Name: sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

De procedure voor het analyseren en sorteren Streptomyces pellets van twee dagen oude vloeibare kweek gekweekt wordt schematisch weergegeven in figuur 1. Details van de werkwijze worden hieronder gegeven. 1. Groei (inclusief de voorbereiding van Media en Buffers) <ol><li> Bereid 1 liter 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 80 g NaCl, 2 g KCI, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2PO 4 in 1 liter gedestilleerd water op pH 7.4). Tijdens gebruik 100 ml 10x PBS met 900 ml gedestilleerd water tot 1 liter PBS vinden. </li><li> Bereid 1 liter YEME medium (3 g Difco gistextract, 5 g Bacto-pepton, 3 g Oxoid moutextract, 10 g glucose, 340 g sucrose, gedestilleerd water tot 1 liter) en 100 ml 2,5 M MgCl2. Steriliseren beide oplossingen in autoclaaf. Merk op dat ook andere Streptomyces media kunnen worden gebruikt 4,14. </li><li> Voeg 100 ml YEME medium en 0,2 ml 2,5 M MgCl2 eensteriele erlenmeyer van 250 ml voorzien van metalen spiraalveren. Bereid zoveel flessen als bacteriële monsters te studeren. </li><li> Inoculeren elke kolf met 10 8 sporen van Streptomyces tot een spore concentratie van 10 6 sporen / ml te verkrijgen. Groeien de bacteriën gedurende 2 dagen bij 30 ° C onder schudden bij 180 rpm. </li></ol> 2. Monsterneming <ol><li> De overdracht van een 5 ml monster van elke cultuur tot een 15 ml Falcon buis met behulp van een steriele 5 ml pipet. Schud de cultuur terwijl het nemen van het monster te verzekeren dat de steekproef representatief is voor de hele cultuur. </li><li> Wanneer monsters onmiddellijk worden geanalyseerd met COPAS geen monstervoorbereiding stappen nodig. Houd het monster op ijs en ga verder met stap 3.1 van dit protocol. Wanneer monsters worden geanalyseerd op een later tijdstip, bevestig de pellets zoals beschreven in stappen 2,3-2,5 van dit protocol. Merk op dat fixatie voorkomt ook de groei van de bacteriën in het buissysteem wanneer niet goed schoongemaakt na analyses. Zorg ervoor dat fixatie met formaldehyde niet belemmert stroomafwaarts analyses. Zo kan RNA niet worden geïsoleerd uit schimmel pellets na fixatie met formaldehyde. Daarentegen werd RNA succes geïsoleerd na fixatie met 70% ethanol 12. </li><li> Voeg 600 ul van 37% formaldehyde aan 5 ml monster en meng door de buis 3x. Bevestig de monsters op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 2500 xg in vaste rotor bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en was de pellets met 5 ml PBS. </li><li> Herhaal stap 2.4, zodat de pellets worden gewassen met PBS 2x. De monsters kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C gedurende enkele weken. </li></ol> 3. COPAS Analyse <ol><li> Zorg ervoor dat de COPAS Plus, de pomp, de computer en de 488 nm argon laser zijn ingeschakeld en start de Biosort software. Hoewel ingeschakeld, zal de laser nog steeds in stand-by modus. </li><li> Controleer of de fles mantelvloeistof vol enafvalfles is leeg. </li><li> Klik op &#39;Start&#39; en vervolgens op &#39;Uitvoeren&#39; om de 488 nm argon laser schakelen vanuit stand-by op. Na ongeveer 60 seconden, wanneer de laser is ingeschakeld, klikt u op &#39;OK&#39;. </li><li> Controleer de manometers. De druk voor &#39;schede&#39;, &#39;Monster&#39;, &#39;Sorter&#39; en &#39;schoon&#39; moeten circa 4,0, 0,5, 2,7, en 10,9 respectievelijk lezen. </li><li> Klik op het selectievakje naast &#39;Pressure OK&#39;. Het systeem priemgetallen dan de stroomcel en is klaar voor gebruik. </li><li> Standaard instellingen worden aangenomen met &#39;Delay&#39; op 11 en &#39;Breedte&#39; 7. Drempels zijn vastgesteld op 50 voor &#39;Signal&#39; en 40 voor &#39;TOF Minimum&#39;, met TOF die de vlucht tijd-van-. (Voor de volledigheid: alle &#39;Winst&#39; zijn vastgesteld op 1, de trigger is ingesteld op EXT (Extinction) en in het tabblad &#39;Configuratie&#39; onder &#39;Selecteer scansnelheid&#39; 2,50 MHz wordt gekozen Toeval is ingesteld op &#39;Geavanceerd&#39;.). </li><li> Verwijder overgebleven water uit het monster beker eend voeg 0,1 ml Streptomyces monster uit stap 2.2 en 2.5 in de beker met PBS (ongeveer 50 ml). Zorg ervoor dat het monster beker goed is gesloten. </li><li> Klik op &#39;Acquire&#39; om te beginnen met het verzamelen van gegevens. Het beheren van de stroomsnelheid te verkrijgen tussen 30-50 gebeurtenissen per seconde. Indien de stroming te hoog is, voeg PBS aan de monsterhouder. Als de stroomsnelheid te laag is, voeg meer monster. </li><li> Als ten minste 2500 gebeurtenissen worden verzameld op &#39;STOP&#39;. Om alle gegevens klikt u op &#39;Store&#39; opslaan en sla uw bestand voor verdere statistische analyse. De Biosort software de gegevens in vier bestanden, waarvan slechts het tekstbestand. Wordt gebruikt voor de daaropvolgende analyse. </li><li> Reinig het monster beker door het monster te verwijderen met een 50 ml spuit en wassen met water 2x. </li><li> Herhaal stap 3,7-3,10 totdat alle monsters geanalyseerd. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Open het txt-bestand. Gegevens en gooi met een lager bedrag dan 25 EXT (bijvoorbeeld met behulp van MS Excel). Dezekomt overeen met puin en losse hyfen fragmenten (voor Aspergillus niger alle gegevens met een lager dan 150 EXT worden genegeerd) 4,12. Sla vervolgens alle TOFS in een kolom in een duidelijke &#39;txt.&#39; File (voor veel gegevensbestanden dit kan geautomatiseerd worden in de programmeertaal R, verkrijgbaar bij: <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Zorg ervoor SciLab (versie 5.3.2 of nieuwer uit http://www.scilab.org/) wordt samen met de &#39;fittools&#39; bibliotheek die beschikbaar is, samen met de handleiding, vanaf: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Start SciLab en voer de noodzakelijke functies van de fittools bibliotheek het datamodel. Kortom: Installeer de fittools bibliotheek zoals aangegeven in de handleiding (slechts een keer nodig). <ol><li> Laad de fittools bibliotheek. </li><li> Lees de gegevens (&#39;txt.&#39; File) in SciLab. </li><li>Log transformeren de data (natuurlijke logaritme is de standaard log-functie). </li><li> Monteer het model van 2 populaties gegevens. </li><li> Maak een grafiek met het histogram en het model (optioneel). </li><li> Bootstrap de gegevens (1000 herhalingen). </li><li> Breng het model om de bootstrap datasets. </li><li> Ontvang de betrouwbaarheidsintervallen schattingen van de 5 parameters. Deze zal informatie opleveren over de deelname fractie (p) van de bevolking, hun 2 middelen (μ 1 en μ 2) en de bijbehorende standaarddeviaties (α 1 en α 2). Bovendien zijn de 95%-betrouwbaarheidsintervallen bepaald door het monteren met het model na bootstrapping (1000 herhalingen) 12,13,15. Wanneer de intervallen van de middelen vertrouwen niet overlappen en de betrouwbaarheidsinterval van p tussen 0,025-0,975 de dataset kan worden verklaard als een combinatie van twee populaties van normale verdelingen. (Opmerking thbij deelneming fractie van kleine pellets p, terwijl de deelname van grote pellets 1 -. p) De relatie tussen TOF en de diameter van een Streptomyces pellet gelijk 0,57 × TOF + 159 um 4. </li></ol></li><li> In het geval twee populaties zijn te vinden gebruik de gemiddelde TOFS sorteerweegschalen parameters in de COPAS als de boven-en ondergrens voor de kleine en grote pellets vervolgens te sorteren. Merk op dat ook meer sorteerparameters kan worden gekozen afhankelijk van de eisen van de gebruiker. </li></ol> 5. Pellet Sorting <ol><li> Plaats het Streptomyces monster dat moet worden gesorteerd zoals beschreven in stap 3.7. </li><li> Stel &#39;sorteren Limits&#39; en details te verstrekken over de minimale (Lo) en maximale (Hi) TOF waarden. Als alternatief stellen een gebied door het selecteren van &#39;Regio&#39; en vervolgens &#39;Definieer Gate Regio&#39; om de pellets met de gewenste afmetingen of eigenschappen te selecteren. </li><li> Plaats een 50 ml buisverzamelen meerdere pellets die aan de sorteerparameters. Als alternatief kan een micro-titer plaat worden gebruikt om individuele korrels te sorteren. Meerdere pellets (10 4 -10 5) zijn nodig voor DNA en eiwit-extractie. Een pellet is voldoende voor qPCR analyse van genexpressie, maar meerdere pellets zijn nodig voor RNA sequentie. </li><li> Beslis en stel het aantal pellets die moeten worden gesorteerd en klik op &#39;Sorteren Handmatig&#39; te sorteren voor de geselecteerde parameters. Wanneer de ingestelde hoeveelheid pellets wordt bereikt, het sorteren automatisch beëindigd. </li><li> Verwijder overgebleven monster met een spuit van 50 ml van het monster beker en was de beker met water 2x. Herhaal de stappen 5,1-5,5 als andere monsters moeten worden gesorteerd. </li><li> Vóór het afsluiten van de COPAS spoel de steekproef beker met water om de resterende pellets te verwijderen en schoon te maken het monster beker met 70% EtOH en / of 2% hypochloriet in water. Voer een steekproef van gechloreerd water om het hele systeem te reinigen en herhaal deze met water. Lege tHij container en schone overstromen of vervang het filter dat zich in deze container. </li><li> Wanneer u klaar bent, klikt u op &#39;STOP&#39; om de druk van het systeem los te maken. Als de motor stopt sluit het programma en klik op &#39;Shutdown zonder zuivering&#39;. Schakel vervolgens de computer uit, de COPAS, de laser, en de pomp. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Flowcytometrie is de snelle analyse van grote aantallen van enkele cellen, die klonale populaties 6 bijgedragen aan ons begrip van heterogeniteit ingeschakeld. Regelmatig flowcytometrie is niet haalbaar voor analyse van de meercellige mycelium pellets van streptomyceten en schimmels. Ons werk heeft aangetoond dat high-throughput analyse van Streptomyces pellets is haalbaar met behulp COPAS. De hier beschreven procedure is eenvoudig, snel, en zeer reproduceerbaar. De kritische parameter in gedachten te houden tijdens het gebruik van het instrument is de stroomsnelheid, die niet hoger mag zijn dan 100 events / sec (stap 3.8 van dit protocol). Indien de pellet concentratie, en dus ook de stroomsnelheid, te hoog wordt, zal de TOF waarden berekend waren omdat het instrument niet aan individuele korrels detecteren. Voldoende verdunnen van het monster door de toevoeging van PBS ondervangt dit probleem. Beperkingen De COPAS Plus gebruik<html> d heeft hier een spuitmond diameter van 1 mm, die geschikt is voor het meten van deeltjes met een grootte variërend 30-700 urn. Dit mondstuk maakt daarom meten pellets gevormd door streptomyceten. Voor filamenteuze schimmels kan het micro-kolonies groter zijn, wat de algemene toepasbaarheid van de COPAS Plus beperkt. De COPAS XL deeltjes kan meten tot 1500 urn in grootte maar de gevoeligheid in het onderste bereik van diameter kleiner vergeleken met die van de COPAS Plus. Zowel de COPAS Plus en de COPAS XL kan niet deeltjes kleiner dan 30 micrometer te analyseren. Dit betekent dat individuele microbiële sporen of cellen niet kunnen worden geanalyseerd. Bovendien kan de COPAS niet nauwkeurig te analyseren kleine aggregaten van cellen of sporen en de zeer kleine micro-kolonies. Voor deze, moet gewone mobiele analysers worden gebruikt. Deze beperking wordt overwonnen door de Biosorter van Union Biometrica, welke deeltjes kan analyseren in het bereik van 1-1,500 urn. De aankoop prijs is echter hoger. t &quot;&gt; Problemen oplossen De COPAS is een robuust instrument is eenvoudig te bedienen. Echter, soms pellets worden niet gedetecteerd na het laden van een monster in de steekproef beker en het starten van de meting. De oorzaak is typisch een verstopte ingang buis, die gemakkelijk kan worden opgelost door de &#39;schone&#39; commando. Dit zal de pellets terug uit de slang systeem dwingen in het monster beker. Een andere reden kan zijn dat het deksel niet correct in de monsterhouder geplaatst. Dit leidt tot drukverlies en gelijktijdig niet-pellets detecteren. Betekenis en toekomstige richtingen Wij hier gericht op de analyse van korrelgrootte maar de COPAS setup is ook in staat om te analyseren en te sorteren op basis van fluorescentie en dichtheid. Fluorescentiedetectie kunnen wij genexpressie op basis reporters zoals GFP geanalyseerd. Verder kan de samenstelling van cellen geëvalueerd. Nog krachtiger is de mogelijkheid om pellets te scheiden volgens deze parametersters. Gesorteerd pellets kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyses inclusief alle omica studies. Inderdaad, wij eerder gesorteerd 60.000 grote en 200.000 kleine pellets, en toonde aan dat het proteoom was significant verschillend tussen grote en kleine pellets 4. Deze technologie biedt daarom nieuwe leads te streptomyceten als celfabrieken verbeteren. Het belangrijkste voordeel van de COPAS technologie is tijd. Eerdere studies op celpellets werden uitgevoerd microscopische en beperkt dit het aantal korrels die kan worden geanalyseerd om honderden 16. Microscopie studies reeds gesuggereerd dat er twee populaties pellets in vloeibare kweken gekweekt Streptomyces 16. Inderdaad, twee populaties pellets werden gedetecteerd ongeacht kweekomstandigheden in een groot aantal verschillende streptomyceten 4. Deze maat heterogeniteit is niet beperkt tot draadvormige streptomyceten, maar werd ook waargenomen in filamenteuze schimmels 12 &lt;/ Sup&gt;. In alle gevallen zijn de onderliggende mechanismen van heterogeniteit nog niet bekend. De mogelijkheid om pellets te sorteren op grootte en fluorescentie stelt ons in staat om dergelijke mechanismen te ontrafelen.

Streptomyceten zijn filamenteuze bodembacteriën die bekend staan ​​om hun vaardigheid om antibiotica te maken, alsmede verbindingen die kunnen worden gebruikt als immunosuppressiva of schimmelinfecties of kanker 1,2 bestrijden. Bovendien zijn deze organismen produceren enzymen die van belang zijn voor een groot aantal industriële toepassingen 3. De meeste commercieel interessante verbindingen worden geproduceerd in bioreactoren. Ontwikkeling van streptomyceten in bioreactoren wordt gekenmerkt door de vorming van complexe structuren van onderling verbonden hyfen, bekend als klonten of pellets. Deze meercellige structuren zijn zeer heterogeen met betrekking tot maat 4 en kan maten die meer dan een miljoen keer groter dan een eencellige bacterie zoals Escherichia coli of Bacillus subtilis bereiken. Hoewel heterogeniteit als uiteindelijk eigenschap in natuurlijke biologische systemen 5, wordt het beschouwd als een productie valkuil industrie. Bioreactor teelten zijn reproduceerbaar en controleerbaar hoog mogelijke opbrengst te verkrijgen. Het begrijpen van de rol van elk van de pellet types in een bioreactor is daarom van cruciaal belang streptomyceten als celfabriek verbeteren. Flowcytometrie wordt vaak gebruikt om individuele cellen te analyseren in een populatie 6. Flowcytometers kan multiparametrische informatie te verkrijgen door het gelijktijdig meten van eigenschappen van de cellen (zoals grootte, dichtheid en multicolor fluorescentie). Zo kan celeigenschappen worden gecorreleerd waardoor wordt bijgedragen aan ons begrip van heterogeniteit binnen een cultuur en het bestaan ​​van verschillende populaties van cellen 6. Meer gespecialiseerde instrumenten hebben het mogelijk om cellen te sorteren door de gebruiker gedefinieerde parameters. Zo kunnen mutanten worden gescreend. Na sortering, kunnen dergelijke mutant cellen worden gekweekt voor verdere karakterisering. Dit heeft al bewezen nuttig te zijn, onder andere,productiviteit van stammen 7,8 verbeteren. De mondstukken van flowcytometers typisch voor het passeren van cellen met een maximale diameter van ongeveer 10 urn. Daarom kan pellets van streptomyceten niet worden geanalyseerd met regelmatige flowcytometers. Zij, echter, kan worden geanalyseerd met de Complexe Object Parametric Analyzer en Sorter (COPAS). Als gewone flowcytometers, kan COPAS Multiparametrische gegevens van deeltjes in een high throughput manier te verwerven. Afhankelijk van het type COPAS 10-1,500 urn deeltjes kunnen worden geanalyseerd. Bovendien maakt het sorteren van afzonderlijke deeltjes die kunnen worden gebruikt voor de kweek of stroomafwaarts analyses, zoals de isolatie van DNA, RNA of eiwitten. COPAS was oorspronkelijk ontworpen voor de analyse en sortering van kleine meercellige organismen, zoals de nematode Caenorhabditis elegans 9 en Drosophila embryo&#39;s en larven 10. De instrumenten zijn ook gebruikt voor 11 een zebravisnd voor draadschimmels 12,13. Deze organismen vormen ook mycelium pellets die nog groter is dan die gevormd door filamenteuze bacteriën. We hebben onlangs aangetoond dat het gebruik van COPAS is ook mogelijk voor streptomyceten 4. We beschrijven hier de experimentele procedure voor het gebruik van de COPAS om pellet heterogeniteit beoordelen Streptomyces coelicolor, met inbegrip van bijzonderheden over de methodiek om pellets te sorteren op grootte. Let wel, dat deze werkwijze ook kan worden gebruikt voor de analyse van andere pellet vormende streptomyceten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomyceten zijn filamenteuze bodembacteriën die worden gebruikt in de industrie voor de productie van enzymen en antibiotica. Wanneer gekweekt in bioreactoren, deze organismen vormen netwerken onderling verbonden hyfen, zogenaamde pellets, die heterogeen zijn in grootte. Hier beschrijven we een methode om te analyseren en te sorteren mycelium pellets met behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter (COPAS). Gedetailleerde instructies worden gegeven voor het gebruik van het instrument en de elementaire statistische analyse van de gegevens. We bovendien beschrijven hoe pellets kunnen worden gesorteerd volgens de gebruiker gedefinieerde instellingen, die downstream processing mogelijk maakt zoals de analyse van het RNA of eiwit gehalte. Met behulp van deze methode het mechanisme onderliggende heterogene groei kan worden aangepakt. Deze elementen zullen verbeteren streptomyceten als een mobiele fabriek, gezien het feit dat de productiviteit correleert met korrel grootte.

COPAS metingen van Streptomyces pellets Streptomyceten vormen mycelium pellets in vloeibare culturen die een breed scala van maten hebben. Om korrelgrootte distributie analyseren, een 2-daagse oude vloeistof gegroeid Streptomyces coelicolor cultuur werd onderworpen aan grote deeltjes flowcytometrie met behulp van een COPAS Plus Profiler uitgerust met een 1 mm mondstuk. Een typische COPAS uitgang is een scatterplot zoals gevisualiseerd in figuur 2A. De x-as geeft de tijd-of-flight (TOF), die correleert met korrelgrootte (duurt langer om grotere pellets aan de laserstraal passeren). De y-as de extinctie, die de optische dichtheid van het object vertegenwoordigt. Elk punt in de scatterplot overeenkomt met een individuele gebeurtenis, dwz een enkele pellet passeren van de laserstraal. Belangrijk is, wanneer het monster te geconcentreerd is (dat wil zeggen wanneer de laser meer dan 100 evenementen / sec detecteert), de COPAS vaak mislukt individuele p detecterenellets. Dit leidt tot valse TOF waarden die te hoog zijn. Het monster te verdunnen vermindert de gemiddelde TOF waarden, tot een punt waar verder verdunnen doet niet langer invloed TOF. Dit punt wordt bereikt wanneer ongeveer 100 pellets / sec werden geanalyseerd. Plotten van de datapunten in een histogram geeft aan dat de maten zijn niet normaal verdeeld (Figuur 2B). De verdeling lijkt scheef naar rechts. Log transformeren van de dataset ook niet leiden tot een normale verdeling (figuur 2C). Om te beoordelen of de grootteverdeling kan verklaard worden door aan te nemen van een mengsel van twee normale verdelingen van de gegevens werd wiskundig gemodelleerd 12,15. Modellering inderdaad aangegeven dat de grootteverdeling kan worden verklaard met het bestaan ​​van twee verschillende populaties pellets. De populatie van kleine pellets bestond uit 92% van alle korrels met een gemiddelde grootte van 248 urn, terwijl de bevolking van grote pellaat (8% van alle pellets) hadden een gemiddelde grootte van 319 micrometer (merk op dat twee populaties worden geacht te bestaan ​​wanneer de deelname fractie tussen 2,5-97,5%). Sorteren van Streptomyces pellets naar grootte Micro-kolonies van de populaties van grote en kleine pellets werden gesorteerd. Hiertoe werden de gemiddelde korrelgrootte van de twee populaties gebruikt om de grenzen voor het sorteren definiëren. Pellets kleiner dan 248 urn werden beschouwd als de kleine pellet bevolking, dat pellets groter dan 319 urn werden beschouwd als de grote populatie pellet (Figuur 3), teneinde beperken sortering van pellets uit het overlappende gedeelte van de twee formaten distributies. Microscopische analyse van de gesorteerde pellets toonden hun verschillende maten (figuur 3). De verzamelde pellets kunnen verder worden gebruikt voor DNA, RNA of eiwit isolaties. &lt;img alt = &quot;Figuur 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele opstelling voor het meten en analyseren van Streptomyces pellets gebruik COPAS. Voor details, zie de experimentele procedures. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figuur 2. Korrelgrootte heterogeniteit in vloeibare kweken gekweekt Streptomyces. COPAS analyse van een 2 dagen oude S. coelicolor YEME cultuur (A) geeft aan dat korrelgrootte (aangeduid als Time of Flight waarden) normaliter niet verspreidend (B), en noch wordt dus als log-getransformeerde (C). In plaats daarvan, twee populaties van pellets die verschillen in TOF (en dus de grootte) werden gedetecteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figuur 3. Fractionering van Streptomyces pellets volgens grootte. Pellets met een grootte kleiner dan 248 micrometer (aangegeven in roze) werden beschouwd als kleine pellets, terwijl pellets met een maat groter dan 319 micrometer (in blauw aangegeven) werden beschouwd als grote pellets zijn. Microscopische analyse bevestigde het verschil in grootte. Merk op dat deze afmetingen werden berekend uit de log-getransformeerde gegevens met de beschreven relatie tussen TOF en diameter van een Streptomyces pellet, wat gelijk is aan 0,57 × TOF + 159 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

-Vloeibare gegroeid Streptomyces culturen worden gekenmerkt door mycelium pellets die heterogeen zijn in omvang. We beschrijven hier een werkwijze voor het analyseren en sorteren dergelijke pellets in een high-throughput manier. Deze pellets kunnen worden gebruikt voor verdere analyse, die leidt zal begrijpen en te beheersen groei heterogeniteit.

Sorteren van<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cel Pellets behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

Een Multi-parametrische Islet Perifusion System binnen een Microfluïdische Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescentie-geactiveerde celsorde voor de isolatie van scleractinische celpopulaties

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...