Name: sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Proceduren til at analysere og sortere Streptomyces pellets fra en to dage gammel væske-dyrket kultur skematisk i figur 1.. Informationer om fremgangsmåden er angivet nedenfor. 1.. Vækst (herunder udarbejdelse af medier og buffere) <ol><li> Klargør 1 L 10x phosphatbufret saltvand (PBS; 80 g NaCI, 2 g KCI, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2PO 4 i 1 L destilleret vand justeret til pH 7,4). På tidspunktet for brug tilsættes 100 ml 10x PBS til 900 ml destilleret vand til opnåelse af 1 liter PBS. </li><li> Klargør 1 L YEME-medium (3 g Difco gærekstrakt, 5 g Bacto-pepton 3 g Oxoid maltekstrakt, 10 g glucose, 340 g saccharose, destilleret vand op til 1 liter) og 100 ml 2,5 M MgCl2. Steriliser begge opløsninger ved autoklavering. Bemærk, at også andre Streptomyces medier kan bruges 4,14. </li><li> Tilsæt 100 ml YEME medium og 0,2 ml 2,5 M MgCl2 til etsteril 250 ml Erlenmeyer-kolbe udstyret med metal sammenrullet fjedre. Forbered så mange kolber bakterielle prøver at studere. </li><li> Podes hver kolbe med 10 8 sporer af Streptomyces at opnå en sporekoncentration 10 6 sporer / ml. Grow bakterierne i 2 dage ved 30 ° C under omrystning ved 180 rpm. </li></ol> 2. Sampling <ol><li> Overfør en 5 ml prøve fra hver kultur til et 15 ml Falcon-rør ved hjælp af en steril 5 ml pipette. Ryst forsigtigt kulturen, mens du tager prøven for at sikre, at stikprøven er repræsentativ for hele kulturen. </li><li> Når prøver analyseres straks med copas ingen prøveforberedelse tiltag er nødvendige. Hold prøven på is og fortsæt til trin 3.1 i denne protokol. Når prøver analyseres på et senere tidspunkt, fastsætte pellets som beskrevet i trin 2,3-2,5 af denne protokol. Bemærk, at fiksering forhindrer også vækst af bakterier i rørsystemet når ikke korrekt rengøres efter Analyses. Sørg for, at fiksering med formaldehyd ikke hæmmer downstream analyser. For eksempel kan RNA ikke isoleres fra fungale pellets efter fiksering med formaldehyd. I modsætning hertil blev RNA held isoleret efter fiksering med 70% ethanol 12. </li><li> Tilsættes 600 pi af 37% formaldehyd til 5 ml af prøven og blandes ved at vende røret 3x. Lave prøverne på is i 30 minutter. </li><li> Centrifuger prøverne ved 2500 xg i en fast rotor ved 4 ° C i 10 min. Fjern forsigtigt supernatanten og vaske pellets med 5 ml PBS. </li><li> Gentag trin 2.4, således at pillerne vaskes med PBS 2x. Prøverne kan opbevares i PBS ved 4 ° C i flere uger. </li></ol> 3. Copas Analyse <ol><li> Sørg for, at Copas Plus pumpen, computeren og 488 nm argon laser er tændt, og start Biosort softwaren. Selvom tændt, vil laseren stadig være i standby modus. </li><li> Tjek om kappevæske flasken er fuld, ogaffald flasken er tom. </li><li> Klik på &#39;start&#39; og derefter &#39;Kør&#39; for at skifte 488 nm argon laser fra standby til. Efter ca 60 sek, når laseren er tændt, skal du klikke på &quot;FÆRDIG&quot;. </li><li> Kontroller manometre. Det pres for &#39;Skede&#39;, &#39;Sample&#39;, &#39;Sorter&#39; og &#39;Clean &quot;skal læses omkring 4,0, 0,5, 2,7 og 10,9 hhv. </li><li> Klik på afkrydsningsfeltet ved siden af ​​&#39;Pressure OK&#39;. Systemet derefter primer flowcellen og er klar til brug. </li><li> Standard indstillinger er antaget med »Forsinkelse« på 11 og &#39;Bredde&#39; 7. Tærskelværdier er fastsat til 50 for &quot;signal&quot; og 40 for &quot;TOF Minimum&quot; med TOF repræsenterer time-of-flight. (For fuldstændighedens: alle &#39;Gevinst&#39; er sat på 1, aftrækkeren er sat til EXT (Extinction), og i &#39;Configuration&#39; fanen under &#39;Vælg scan rate&#39; 2,50 MHz vælges Tilfældighed er sat til &#39;Forbedret &quot;.). </li><li> Fjern overskydende vand fra prøven kop end tilsættes 0,1 ml af Streptomyces prøve fra trin 2.2 eller 2.5 i koppen sammen med PBS (ca. 50 ml). Sørg prøvekop er lukket korrekt. </li><li> Klik på &#39;Acquire&#39; for at begynde at indsamle data. Styre strømmen hastighed for at opnå mellem 30-50 hændelser per sekund. Hvis flowet er for høj, tilsættes PBS til prøvekop. Hvis flowet hastighed er for lav, tilføje mere prøve. </li><li> Når mindst 2.500 hændelser indsamles klik &#39;STOP&#39;. Gemme alle data på &#39;Store&#39; og gemme din fil til efterfølgende statistiske analyse. Den Biosort software vil gemme dataene i fire filer, hvoraf kun det. Txt-fil vil blive brugt til den efterfølgende analyse. </li><li> Rengør prøvekop ved at fjerne prøven med en 50 ml sprøjte og vask med vand 2x. </li><li> Gentag trin 3,7-3,10 indtil alle prøver analyseres. </li></ol> 4.. Dataanalyse <ol><li> Åbn. Txt-fil og kassere data med en EXT lavere end 25 (ved hjælp af for eksempel MS Excel). Detsvarer til snavs og løse svampetrådenes fragmenter (for Aspergillus niger alle data med en EXT lavere end 150 er kasseret) 4,12. Derefter gemme alle tofs i en kolonne i en almindelig fil (for mange datafiler dette kan automatiseres i programmeringssproget R, tilgængelig fra: &#39;txt&#39;. <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Sørg Scilab (version 5.3.2 eller nyere fra http://www.scilab.org/) installeres sammen med den &quot;fittools &#39;bibliotek, som er tilgængelig sammen med den manuelle, fra: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Start Scilab og køre de nødvendige funktioner i fittools biblioteket til at modellere data. Kort sagt: Installer fittools biblioteket som vist i manualen (kun nødvendigt én gang). <ol><li> Indlæse fittools biblioteket. </li><li> Læs data (&#39;. Txt&#39; fil) i Scilab. </li><li>Log omdanne dataene (naturlig log er standard log-funktion). </li><li> Monter den model af 2 populationer til dataene. </li><li> Plotte en graf med histogram og model (ekstraudstyr). </li><li> Bootstrap data (1.000 gentagelser). </li><li> Monter model til de bootstrapped datasæt. </li><li> Få konfidensintervallerne skøn over de 5 parametre. Dette vil give oplysninger om deltagelse fraktion (p) af bestandene, deres 2 midler (μ 1 og μ 2), og de ​​tilhørende standardafvigelser (α 1 og α 2). Desuden er de konfidensintervaller 95% bestemt ved genmontering med modellen efter bootstrapping (1.000 gentagelser) 12,13,15. Når konfidensintervallerne for de midler ikke overlapper hinanden og konfidensintervallet for p er mellem 0,025-0,975 datasættet kan forklares som en kombination af to populationer af normalfordelinger. (Bemærk thved deltagelse brøkdel af små piller er p, mens deltagelsen af store piller er 1 -. p) Forholdet mellem TOF og diameteren af en Streptomyces pille lig 0,57 × TOF + 159 um 4. </li></ol></li><li> I tilfælde findes to populationer bruge de gennemsnitlige tofs sortering parametre i Copas som den øvre og nedre grænse for at sortere de små og store pellets efterfølgende. Bemærk, at der kan vælges andre sortering parametre afhængigt af krav til brugeren. </li></ol> 5.. Pellet Sortering <ol><li> Load Streptomyces prøve, der skal sorteres, som beskrevet i trin 3.7. </li><li> Set &#39;klasseringsgrænsen&#39;, og give oplysninger om den minimale (Lo) og maksimal (Hi) TOF værdier. Alternativt, sæt et område ved at vælge &#39;Regioner&#39; og derefter &#39;Definer Gate Region&#39; for at vælge de pellets med de ønskede dimensioner eller egenskaber. </li><li> Placer en 50 ml rør tilindsamle flere piller, der opfylder sortering parametre. Alternativt kan en mikro-titerplade anvendes til at sortere de enkelte pellets. Flere pellets (10 4 -10 5) er nødvendige for DNA-og protein-ekstraktion. En enkelt pellet er tilstrækkelig til qPCR analyse af gen-ekspression, men der er behov for flere piller til RNA-sekventering. </li><li> Beslut og angive antallet af piller, der skal sorteres, og klik på &#39;Sorter manuelt &quot;for at sortere for de valgte parametre. Når den indstillede mængde piller er nået, sorteringen afsluttes automatisk. </li><li> Fjern tilovers prøve med en 50 ml sprøjte fra prøven kop og vaske koppen med vand 2x. Gentag trin 5,1-5,5 hvis andre prøver skal sorteres. </li><li> Før nedlukning af copas skylle prøvekop med vand for at fjerne de resterende pellets og rengør prøvekop med 70% EtOH og / eller 2% hypochlorit i vand. Kør en prøve af chlorerede vand til at rense hele systemet og gentage dette med vand. Tom than overløb beholder og rengør eller udskift filter, der er bosat i denne beholder. </li><li> Når du er færdig, skal du klikke på &#39;STOP&#39; for at frigøre trykket fra systemet. Når motoren stopper lukker programmet og klikke på &#39;Shutdown uden udrensning&#39;. Sluk derefter computeren, Copas, laser, og pumpen. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Flowcytometri har aktiveret high-speed analyse af store antal af enkelte celler, der har bidraget til vores forståelse af heterogenitet i klonpopulationer 6. Regelmæssig flowcytometri er ikke muligt for analyse af de flercellede myceliske pellets af Streptomyceter og svampe. Vores arbejde har vist, at high-throughput analyse af Streptomyces piller er muligt at gøre brug copas. Den her beskrevne procedure er enkel, hurtig og meget reproducerbar. Den kritiske parameter at huske på under drift af instrumentet er strømningshastigheden, som ikke bør overstige 100 arrangementer / sek (trin 3.8 i denne protokol). Hvis koncentrationen pellet, og dermed også strømningshastigheden bliver for høj, vil TOF værdier beregnet forkert, fordi instrumentet ikke kan detektere individuelle pellets. Tilstrækkeligt fortynde prøven ved tilsætning af PBS overvinder dette problem. Begrænsninger Den Copas Plus brug<html> d her har en dysediameter på 1 mm, der er egnet til måling af partikler med en størrelse i området fra 30 til 700 um. Denne dyse gør det derfor muligt at måle pellets dannet af streptomycetes. I tilfælde af trådsvampe mikro-kolonier kan være større, hvilket begrænser den generelle anvendelighed af Copas Plus. Den Copas XL kan måle partikler op til 1.500 um i størrelse, men dens følsomhed i det nedre område for diameter er mindre i forhold til det færdige Copas Plus. Både Copas Plus og den Copas XL kan ikke analysere partikler mindre end 30 um. Dette indebærer, at de enkelte mikrobielle sporer eller celler, der ikke kan analyseres. Desuden kan copas ikke nøjagtigt at analysere små aggregater af sporer og celler og de meget små mikro-kolonier. Til dette skal der anvendes regelmæssigt celle analysatorer. Denne begrænsning overvindes ved Biosorter fra Union Biometrica, som kan analysere partikler i området 1-1,500 um. Købet præmie dog er højere. t &quot;&gt; Fejlfinding Den Copas er et robust instrument, der er nem at betjene. Men nogle gange pellets ikke påvises efter indlæsning af en prøve i prøven kop og start målingen. Årsagen er typisk en tilstoppet indgang rør, som let kan løses ved at trykke på kommandoen &#39;clean&#39;. Dette vil tvinge pellets tilbage fra rørsystemet i prøven kop. En alternativ årsag kan være, at låget ikke er korrekt placeret på prøven kop. Dette fører til tryktab og samtidig ikke opdages pellets. Betydning og fremtidige retninger Vi her fokuseret på analysen af ​​pillestørrelse men copas opsætningen er også i stand til at analysere og sortere baseret på fluorescens og tæthed. Fluorescensdetektion muligt for os at analysere genekspression baseret på journalister som GFP. Endvidere kan sammensætningen af ​​celler evalueres. Endnu mere magtfulde er mulighed for at adskille pellets i henhold til disse parameterbreve. Sorteret piller kan bruges til efterfølgende analyser, inklusive alle genomenbaserede studier. Faktisk vi tidligere sorteres 60.000 store og 200.000 små pellets, og viste, at proteomet var signifikant forskellig mellem store og små pellets 4. Denne teknologi giver derfor nye kundeemner til at forbedre Streptomyceter som cellefabrikker. Den vigtigste fordel ved den Copas teknologi er tid. Tidligere undersøgelser af cellepellets blev udført under anvendelse mikroskopi, og dette begrænser antallet af pellets, der kan analyseres op til flere hundrede 16. Mikroskopi undersøgelser, der allerede antydet eksistensen af to populationer af træpiller i væske-dyrket Streptomyces kulturer 16. Faktisk blev to populationer af pellets påvist uanset dyrkningsbetingelser i et stort antal forskellige Streptomyceter 4. Denne størrelse heterogenitet er ikke begrænset til trådformede Streptomyceter, men blev også observeret i trådet svampe 12 &lt;/ Sup&gt;. I alle tilfælde er de underliggende mekanismer heterogenitet endnu ikke kendt. Muligheden for at sortere pellets efter størrelse og fluorescens gør det muligt at optrævle sådanne mekanismer.

Streptomycetes er trådformede jordbakterier, der er kendt for deres duelighed til at antibiotika, såvel som forbindelser, der kan anvendes som immunosuppressive midler eller til at bekæmpe svampeinfektioner eller kræft 1,2. Derudover har disse organismer producerer enzymer, der er af interesse for en bred vifte af industrielle applikationer 3. De fleste af disse kommercielt interessante forbindelser produceres i bioreaktorer. Vækst af Streptomyceter i bioreaktorer er karakteriseret ved dannelsen af ​​komplekse strukturer af sammenkoblede hyfer, kendt som klumper eller pellets. Disse flercellede strukturer er meget uensartede med hensyn til størrelse 4 og kan nå størrelser, der er mere end en million gange større end en encellet bakterie som Escherichia coli eller Bacillus subtilis. Selvom heterogenitet betragtes som en gavnlig egenskab i naturlige biologiske systemer 5, anses det for en produktion faldgrube i industrien. Bioreaktor dyrkningen skal være reproducerbar og kontrollerbar for at opnå den højest mulige udbytte. En detaljeret forståelse af den rolle, hver af pillen typer i en bioreaktor er derfor afgørende at forbedre Streptomyceter som en celle fabrik. Flowcytometri er almindeligt anvendt til at analysere individuelle celler i en population 6. Flowcytometre kan erhverve multiparametric oplysninger ved samtidigt at måle cellernes egenskaber (såsom størrelse, densitet og flerfarvet fluorescens). På denne måde kan celleegenskaber korreleres dermed bidrage til vores forståelse af heterogenitet inden for en kultur og eksistensen af forskellige populationer af celler 6. Mere specialiserede instrumenter har gjort det muligt at sortere celler i overensstemmelse med brugerdefinerede parametre. For eksempel kan mutanter screenes. Efter sortering kan sådanne mutant celler dyrkes til yderligere karakterisering. Det har allerede vist sig at være nyttig, blandt andre,at forbedre produktiviteten af stammer 7,8. Dyserne flowcytometre typisk giver mulighed for passage af celler med en maksimal diameter på ca 10 um. Derfor kan pellets af Streptomyceter ikke analyseres med regelmæssige flowcytometre. De kan dog analyseres med det Complex Object Parametric Analyzer og et sorteringsanlæg (Copas). Ligesom regelmæssige flowcytometre kan Copas erhverve multiparametric data for partikler i et high throughput måde. Afhængigt af typen af ​​copas 10-1,500 um størrelse partikler kan analyseres. Desuden giver det mulighed for sortering af individuelle partikler, der kan anvendes til dyrkning eller efterfølgende analyser, såsom isolering af DNA, RNA eller proteiner. Copas blev oprindeligt udviklet til analyse og sortering af små flercellede organismer, såsom nematode Caenorhabditis elegans 9 og Drosophila embryoner og larver 10. Instrumenterne er også blevet brugt til zebrafisk 11 and for trådsvampe 12,13. Sidstnævnte organismer også danne mycelie-pellets, der er endnu større end dem, der dannes af trådformede bakterier. Vi har for nylig påvist, at anvendelsen af copas er også muligt for Streptomyceter 4. Vi her beskriver den eksperimentelle procedure for brug af copas at vurdere pellet heterogenitet i Streptomyces coelicolor, herunder oplysninger om den metode til at sortere pellets efter størrelse. Bemærk dog, at denne metode også kan bruges til analyse af andre pellet-dannende Streptomyceter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomyceter er trådformede jordbakterier, der bruges i industrien til produktion af enzymer og antibiotika. Når der dyrkes i bioreaktorer, disse organismer danner netværk af sammenkoblede hyfer, der er kendt som pellets, som er heterogene i størrelse. Her beskriver vi en metode til at analysere og sortere myceliske træpiller vha. en kompleks objekt Parametric Analyzer og et sorteringsanlæg (Copas). Detaljerede instruktioner er givet for anvendelsen af ​​instrumentet og grundlæggende statistiske analyse af data. Vi beskriver desuden, hvordan træpiller kan sorteres efter brugerdefinerede indstillinger, som gør det muligt downstream forarbejdning, såsom analyse af RNA eller protein-indhold. Ved hjælp af denne metode mekanismen underliggende heterogene vækst kan tackles. Dette vil være medvirkende til at forbedre Streptomyceter som en celle fabrik, i betragtning af, at produktiviteten korrelerer med pellet størrelse.

Copas målinger af Streptomyces pellets Streptomyceter danner myceliske træpiller i flydende kulturer, der har en bred vifte af størrelser. At analysere pillestørrelse distribution, en 2-dages gamle væske dyrket Streptomyces coelicolor kultur blev udsat for store partikler flowcytometri under anvendelse af en Copas Plus Profiler udstyret med en 1 mm dyse. En typisk copas output er et punktdiagram, såsom skitseret i figur 2A. X-aksen repræsenterer den tid-of-flight (TOF), som korrelerer med pellet størrelse (dvs. det tager længere tid for større pellets at passere laserstrålen). Y-aksen viser udryddelse, der repræsenterer den optiske densitet af objektet. Hvert punkt i punktplottet svarer til en individuel hændelse, dvs en enkelt pille passerer laserstrålen. Vigtigere er det, når prøven er for koncentreret (dvs. når laseren registrerer mere end 100 arrangementer / sek), den Copas ofte undlader at registrere individuel pellets. Dette fører til falske TOF værdier, der er for høje. Fortynde prøven reducerer de gennemsnitlige TOF værdier, op til et punkt, hvor yderligere fortynding ikke længere effekt TOF. Dette punkt er nået, når omkring 100 piller / sek blev analyseret. Plotte datapunkterne i et histogram angiver, at de størrelser, der ikke er normalt fordelt (figur 2B). Fordelingen synes at være skæv til højre. Log omdanne datasættet også ikke førte til en normal fordeling (figur 2C). At vurdere, om størrelsesfordelingen kan forklares ved at antage en blanding af to normalfordelinger data blev matematisk modelleret 12,15. Modellering faktisk viste, at størrelsesfordelingen kan forklares ved at antage eksistensen af ​​to forskellige populationer af pellets. Den population af små pellets bestod af 92% af alle pellets med en gennemsnitlig størrelse på 248 um, mens populationen af ​​store pellader (8% af alle piller) havde en gennemsnitlig størrelse på 319 m (bemærk, at to populationer antages at eksistere, når fraktionen deltagelse er mellem 2,5 til 97,5%). Sortering af Streptomyces pellets efter størrelse Micro-kolonier fra befolkningerne i store og små pellets blev sorteret. Til dette formål blev de gennemsnitlige pillestørrelser af de to populationer anvendes til at definere grænserne for sortering. Pellets er mindre end 248 um blev anset for at være fra den lille pellet befolkningen, mens pellets større end 319 um blev anset for at være fra den store pellet population (figur 3), således at begrænse sortering af pellets fra den overlappende del af de to størrelse distributioner. Mikroskopisk analyse af sorterede pellets viste deres forskellige størrelser (Figur 3). De indsamlede piller kan yderligere anvendes til DNA, RNA eller protein isoleringer. &lt;img alt = &quot;Figur 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figur 1.. Skematisk fremstilling af forsøgsopstillingen at måle og analysere Streptomyces træpiller vha. copas. For detaljer, se eksperimentelle procedurer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figur 2.. Pillestørrelse heterogenitet i flydende dyrket Streptomyces kulturer. Copas analyse af en 2 dage gammel S. coelicolor YEME kultur (A) viser, at pillestørrelser (angivet som Time værdier flyvning) er normalt ikke distribuered (B), og heller ikke bliver det, når log-transformerede (C). I stedet blev to populationer af træpiller, der afviger i TOF (og dermed størrelse) opdaget. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figur 3. Fraktionering af Streptomyces pellets efter størrelse. Pellets med en størrelse mindre end 248 um (angivet i pink), blev anset for at være små pellets, mens pellets med en størrelse større end 319 um (vist med blåt), blev anset for at være store pellets. Mikroskopisk analyse bekræftede forskellen i størrelse. Bemærk, at disse størrelser blev beregnet ud fra log-transformerede data ved hjælp af den beskrevne forhold mellem TOF og diameter af Streptomyces pille, hvilket svarer til 0,57 × TOF + 159 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se større billede.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Flydende dyrket Streptomyces kulturer er kendetegnet ved myceliske pellets, der er heterogene i størrelse. Vi her beskrive en metode til at analysere og sortere disse pellets i en high-throughput måde. Disse piller kan bruges til yderligere analyser, som vil give fører til at forstå og styre væksten heterogenitet.

Sortering af<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cell træpiller vha. en Complex Object Parametric Analyzer og sortering

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell specifik analyse af<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blade Med fluorescensaktiveret cellesortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescensaktiveret cellesortering til isoleractiniske cellepopulationer

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Brug af cellemetabolisk fluxanalysator i realtid til at overvåge osteoblastbioenergetika

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Isoler celletypespecifikke RNA'er fra snapfrosne heterogene vævsprøver uden cellesortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...