यह दो अलग डी * सीमा को सेट करने के लिए तो संभव है: डी * (15 मिसे) &lt;0.15 माइक्रोन 2 / सेकंड और डी * (30 मिसे) &lt;0.075 माइक्रोन 2 / सेक. डी * जोखिम समय के दौरान की वजह से प्रसार को धुंधला पटरियों और गति की सेल कारावास से प्रभावित है कि एक स्पष्ट प्रसार गुणांक है कि ध्यान दें. सही निष्पक्ष प्रसार गुणांक निकालने के लिए, यह एक stochastic ब्राउनियन गति मॉडल 5,7 के आधार पर नकली डेटा को मनाया प्रस्ताव तुलना करने के लिए उपयोगी साबित हो गया है. नकली डेटा भी डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि के संभावित अनुप्रयोगों: हम गुणसूत्र के लिए बाध्य करने पर एक प्रोटीन की गतिशीलता में बदलाव से इन विवो में प्रोटीन डीएनए बातचीत visualizing और बढ़ाता के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण का वर्णन किया. डीएनए या की गतिविधियोंमरम्मत में शामिल शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, प्रतिकृति, प्रतिलेखन, और गुणसूत्र रखरखाव इस प्रकार ऑप्टिकल विवर्तन सीमा से नीचे एक स्थानिक संकल्प के साथ एकल कोशिका स्तर पर वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता. Photoactivated एकल अणु ट्रैकिंग सेल प्रति कुछ लेबल अणुओं के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं कि पारंपरिक ट्रैकिंग तरीकों फैली हुई है. Vivo में आणविक प्रसार उपाय है कि एक वैकल्पिक तरीका photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली है. FRAP बड़े कोशिकाओं में वैश्विक प्रसार विशेषताओं को मापने के लिए बहुत उपयोगी है, यह विशेष रूप से छोटे जीवाणु कोशिकाओं के लिए, एक spatially विषम वातावरण में विभिन्न mobilities साथ कई आणविक प्रजातियों को हल करने की क्षमता में सीमित है. हम डीएनए बाध्यकारी गतिविधियों और ई. में विभिन्न प्रोटीन की एक श्रृंखला के subcellular localizations को मापने के लिए ट्रैकिंग photoactivated एकल अणु आवेदन किया है कोली Pol1, डीएनए ligase, वित्तीय संस्थाओं प्रोटीन, डीएनए सहितपोलीमर्स तृतीय 7, साथ ही गुणसूत्रों प्रोटीन MukB, ई, एफ और 19 की स्ट्रक्चरल रखरखाव. हम विधि भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता आशा.

इस प्रोटोकॉल कोलाई जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत का सीधा माप का वर्णन करता है. यह गुणसूत्र (चित्रा 1) बांधता रूप में तकनीक एक एकल fluorescently लेबल प्रोटीन का प्रसार गुणांक में परिवर्तन का इस्तेमाल करता. हम डीएनए पोलीमरेज़ ठंड कतरा प्रतिकृति और छांटना मरम्मत रास्ते 1 में डीएनए अंतराल भरता है कि मैं (Pol1), एक प्रोटोटाइप डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग विधि का प्रदर्शन. सुपर संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के आगमन के संकल्प के साथ नैनोमीटर कोशिकाओं में आणविक संरचना के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) एक फ्लोरोसेंट राज्य (चित्रा 2) के लिए एक प्रारंभिक अंधेरे राज्य से सक्रिय किया जा सकता है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन कार्यरत हैं. केवल सभी लेबल अणुओं का एक सबसेट स्वतंत्र रूप से टी के एक अनुक्रमिक तरीके से अपनी स्थिति को निर्धारित करने के लिए किसी भी समय सक्रिय होता हैवह नमूना 2 में लेबल अणुओं की एकाग्रता कुल. अणु प्रति स्थानीयकरण परिशुद्धता मुख्य रूप से फ्लोरोसेंट बात फैल समारोह (पीएसएफ) के आकार पर निर्भर करता है, एकत्र फोटॉनों की संख्या, और पृष्ठभूमि संकेत 3. इस विधि से कई अनुप्रयोगों सेलुलर संरचनाओं के बेहतर दृश्य पर ध्यान केंद्रित. ट्रैकिंग पाम एकल अणु के साथ जोड़ा जा सकता है कि वसूली के 4 सीधे जीवित कोशिकाओं में लेबल प्रोटीन का मनमाना संख्या के आंदोलन का पालन करने के लिए नए रास्ते खोल दिया. वृद्धि की संवेदनशीलता और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का अस्थायी समाधान अब बैक्टीरियल कोशिका द्रव्य 5 में एकल diffusing फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ट्रैकिंग की अनुमति. यहाँ, हम PAmCherry, अचल 405 एनएम प्रकाश 6 के साथ विकिरण पर एक फ्लोरोसेंट राज्य के लिए एक प्रारंभिक nonfluorescent राज्य से धर्मान्तरित कि एक इंजीनियर फ्लोरोसेंट प्रोटीन को काम पर. सक्रिय PAmCherry fluorophores छवि हो सकता है561 एनएम पर उत्तेजना और photobleaching तक कई फ्रेम के लिए ट्रैक द्वारा डी. हम Pol1 और PAmCherry की एक संलयन का उपयोग कर एक प्रोटीन की क्षणिक डीएनए बाध्यकारी घटनाओं की पहचान करने के लिए विधि की क्षमता प्रदर्शित करता है. मिथाइल methanesulfonate (एमएमएस) के साथ कोशिकाओं के इलाज के आधार छांटना मरम्मत एंजाइमों से gapped डीएनए substrates में बदल गया है कि डीएनए मेथिलिकरण क्षति का कारण बनता है. हमारे विधि एमएमएस क्षति 7 के जवाब में एकल Pol1 अणुओं के बंधन स्पष्ट पता चलता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1444">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:477px;"></td>
			<td style="width:467px;">created by Lambda-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM vitamins</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11120-052</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>certified molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>BB024060SC</td>
			<td style="width:467px;">remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl methanesulfonate (MMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129925</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PALM setup</td>
			<td>home-built</td>
			<td></td>
			<td>described in Uphoff et al. 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>for data analysis and visualization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Localization software</td>
			<td style="width:187px;">custom-written, available online</td>
			<td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td>
			<td style="width:467px;">MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tracking software</td>
			<td>available online</td>
			<td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td>
			<td style="width:467px;">MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &#38; Grier 1996 if used in publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

प्रोटीन डीएनए बातचीत कई मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं के दिल में हैं. उदाहरण के लिए, डीएनए प्रतिकृति, प्रतिलेखन, मरम्मत, और गुणसूत्र संगठन इन विट्रो प्रयोगों डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के कई प्रकार के समारोह के लिए विस्तृत मॉडल उत्पन्न करने के लिए मदद की है. विशिष्ट डीएनए संरचना या दृश्यों को पहचान कि डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा शासित है, अभी तक कर रहे हैं , जीवित कोशिका की जटिल वातावरण में इन प्रक्रियाओं और उनके संगठन की सटीक तंत्र अब तक कम समझा रहते हैं. हमने हाल ही में Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी एकल अणु ट्रैकिंग के साथ संयुक्त (पाम) का उपयोग कर जीना Escherichia कोलाई कोशिकाओं में डीएनए की मरम्मत की गतिविधियों बढ़ाता के लिए एक विधि की शुरुआत की. हमारी सामान्य दृष्टिकोण गुणसूत्र के सहयोग पर एक प्रोटीन की गतिशीलता में बदलाव से व्यक्तिगत डीएनए बाध्यकारी घटनाओं को पहचानती है. बाध्य अणुओं के अंश प्रोटीन कार्य के लिए एक प्रत्यक्ष मात्रात्मक उपाय प्रदान करता हैएकल कोशिका स्तर पर ivity और substrates या बाध्यकारी साइटों की बहुतायत. यहाँ, हम विधि की अवधारणा का वर्णन है और नमूना तैयार करने, डाटा अधिग्रहण, और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Photoactivated एकल अणु ट्रैकिंग का प्रयोग लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत Visualizing

एकल अणु ट्रैकिंग के साथ संयुक्त Photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) की अनुमति देता है जीना Escherichia कोलाई कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत का प्रत्यक्ष अवलोकन और मात्रा का ठहराव.

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualizing एचआईवी के स्थानांतरण सेल के लिए सेल एचआईवी और लाइव confocal माइक्रोस्कोपी के प्रतिदीप्त क्लोन का उपयोग

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomatal रिस्पांस मूल्यांकन लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं पूरी पत्ती इमेजिंग का उपयोग

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

एलेक्सा Fluor लेबल के माध्यम से डेंगू वायरस Visualizing

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

बैक्टीरियल विष प्रेरित लाइव सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रतिक्रियाएँ की विज़ुअलाइज़ेशन

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन का उपयोग कर संक्रमित चूहों में संस्कृति और हृदय उपनिवेशीकरण में हृदय कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण का आकलन

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

जनरेशन और मल्टी-प्ररूपी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon म्यूटेंट

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

एक filamentous फफूंद कालोनियों पर बैक्टीरियल biofilms के गुणात्मक बहु पैमाने विश्लेषण के लिए नई विधि का उपयोग Confocal और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilm विकास पर थूक के प्रभाव Visualizing एक संभाग coverglass मॉडल का उपयोग

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

बेहद मल्टीप्लेक्जड, सुपरस्टोयलिंग इमेजिंग टी सेल

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...