Name: visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking
Uploaded: 2014-03-10T20:30:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

Vi erkjenner Justin Pinkney og Johannes hohlbein for hjelp med byggingen av den spesialdesignede mikroskop og Seamus Holden for lokalisering programvare. Rodrigo Reyes-Lamothe takkes for å gi E. coli-stamme. Forskningen ble finansiert av EU-kommisjonen sjuende rammeprogram Grant FP7/2007-2013 HELSE-F4-2008-201418, UK Bioteknologi og Biological Sciences Research Council Grant BB/H01795X/1, og European Research Council Grant 261227 til ANK. DJS ble finansiert av en Wellcome Trust Program Grant WT083469. SU ble støttet av en MathWorks doc.

En. Cell Culture Bruk sterile kultur rør og pipetter. Den E. coli stamme AB1157 pola-PAmCherry bærer en C-terminal PAmCherry fusjon av Pol1. Denne blanding ble satt inn i det native kromosomal beliggenhet ved å erstatte villtype-genet ved bruk av lambda-Red rekombinasjon som beskrevet i Datsenko et al. 8. Funksjonen til fusjonsproteinet ble bekreftet som bedømt av cellulære vekstrater og sensitivitet overfor DNA-ødeleggende middel methyl methanesulfonate (MMS). Mer informasjon om konstruksjonen av cellestamme kan finnes i Uphoff et al. 7, Datsenko et al. 8, og Reyes-Lamothe et al. 9 Cellekulturer dyrkes i M9 minimal medium for å redusere autofluorescence og unngå bakgrunnspartikler på objektglass. Alternativt kan en næringsrik definert medium brukes 10. <ol><li> Streak E. coli stamme Ab1157. pola-PAmCherry fra en frossen glycerol lager på et Luria Broth (LB) agarose-plate med selektive antibiotika (her, 25 ug / ml kanamycin) og inkuberes ved 37 ° C over natten. </li><li> Inokuler en 5 ml LB-kultur fra en enkelt celle koloni og vokser ved 37 ° C risting ved 220 rpm i 3 timer. </li><li> Fortynn kulturen 1:10,000 i 5 ml minimalmedium (M9 medium, MEM aminosyrer + prolin, MEM vitaminer, 0,2% glyserol) og inkuberes ved 37 ° C risting ved 220 rpm over natten. </li><li> Den følgende morgen, måle den optiske tetthet (OD) ved hjelp av et spektrofotometer, og fortynne kulturen i 5 ml friskt minimal medium til OD 0.025. Dyrk i 2 timer ved 37 ° C risting ved 220 rpm til tidlig eksponensiell fase (OD 0,1). </li><li> Konsentrer 1 ml celler i et 1,5 ml mikrosentrifugerør ved sentrifugering ved 2300 xg i 5 min. Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 20 ul gjenværende medium og virvle. </li></ol> 2. Objektglass forberedelse;ion <ol><li> Forbered en 1,5% lav-fluorescens agarose løsning i dH 2 O. Bruk en mikrobølgeovn for å smelte agarose inntil oppløsningen er klar. Bland 500 ul av den smeltede agarose-løsning med 500 ul av 2x minimal medium ved forsiktig pipettering opp og ned noen ganger. </li><li> Spre agarose løsning jevnt på midten av et mikroskop dekkglass (No 1,5 tykkelse). Dette må gjøres raskt før agarosen kjøler, unngå bobler. </li><li> Flat ut puten med en annen dekkglass (No 1,5 tykkelse). For å fjerne bakgrunns fluorescerende partikler, ble dekkglass som tidligere brent i en ovn ved 500 ° C i 1 time. Brente Dekkglass kan lagres i uker ved romtemperatur dekket med aluminiumsfolie. </li><li> For DNA skade eksperimenter, utarbeide en agarose pad inneholdende 100 MMS. Følg prosedyren i trinn 2.1 til 2.3, men legger til 8,3 mL MMS til 500 mL av M9 medium før blanding med 500 pl av smeltet 1,5% agarose, for en endelig konsentrasjon på 100 mM MMS. (OBS! MMS er giftig og mutagene og må håndteres med hansker, maske, briller og frakk). </li><li> Fjern den øverste lysbilde fra puten og legge en mL konsentrert cellesuspensjon på puten. Immobilisere cellene ved å dekke puten med en ubrukt brent dekkglass (No 1,5 tykkelse, matchende mikroskopet objektiv spesifikasjon) og ved å trykke veldig forsiktig på lysbildet. Cellene skal avbildes innenfor 45 min av immobilisering før de agarose puten tørker. For å hindre uttørking under lengre eksperimenter, kan agarose pads tettes med silikon pakninger. </li><li> For DNA-skade eksperimenter, inkubere cellene immobilisert på agarose pute inneholdende 100 mM MMS i 20 min i en fuktig beholder ved romtemperatur før avbildning. </li></ol> Tre. Forbereder Mikros Data Acquisition PALM avhengig av påvisning og presis lokalisering av enkelt fluorescerende proteiner. Følsomheten og optimal justering avmikroskopet er kritisk for kvaliteten på dataene. Single-molekyl fluorescensmikroskoper vanligvis benytter total intern refleksjon (TIR) ​​lys for å forbedre signal-til-støy-forholdet ved bare å eksitere fluoroforer i en tynn seksjon over dekkflaten. Her, bildebehandling inne E. coli krever sterkt hellende belysning 11, noe som kan oppnås på en TIRF mikroskop ved svakt å redusere vinkelen av eksiteringslys. PAmCherry bildebehandling krever videre en 405 nm fotoaktivering laser og en 561 nm eksitasjon laser. Den fluorescensemisjonen tatt opp på et elektron multiplisere CCD (EMCCD) kamera med en forstørrelse som resulterer i en piksel lengde på 114,5 nm / piksel. For optimal lokalisering presisjon, bør størrelsen pixel tilnærmet stemmer overens med standard avvik bredden av PSF for å sikre tilstrekkelig sampling uten å spre signalet på for mange bildepunkter. Figur 3 viser skjematisk en minimal PALM oppsett. Film 1gir et inntrykk av den skreddersydd mikroskop byggeprosessen, se Uphoff m.fl. 7 for en detaljert beskrivelse av instrumentet.. <ol><li> Utføre rutine mikroskop justering. Mål 405 nm og 561 nm kontinuerlig bølgelaserintensitet i fronten av målet. Juster 561 nm intensiteten til 3,5 mW (~ 400 W / cm 2) og 405 nm intensitet til 10 μW (~ 1 W / cm 2). Bruk en kontinuerlig variabel nøytral tetthet filter hjul som tillater gradvis justering av 405 nm intensitet 0-10 μW. Slå av laserbelysningen til starten av forsøket. </li><li> Plasser prøven på objektbordet og bringe cellene i fokus i gjennomfallende lys mikrosmodus (Fig. 4A). Den EMCCD kamera gevinst må slås av for å forhindre skade på kameraet ved overeksponering. </li><li> Definer en beskjæres FOV å redusere datastørrelsen og øke kameraets skrivehastighet. </li><li> Dekk prøven mot omgivelseslys, og bytlm på EMCCD kamera gevinst. </li><li> Sette bildehastigheten til 15,26 msek / ramme (inkludert 0,26 msek kamera avlesning tid). Se &quot;Eksponerings tid og eksitasjon intensiteter&quot; i diskusjonskapittelet. </li><li> Vise kameradata til å kontrollere den mørke bakgrunnen signal (Figur 4B). </li><li> Slå på 561 nm laser og sjekk eksitasjon bakgrunn signal (Figur 4C). </li><li> Slå på 405 nm laser for fotoaktivering av Pol1-PAmCherry fusjon proteiner og øke intensiteten til fluorescens PSFs vises. </li><li> Justere vinkelen på eksitasjon strålen for å belyse bare en tynn seksjon av prøven nær dekkflaten. <ol><li> For dette formål, blir laserstrålen fokusert inn i det bakre fokalplan en 100X NA 1,4 målet (figur 3). Oversette fokuseringslinsen vinkelrett på strålen beveger seg fokus bort fra sentrum av målet slik at strålen til å gå ut av målet i en vinkel. </li><li> Aim for å maksimere fluorescensintensiteten og minimalisere bakgrunnssignalet. Legg merke til at strenge TIR magnetisering er optimal for bilde fluoroforer innenfor 100 nm av dekkflaten er imidlertid tenkelig DNA-bindende proteiner som er knyttet til E. coli nucleoid krever dypere belysning opp til 0,8 mikrometer. </li></ol></li></ol> 4. Data Acquisition Her beskriver vi den generelle protokoll for anskaffelse av en PALM film. Den samme prosedyren gjelder for bildebehandling Pol1-PAmCherry fusjon proteiner i uskadet E. coli celler og under kontinuerlig DNA skade behandling med MMS. Anvendelse av fremgangsmåten til fusjonsproteiner med forskjellig molekylvekt eller kopitall pr celle vil kreve forskjellige innhentingsinnstillinger (se Diskusjon avsnitt). <ol><li> Finn en ny synsfelt (FOV) av celler i overført lysmikroskopi modus og fokusere bildet. Ta et kamera snapshot å registrere celle skisserer (Figur 4A).</li><li> Dekk prøven mot omgivelseslys, og slå på EMCCD kamera gevinst. </li><li> Slå på 561 nm laser og bleke mobil autofluorescence og bakgrunns flekker på dekkglass i noen sekunder før du starter datainnsamling. For celler dyrkes og avbildes i M9 medium, og ved å bruke brent dekkglass er det vanligvis svært lite fluorescens bakgrunn, men forblekingen kunne være nyttig for avbilding av celler i et rikt vekstmedium slik som LB. Legg merke til at intens belysning er giftig for celler slik forblekingen bør holdes på et minimum. </li><li> Starte kjøp av en PALM film under kontinuerlig 561 nm eksitasjon ved 15.26 msek / ramme. </li><li> Slå på 405 nm laser og gradvis øke intensiteten i løpet av filmen, når opp til 1 W / cm 2. Unngå høyere 405 nm intensiteter som forårsaker celle autofluorescence. Ta hensyn til tettheten av fluorescerende molekyler - det er viktig å holde aktiverings prisene lave slik at PSFs er klartisolert i hver ramme (figurene 4D-F). </li><li> Record 10000 bilder / film (avhengig av antallet molekyler som skal avbildes per celle), en film tar vanligvis 2-3 minutter, og krever 0,5-1 GB på harddisken, avhengig av størrelsen på FOV. </li><li> Gjenta oppkjøpet prosedyren for flere FOV. Merk at hver FOV kan bare bli fotografert en gang fordi PAmCherry fluoroforene få photoactivated og bleket irreversibelt. </li></ol> 5. Data Analysis En automatisert og robust dataanalyse rammeverket er avgjørende for ytelsen og effektiviteten av metoden. Vi bruker tilpasset programvare skrevet i MATLAB. <ol><li> Utfør lokalisering analyse ved hjelp av algoritmer beskrevet i Crocker et al. 12, Holden et al. 13, HoldenI et al. 14, og Wieser et al. 15 PSFs er først identifisert i et band-pass filtrert bilde ved hjelp av en Gaussian kernel med 7 piksels diameter (Figur 5A). Kandidatstillinger tilsvarer PSFs med peak pixel intensiteter over 4,5 ganger standardavviket til bakgrunnssignalet (Figur 5B). Den lokalt lyseste pixel per kandidat PSF fungerer som startverdi for montering en elliptisk Gaussian funksjon (figur 5C). De frie fit parametrene er: x-posisjon, y-posisjon, x-bredde, y-bredde, rotasjonsvinkel, amplitude og bakgrunns offset. Den elliptiske Gaussian maske står for molekyl under eksponeringstiden, som tåkelegger og deformerer PSF. </li><li> Plott de resulterende (x, y) lokaliseringer fra alle rammer for PALM film på det overførte lysmikroskopi bilde av samme FOV. Lokaliseringer av Pol1-PAmCherry skal vises i det sentrale området av E. coli-celler (figur 6A). Hvis mange lokaliseringer vises utenfor cellene, ble lokalisering terskelen satt for lavt eller prøven inneholdt bakgrunns fluorescerende partikler. </li><li> For automatisert sporings analyse, MATLAB gjennomføring av algoritmen som er beskrevet i Crocker et al. 12 kan benyttes (se &quot;Diffusion analyse&quot; i diskusjon avsnitt). Posisjoner som vises i påfølgende rammer innenfor en brukerdefinert sporingsvinduet er koblet til å danne en bane. I tilfeller der flere lokaliseringer forekomme i samme vindu, blir sporene unikt vis tildelt ved å minimere summen av skrittlengde. For en nærmere omtale av de ulike hensyn ved beregning diffusjonskoeffisienter fra enkeltpartikkelsporingsdata, se Wieser et al. 15 <ol><li> Algoritmen bruker et minne parameter å ta hensyn til forbigående blinking eller savnet lokaliseringer i løpet av et spor. Her setter vi minnet parameter til en ramme, høyere verdier kan brukes til å spore fluoroforene med langlivede mørke tilstander. </li><li> Velg et passende sporing vindu basert på følgende kalibreringstrinn. For Pol1, bruker vi 0,57 mikrometer (5 piksler).</li><li> Kjør sporingsalgoritme for en rekke sporing vindus parametere. Beregn det antall målte spor per celle som en funksjon av relativ vinduet for å identifisere minst mulig relativ vindu som ikke deles spor (figur 6B). </li><li> Plott de resulterende spor på det overførte lys mikros bilde av samme FOV for å visualisere den romlige fordelingen av molekyl bevegelse innenfor cellene. Pol1 spor skal vise diffusjon begrenset innenfor enkeltceller (figur 6C-D). </li><li> Hvis en brøkdel av spor synes å krysse mellom celler dette tyder på at separate molekyler ble feilaktig koblet fordi relativ vinduet ble valgt for stor og / eller den fotoaktivering hastigheten var for høy (fig. 6E). </li><li> Plott den kumulative fordelingen av skrittlengde mellom påfølgende lokaliseringer (Figur 6F). Kurven stiger og metter greit for tilstrekkelig store sporing vinduermen viser en kappekant hvis vinduet er valgt for liten. </li></ol></li><li> For å analysere diffusjon egenskapene til Pol1, beregne den midlere kvadrerte-forskyvning (MSD) mellom påfølgende lokaliseringene for hvert spor med totalt N trinn): MSD = 1 / (N-1) Σ i = 1 N-1 (X i ett - x i) 2 + (y i en - y i) to. Inkluder bare spor med minst fire trinn (N ≥ 5 lokaliseringer) for å redusere den statistiske usikkerheten i MSD verdier. </li><li> Plotte en kurve av MSD-verdier over et spekter av lag ganger ved å beregne forskyvninger over flere rammer (Figur 6G). Formen av MSD-kurven kan bidra til å klassifisere den observerte molekylbevegelse (fig. 6H). </li><li> Beregn den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten D * per spor fra MSD: D * = MSD / (4 At) - σ loc 2 / At. Den andre term korrigerer for den estimerte lokalisering feil (her, σ loc = 40 nm og At = 15,26 msek, se Wieser et al. 15). </li><li> Plott et histogram av de målte D * verdier fra alle låtene i FOV (figur 7A). </li><li> Identifisere individuelle Pol1 molekyler som vises bundet til kromosom basert på målte D * verdi per spor. Separer bestander av bundet (skarp distribusjon med fokus på D * ~ 0 mikrometer 2 / sek) og fritt Diffusorelementene molekyler (bred distribusjon sentrert på D * ~ 0,9 mikrometer 2 / sek) ved å sette en terskel D * &lt;0,15 mikrometer 2 / sek ( røde streker i figur 7A og 7D). </li><li> Gjennomføre lokalisering, sporing, og diffusjon analyse for Pol1 i uskadede celler (figur 7A-C) og i cellene under DNA-skade behandling med MMS (Tall 7D-E). Fraksjonen av innbundne spor gir en direkte kvantitativt mål på DNEn reparasjon aktivitet av Pol1 in vivo. </li></ol>

<ol>
	<li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy.">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy.">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li><li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li><li>Wieser, S., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do's+and+Don't's.">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li><li>Arnauld, S., Nicolas, B., Herv&#233;, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li><li>Elmore, S., M&#252;ller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli.">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li><li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins.">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li></ol>

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Vi diskuterer flere viktige hensyn for å lykkes med forsøket. Valg og uttrykk for fluorescerende fusion protein: Det er en stor palett av photoactivatable og photoswitchable fluorescerende proteiner 17. Den spesifikke valget avhenger av mikroskopet egenskaper, spesielt lasere og filtre tilgjengelig. Kombinasjonen av 405 nm og 561 nm er ideell for vanlige photoactivatable fluorescerende proteiner. Vi valgte PAmCherry 6 fordi den er monomere og viste ingen aggregering i celler. Videre gir irreversibel fotoaktivering telling av antallet av aktiverte fluoroforer til å måle protein kopitall pr celle. I stedet for å uttrykke fusjonsproteinet fra plasmid, foretrekker vi kromosomal innsetting av genet som koder for fusjonsproteinet ved villtype-locus. Dette sikrer fullstendig utskifting av proteinet av interesse med det fluorescerende version og vedlikehold av villtype-ekspresjonsnivået. Fotoaktivering rate: Det er viktig å justere fotoaktivering sats slik at i gjennomsnitt mindre enn ett molekyl per celle er i fluoriserende tilstand i noen ramme av filmen. Dette avhenger av 405 nm intensiteten og antallet molekyler igjen å bli aktivert. Ved svært lave bilde tettheter, men ikke alle molekyler vil bli fotografert før slutten av filmen eller svært lange filmer må være ervervet. Det antall rammer som er tatt opp pr film avhenger av kopitall av fusjonsproteiner pr celle og den midlere fotobleking levetid PAmCherry ved eksitasjon anvendte betingelser. Kopien antall Pol1 er ~ 400 molekyler / celle 1 og middelverdien av den eksponentielle fotobleking levetid fordelingen var ~ fire rammer. Ved å øke den 405 nm intensiteten gradvis, er aktiveringen jevnt fordelt over de 10.000 rammene av filmen. Derfor er occup hver celleIED av fluorescerende molekyler for totalt ~ 1600 rammer, noe som sikrer lite overlapping av PSFs og sporing komplikasjoner i en film på 10.000 rammer. Eksponeringstid og eksitasjon intensiteter: Fremst, eksponeringstider må være tilstrekkelig kort for å observere skarpe PSFs med litt uskarpe bevegelser. Imidlertid bør det bildefrekvens velges for å gi observer molekylær bevegelse mellom suksessive rammer utover lokalisering usikkerhet, ellers viktige fotoner blir kastet bort ved oversampling sporet. Bevegelsen av ubundne molekyler må være samplet ved tilstrekkelig lange tidsintervaller som klart skilte seg ut fra den tilsynelatende bevegelse av bundne molekyler på grunn av lokaliseringen av usikkerhet. Da eksponeringstiden er angitt, skal PSF intensitet justeres. Lokaliseringen presisjon i en PSF øker med antall fotoner detektert over varigheten av en ramme. Høyere eksitasjon intensiteter øke foton emisjon rente but også fotobleking rate og bakgrunnssignal. Bruk laveste eksitasjon intensitet som gir den ønskede lokalisering presisjon. For Pol1-PAmCherry valgte vi 15,26 msek / ramme og 3,5 mW 561 nm eksitasjon (400 W / cm 2). Det er viktig å bekrefte cellelevedyktigheten for de bestemte avbildningsbetingelser ved å overvåke cellevekst og morfologi før og etter datainnsamling (se Tilleggsinformasjonen i Uphoff et al. 7). Pol1 viser en bindende tid på ~ 2 sek til en gapped DNA substrat in vivo 7, vi forventer derfor flertallet av molekyler til å være enten i bundet eller ubundet tilstand for hele varigheten av et spor. Bundet molekyler vises hovedsak immobile fordi kromosom nettsteder har en diffusjonskoeffisienten flere størrelsesordener lavere (~ 10 -5 mikrometer 2 / sek, Elmore et al. 18) enn Pol1 diffusjon i cytoplasma (~ 1 mikrometer 2 </sopp&gt; / sek). Diffusion analyse: Den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten D * beregnes fra MSD av enkeltspor, i gjennomsnitt over et minimum av fire trinn (5 rammer) for å redusere den statistiske feilen. Merk at ~ 75% av molekyler bleke i løpet av mindre enn fem rammer for imaging forholdene beskrevet. Slike korte spor ikke gir tilstrekkelig statistisk sikkerhet å skille mellom bundne og ubundne molekyler. Men de relative fraksjoner av bundne og ubundne molekyler som rapporterer om proteinaktivitet er uavhengig av det totale antall spor analysert. Det er nyttig å redegjøre for PSF lokalisering feil (σ loc) i beregningen av D * fordi usikkerheten legger en tilsynelatende tilfeldig skritt til hver lokalisering av et molekyl 15. For å forbedre klassifiseringen av bundne og Diffusorelementene molekyler, anbefaler vi beregne D * bott fra de enkeltvise forskyvninger og de forskyvninger over tid av to rammer. Det er da mulig å innstille to separate D * terskler: D * (15 msek) &lt;0,15 mikrometer 2 / sek og D * (30 msek) &lt;0,075 mikrometer 2 / sek. Legg merke til at D * er en tilsynelatende diffusjon koeffisient som er berørt av celle innesperring av sporene og uskarpe bevegelser på grunn av diffusjon i løpet av eksponeringstiden. Hvis du vil trekke nøyaktige objektive diffusjonskoeffisienter, har det vist seg nyttig å sammenligne observert bevegelse til simulerte data basert på en stokastisk Brownske bevegelser modell 5,7. Simulerte data kan også bli brukt for å teste fremgangsmåten for dataanalyse. Potensielle anvendelser av denne fremgangsmåte: Det beskrives en generell metode for visualisering og kvantifisering av protein-DNA-interaksjoner in vivo ved endringen i mobilitet av et protein ved binding til kromosom. Virksomheten til DNA-ellerRNA-bindende proteiner som er involvert i reparasjon, kan replikasjon, transkripsjon og kromosom vedlikehold således bli fulgt i sanntid på enkelt-celle-nivået med en romlig oppløsning under optisk diffraksjon grense. Photoactivated single-molekyl sporing strekker konvensjonelle sporingsmetoder som er begrenset til noen få merkede molekyler per celle. En alternativ metode som måler molekylær diffusjon in vivo er fluorescens Recovery Etter photobleaching (FRAP). Mens FRAP er meget nyttig for måling av globale diffusjon egenskaper i store celler, er det begrenset i sin evne til å løse flere molekylære arter med forskjellig mobilitet i et romlig heterogent miljø, spesielt for små bakterieceller. Vi har søkt photoactivated single-molekyl sporing for å måle DNA-bindende aktiviteter og subcellulære lokaliseringer av en rekke forskjellige proteiner i E. coli inkludert Pol1, DNA ligase, Fis protein, DNApolymerase III 7, så vel som strukturell Vedlikehold av kromosomer proteiner MukB, E og F 19.. Vi antar at fremgangsmåten også kan tilpasses andre celletyper.

Denne protokollen beskriver den direkte måling av protein-DNA-interaksjoner i levende Escherichia coli-celler. Teknikken utnytter endringen i diffusjonskoeffisienten av en enkelt fluorescensmerkede protein som det binder kromosomet (fig. 1). For å demonstrere den metoden vi bruker DNA polymerase I (Pol1), en prototypisk DNA-bindende protein som fyller DNA hull i lagging strand replikering og excision reparasjon veier en. Ankomsten av super-oppløsning fluorescens mikros muliggjør visualisering av molekylære strukturer i celler med nanometer oppløsning. Photoactivated Lokalisering Mikros (PALM) syssels fluorescerende proteiner som kan aktiveres fra en opprinnelig mørk tilstand til en fluorescerende tilstand (figur 2). Bare en undergruppe av alle merkede molekyler aktiveres til enhver tid å bestemme deres posisjoner på en sekvensiell måte, uavhengig av tHan total konsentrasjon av merkede molekyler i prøven 2.. Lokaliseringen presisjon per molekyl avhenger i hovedsak av størrelsen på den fluorescerende punktspredefunksjon (PSF), antall innsamlede fotoner, og bakgrunnen signal tre. Mange anvendelser av denne fremgangsmåte fokuserer på forbedret visualisering av cellulære strukturer. Realisering at PALM kan kombineres med single-molekyl sporing fire åpnet nye veier for å direkte følge bevegelsen av vilkårlig antall merkede proteiner i levende celler. Økt følsomhet og tidsmessig oppløsning av fluorescensmikroskoper nå tillate sporing av enkelt Diffusorelementene fluorescerende proteiner i bakteriens cytoplasma fem. Her benytter vi PAmCherry, en konstruert fluorescerende protein som irreversibelt konverterer fra en innledende nonfluorescent tilstand til en fluorescerende tilstand ved bestråling med 405 nm lys seks. Aktivert PAmCherry fluoroforene kan være bilded etter eksitasjon ved 561 nm og spores i flere rammer før fotobleking. Vi demonstrerer evnen av fremgangsmåten for å identifisere transiente DNA-bindende arrangement av enkle proteiner ved bruk av en blanding av Pol1 og PAmCherry. Behandling av celler med metylmetansulfonat (MMS) forårsaker DNA metylering skade som er slått inn gapped DNA underlag med base-excision reparasjon enzymer. Vår metode viser tydelig binding av enkelt Pol1 molekyler som svar på MMS skade syv.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1444">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:477px;"></td>
			<td style="width:467px;">created by Lambda-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM vitamins</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11120-052</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>certified molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>BB024060SC</td>
			<td style="width:467px;">remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl methanesulfonate (MMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129925</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PALM setup</td>
			<td>home-built</td>
			<td></td>
			<td>described in Uphoff et al. 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>for data analysis and visualization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Localization software</td>
			<td style="width:187px;">custom-written, available online</td>
			<td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td>
			<td style="width:467px;">MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tracking software</td>
			<td>available online</td>
			<td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td>
			<td style="width:467px;">MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &#38; Grier 1996 if used in publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

Protein-DNA interaksjoner er i hjertet av mange grunnleggende cellulære prosesser. For eksempel er DNA-replikasjon, transkripsjon, reparasjon og kromosom organisasjon styrt av DNA-bindende proteiner som gjenkjenner spesifikke DNA-konstruksjoner eller-sekvenser. In vitro eksperimenter har bidratt til å generere detaljerte modeller for funksjonen av mange typer av DNA-bindende proteiner, men , de nøyaktige mekanismer for disse prosessene og organiseringen i det komplekse miljø av den levende cellen forblir langt mindre forstått. Vi har nylig introdusert en metode for å kvantifisere DNA-reparasjonsvirksomhet i levende Escherichia coli-celler ved hjelp Photoactivated Lokalisering Mikros (PALM) kombinert med single-molekyl sporing. Det generelle tilnærmingen identifiserer individuelle DNA-bindende arrangementer av endringen i mobilitet av et enkelt protein på assosiasjon med kromosomet. Fraksjonen av bundne molekyler gir en direkte kvantitativt mål for protein handlingivity og overflod av substrater eller bindingssteder på enkelt-celle-nivå. Her beskriver vi begrepet metoden og demonstrere prøveopparbeidelse, datainnsamling, og prosedyrer for dataanalyse.

Begrepet photoactivated enkelt-molekyl sporing for å studere protein-DNA-interaksjoner in vivo er vist på figur 1. PAmCherry fusjonsproteiner er påvist i levende E. coli-celler i en sekvensiell måte ved photoactivating enkle molekyler stokastisk med 405 nm lys ved en frekvens på mindre enn ett molekyl pr celle om gangen. Aktivert molekyler er fotografert under kontinuerlig 561 nm eksitasjon. Molekyl bevegelse i cellen kan spores ved å forbinde nærliggende lokaliseringer i en serie av rammer til irreversibel fotobleking. Fordi spredningen av DNA-bindende proteiner er bremset på bindende kromosomet, den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten D * innhentet per spor rapporterer direkte på individuelle protein-DNA vekselvirkninger. Figur 2 viser fotoaktivering av Pol1-PAmCherry fusjon proteiner i levende E. coli-celler. Påvirkningen av 405 nm intensitet on tettheten av fluorescerende molekyler kan sees i figur 4. Legg merke til at tettheten ikke er utelukkende bestemt av den 405 nm intensitet, men i tillegg med antall molekyler som er tilgjengelige for aktivering, pool av resterende molekyler er oppbrukt i løpet av en PALM film. Lokalisering analyse er utført for hver ramme av en PALM film som illustrert i figur 5.. Vi målte lokalisering presisjon ved hjelp av immobile molekyler i faste celler eller bundet molekyler i levende celler. Våre kjøp innstillinger ga en lokalisering presisjon av σ loc = 40 nm, i samråd med den teoretiske prediksjon tre. De resulterende Pol1 lokaliseringer oppta det sentrale området av cellen (figur 6A), bredt rekapitulere den romlige organiseringen av E. coli nucleoid 7. Flertallet av Pol1 spor i uskadede celler vise forskjelsammensmelting, som vist i figur 6C. En typisk celle inneholder flere hundre Pol1 spor (Figur 6D), i samsvar med kopien antall på ca 400 Pol1 molekyler per E. . coli celle 1 Tall 6B og 6E-F gi veiledning om hvordan du velger en passende sporing vindu parameter - hvis sporing vinduet er for stor, forskjellige molekyler er mer sannsynlig å bli feilaktig knyttet til et spor, hvis sporing vinduet er for lite, spor med lengre trinn vil bli delt. MSD kurve for Pol1 stiger lineært for kort lag ganger og mettet fett ved lengre lag ganger på grunn av cellesperring (figur 6G). Ulike typer av molekylær bevegelse kan identifiseres ved MSD analyse. Rettet bevegelse gir en parabolsk kurve, Brownske bevegelser er karakterisert ved en rett linje, den lukkede diffusjon kurven når et platå, en forskyvning av MSD-kurven for immobile partikler representerer localization usikkerhet (Figur 6 H). Ytterligere informasjon om single-partikkel sporing og feilsøking tips finner du i Arnauld et al. 16 Vi har tidligere anvendt metode for å måle den DNA-reparasjonsaktivitet for Pol1 som respons på eksogen DNA-alkylerings-skade 7.. D * histogram av Pol1 spor i uskadede celler viser en dominerende bestand av spre molekyler (7A-C). En liten brøkdel av 2,7% bundet Pol1 molekyler er sannsynligvis involvert i lagging strand replikering og reparasjon av endogene DNA-skader. Under kontinuerlig 100 mM MMS skade, befolkningen spor med D * ~ 0 mikrometer 2 / sek øker til 13,8% (figur 7D). Disse sporene representerer individuelle Pol1 molekyler som utfører DNA-reparasjonssyntese å fylle single-nukleotid hull som en del av basis-excision reparasjon veien. Posisjonene av bundne spor viser plasseringen av individuelleDNA skade og reparasjon områder (figur 7E-F). <img alt="Figur 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> Figur 1. Grafisk representasjon av fremgangsmåten. (A) Et fluorescerende protein PAmCherry kan photoactivated fra en opprinnelig nonfluorescent tilstand ved bestråling med 405 nm lys. Den lyse staten er spent på 561 nm og avgir fluorescens rundt 600 nm før fluoroforpar blekemidler irreversibelt. (B) Kontroll av den fotoaktivering hastighet tillater avbildning bare en enkelt stokastisk aktivert PAmCherry fusjonsprotein per celle når som helst mens den vilkårlig stort basseng av molekyler som enda ikke er blitt aktivert eller som allerede har blitt bleket restene i en mørk tilstand. (C) Posisjonen av fluorescerende molekyl bestemmes fra midten av det isolerte PSF og tracked for flere rammer før fotobleking. (D) Spor av mange molekyler blir registrert i en sekvensiell måte. (EF) Interaksjonen av et DNA-bindende protein med en kromosomal target-sekvens eller konstruksjon vil stoppe den tilfeldige diffusiv bevegelse. Bundne og ubundne molekyler er preget av den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten D * hentet fra enkeltspor. Den resulterende fraksjon av bundne molekyler gir et kvantitativt mål for aktiviteten til en DNA-bindende protein in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">for å vise større bilde.</a> <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> Figur 2. Fotoaktivering av Pol1-PAmCherry i levende E. coli-celler. Scale barer: 1 mikrometer. Skjema er vist under hvert panel. (<html> A) overfør lysmikroskopi bilde av celler immobilisert på en agarose pad. (B) Phototactivating en enkelt PAmCherry fluoroforen i en celle. (C) En høyere fotoaktivering hastighet øker antallet fluorescerende molekyler. (D) Integrert PAmCherry fluorescens fra en PALM film. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> Figur 3. Skjematisk fremstilling av en minimal PALM oppsett for photoactivating og bildebehandling PAmCherry fusjonsproteiner D1:. Dichroic speil (f.eks 550 nm lang-pass). D2: dichroic speil (f.eks 570 nm lang-pass). L1: kollimeringslinse. L2: TIR linse. L3: Tube-objektiv.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større bilde. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4. Representative bilder fra en PALM film med 15,26 msek / ramme Scale barer:. 1 mikrometer. (A) sendes lyset bilde av cellene immobilisert på en agarose puten. (B) Mørk bakgrunnsbilde målt på EMCCD kamera med lasere slått av. (C) Magnetiseringsutkobling bakgrunnsbilde under kontinuerlig 561 nm eksitasjon før fotoaktivering. (DF) Økt 405 nm intensitet fører til høyere fotoaktivering priser av PAmCherry, fotografert under kontinuerlig 561 nm eksitasjon. Eske områdene er vist forstørret nedenfor. (D) Lav 405 nm intensitet (&lt;1 μW) aktive svært få fluorescerende molekyler per FOV. (E) Medium 405nm intensitet (~ 2 μW) fotoaktivering resulterer i en god PSF tetthet for lokalisering og sporing analyse. (F) Higher 405 nm intensitet (~ 10 μW) aktiverer mer enn ett fluorescerende molekyl i noen celler, noe som tilslører lokalisering og sporing analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> Figur 5. Illustrasjon av lokalisering analyse. Scale barer: 1 mikrometer (A) Band-pass filtrering fjerner falsk pixel støy og flater intensitet gradienter over FOV.. (B) Kandidat PSFs er identifisert i den filtrerte bilde basert på en brukerdefinert terskel som er valgt for å redusere falske positive og falske negative oppdagelser. Den terskelenld tilsvarer den minste intensiteten av en kandidat piksel dividert med bakgrunnsstandardavvik (signal-to-noise ratio, SNR). (C) Den lokalt lyseste pixel som passerer terskelen fungerer som innledende lokalisering gjetning (oransje kors) for en to-dimensjonal elliptisk Gaussian passform. Scale barer: 0,5 mikrometer. Den resulterende super-oppløsning lokalisering (blå kors) har en gjennomsnittlig presisjon av σ loc = 40 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. Figur 6 Illustrasjon av sporingsanalyse Scale barer: 1 mikrometer. (A) Alle oppdagede lokaliseringer av Pol1-PAmCherry i et eksempel celle. (B) Antall spor oppdageed i eksempelet cellen som en funksjon av relativ vinduet. Små sporing vinduer delt molekyl baner, noe som fører til kunstig høyt antall spor. Den stiplede linje angir vårt mål for sporing vindus parameter (0,57 um, 5 piksler) - dette gir et godt kompromiss mellom å detektere full fordeling av fremgangsmåten og holde baner av forskjellige molekyler intakt. (C) Eksempel spor av en enkelt Pol1-PAmCherry molekyl. (D) Alle målte spor vist i tilfeldige farger. (E)-sporing gjenstander hvis sporing av vinduet velges for stor (her 0,8 mikrometer, 7 piksler) eller tettheten av PSFs per ramme for høyt. (F) Akkumulert fordelinger av skrittlengde for sporing vinduer: 0,34 mikrometer (3 piksler, rød linje), 0,57 mikrometer (5 piksler, blå linje), og 0,80 mikrometer (7 piksler, grønn linje). Merk at 0,34 mikrometer sporing vinduet stenger skritt lengre enn 0,34 mikrometer som klartforkorter den fulle fordeling av trinnene. Den 0,57 mikrometer sporings vinduet detekterer nesten den samme fordeling av fremgangsmåten som gjør 0.80 mikrometer sporing vinduet. (G) MSD kurven viser begrenset spredning av Pol1. (H) Skjematisk MSD kurver for rettet bevegelse, Brownske bevegelser, begrenset spredning, og immobile partikler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> Figur 7. Direkte måling av DNA-reparasjonsaktivitet for Pol1 i levende E. . coli celler Scale barer: 1 mikrometer. (A) Histogram av den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten D * for alle spor av fire eller flere trinn i en FOV av uskadde celler (N = 4162 låter). Befolkningen i molekyler klassifisert som b<html> ound er uthevet i rødt. (BC) Låter av Pol1-PAmCherry er vist på et overført lysmikroskopi image. Tracks klassifisert som bundet i henhold til deres diffusjonskoeffisienten er vist i rødt. (D) D * histogram for Pol1 spor, målt i cellene immobilisert på en agarose puten med 100 mM MMS, og inkubert i 20 min før avbildning (N = 2,128 spor). Befolkningen i bundne molekyler engasjert i DNA-reparasjon er vist i rødt. (EF) Pol1-PAmCherry spor på overført lysmikroskopi bilde som viser sporene av single Pol1 DNA reparasjons hendelser i rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Video 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> Movie en. Bygge en skreddersydd PALM oppsett.JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se video.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualisering Protein-DNA Interaksjon i Levende bakterieceller Bruke Photoactivated Single-molekyl Tracking

Photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) kombinert med single-molekyl sporing tillater direkte observasjon og kvantifisering av protein-DNA vekselvirkninger i levende Escherichia coli-celler.

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging inlc Secretion å etterforske Cellular Infeksjon av Bakteriell Patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Vurdering av bakterieinvasjon av hjerteceller i kultur og hjertekolonisering hos infiserte mus ved hjelp av Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

En ny metode for kvalitativ Multi-skala analyse av bakterielle biofilmer på Trådformede soppkolonier Bruke Confocal og elektronmikroskopi

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Visualisere effekten av Sputum på Biofilm Development Ved hjelp av en Chambered dekkglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...