Name: sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

ההליך לניתוח וסוג Streptomyces כדורים מתרבות שגדל נוזל שני ימים בת מיוצג באופן סכמטי באיור 1. פרטים על השיטה הם כדלקמן. 1. צמיחה (כולל הכנת מדיה וBuffers) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של 10x בופר פוספט (PBS; 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, 2.4 גרם KH 2 PO 4 ב1 ליטר של מים מזוקקים מותאם pH 7.4). בזמן שימוש להוסיף של 10x PBS 100 מיליליטר ל900 מיליליטר של מים מזוקקים כדי לקבל 1 ליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מדיום YEME (3 תמצית גרם Difco שמרים, 5 peptone גרם Bacto, 3 גרם תמצית מאלט Oxoid, 10 גרם גלוקוז, סוכרוז 340 גרם, מים מזוקקים עד 1 ליטר) ושל 2.5 M MgCl 2 100 מיליליטר. לעקר את שני הפתרונות על ידי מעוקר. שים לב שניתן להשתמש בם תקשורת Streptomyces גם אחרת 4,14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 בינוני מיליליטר YEME ו0.2 מיליליטר 2.5 M MgCl 2 עדבקבוק מיליליטר Erlenmeyer סטרילי 250 מצויד במעיינות מפותלות מתכת. הכן את צלוחיות רבות כמו דגימות חיידקים ללמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן כל בקבוק עם 10 8 נבגים של Streptomyces להשיג ריכוז נבג של 10 6 מיליליטר / נבגים. לגדל את החיידקים במשך 2 ימים ב30 ° C תוך רועד ב180 סל&quot;ד. </li></ol> 2. דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מדגם 5 מיליליטר מכל תרבות ותרבות לצינור פלקון 15 מיליליטר באמצעות פיפטה מיליליטר סטרילי 5. נער בעדינות את התרבות בעת נטילת המדגם כדי להבטיח כי המדגם מייצג לתרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר דגימות מנותחות מייד עם Copas אין שלבי הכנת מדגם נחוצים. שמור את המדגם על קרח והמשך לשלב 3.1 של פרוטוקול זה. כאשר דגימות מנותחות בנקודת זמן מאוחרת יותר, לתקן את כדורים כפי שמתואר בצעדים 2.3-2.5 של פרוטוקול זה. שים לב כי קיבעון גם מונע צמיחה של החיידקים במערכת צינורות, כאשר לא ניקה כראוי אחרי analyses. להבטיח קיבוע שעם פורמלדהיד אינו פוגע ניתוחים במורד הזרם. לדוגמא, RNA לא יכול להיות מבודד מפטרייתי כדורים לאחר קיבוע עם פורמלדהיד. לעומת זאת, RNA היה מבודד בהצלחה לאחר קיבוע עם אתנול 70% 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 μl של פורמלדהיד 37% עד 5 מיליליטר של מדגם ומערבבים על ידי היפוך 3x הצינור. תקן את הדגימות על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות ב2,500 XG ברוטור קבוע על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מוציא בזהירות את supernatant ולשטוף את כדורים עם 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 כך שהכדורים נשטפים עם PBS 2x. ניתן לאחסן הדגימות בPBS על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. </li></ol> 3. Copas ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא Copas בנוסף, המשאבה, המחשב וליזר ארגון 488 ננומטר מופעלים ולהפעיל את תוכנת Biosort. למרות שמופעל, הלייזר עדיין יהיה במודוס המתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו אם בקבוק נדן נוזל מלא ובקבוק פסולת הוא ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;התחל&quot; ולאחר מכן &quot;לרוץ&quot; כדי לעבור לייזר ארגון 488 ננומטר ממצב המתנה ב. לאחר כ 60 שניות, כאשר הלייזר פועל, לחץ על &#39;סיום&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מודד לחץ. הלחצים ל&#39;נדן &#39;,&#39; דוגמא &#39;,&#39; סדרן &#39;ו&#39; נקי &#39;צריכים לקרוא סביב 4.0, 0.5, 2.7, ו10.9 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תיבת הסימון שליד &#39;אישור לחץ &quot;. לאחר מכן, המערכת מספרים ראשונית תא הזרימה ומוכנה לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות סטנדרטיות הם הניחו עם &#39;רוחב&#39; 7 &#39;עיכוב&#39; ב11 ו. ספים נקבעים ב50 עבור &#39;איתותים&#39; ו40 עבור &#39;TOF מינימום&#39;, עם TOF המייצג את הטיסה בזמן של. (לשלמות: כל &#39;הרווחים&#39; נקבעים בבית 1, על ההדק מוגדר בEXT (הכחדה) ובכרטיסייה &#39;ההגדרה&#39; תחת &#39;בחר קצב סריקה&#39; 2.50 MHz נבחר צירוף מקרים מוגדר &#39;משופר&#39;.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שאריות מים מהכוס מדגםד להוסיף 0.1 מיליליטר של מדגם Streptomyces משלב 2.2 או 2.5 בכוס יחד עם PBS (סביב 50 מיליליטר). ודא כוס המדגם סגורה כהלכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;רוכש את&#39; להתחיל לאסוף נתונים. לנהל את זרימת המהירות כדי להשיג בין 30-50 אירועים בשניה. אם הזרימה היא גבוהה מדי, להוסיף PBS לכוס המדגם. אם מהירות הזרימה נמוכה מדי, להוסיף עוד דוגמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר לפחות 2,500 אירועים נאספים &#39;עצור&#39; קליק. כדי להציל את &quot;החנות&quot; כל קליק נתונים ולשמור את הקובץ שלך לניתוח סטטיסטי שלאחר מכן. תוכנת Biosort תהיה לשמור את הנתונים בארבעת קבצים, מתוכם רק קובץ txt. ישמש לניתוח שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הגביע לדוגמא על ידי הסרת את המדגם עם מזרק 50 מיליליטר וכביסה עם 2x מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.7-3.10 עד שכל הדגימות מנותחות. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ txt. וזורקים נתונים עם EXT נמוך מ25 (באמצעות למשל MS Excel). זהמתאים לפסולת ושברי hyphal רופפות (לאספרגילוס ניז&#39;ר ​​כל הנתונים עם EXT נמוך 150 מאשר מבוטלים) 4,12. לאחר מכן, שמור את כל TOFs בעמודה אחת במישור קובץ (לנתונים רבים קבצים זה יכול להיות אוטומטי בR שפת תכנות, זמין: &quot;txt.&quot; <a href="http://www.r-project.org">Http://www.r-project.org).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא Scilab (גרסת 5.3.2 או חדש יותר מhttp://www.scilab.org/) מותקנת יחד עם הספרייה &#39;fittools&#39;, שהוא זמין, יחד עם המדריך, מ: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל Scilab ולהפעיל את הפונקציות הכרחיות של ספריית fittools למודל נתונים. בקיצור: התקן את ספריית fittools כפי שמוצג במדריך (נדרש רק פעם אחת). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ספריית fittools. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוא את הנתונים (קובץ &#39;. Txt &quot;) לScilab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">התחבר להמיר את הנתונים (יומן טבעי הוא פונקצית יומן ברירת המחדל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המודל של 2 אוכלוסיות לנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשרטט גרף עם היסטוגרמה והמודל (אופציונלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bootstrap נתונים (1,000 עותקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המודל למערכי נתוני bootstrapped. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את ביטחון מקטעי זמן הערכות של 5 הפרמטרים. זה יספק מידע על שבריר ההשתתפות (p) של האוכלוסיות, 2 האמצעים שלהם (μ 1 ו μ 2) וסטיות תקן הנלוות (α 1 ו α 2). יתר על כן, את מרווחי ביטחון של 95% נקבעים על ידי תיקון ובשיפוץ עם המודל לאחר bootstrapping (1,000 עותקים) 12,13,15. כאשר מרווחי הביטחון של האמצעים אינם חופפים ומרווח הביטחון של p הוא בין 0.025-0.975 בסיס הנתונים ניתן להסביר כשילוב של שתי אוכלוסיות של התפלגות נורמלית. (שים לב הבשבריר ההשתתפות של כדורים הקטנים הוא p, ואילו ההשתתפות של כדורים הגדולים היא 1 -. עמ &#39;) מערכת היחסים בין TOF והקוטר של גלולה Streptomyces שווה 0.57 × TOF + 159 מיקרומטר 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה שתי אוכלוסיות נמצאות שימוש TOFs הממוצע מיון פרמטרים בCopas כעליון וגבול תחתון כדי למיין את כדורים הקטנים וגדולים לאחר מכן. שים לב שגם ניתן לבחור פרמטרים מיון אחרים בהתאם לדרישות של המשתמש. </li></ol> 5. גלולה מיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם Streptomyces שצריך להיות מסודרים כמתואר בשלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדרה &#39;מיון גבולות&#39; ולספק פרטים על המינימלי (Lo) והמקסימאלי (Hi) ערכי TOF. לחלופין, להגדיר אזור על ידי &#39;אזורים&#39; ולאחר מכן &#39;הגדירו שער אזור&#39; כדי לבחור את כדורים עם מידות או תכונות הרצויות בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור 50 מ&quot;ללאסוף כדורים רבים העונים על הפרמטרים מיון. לחלופין, צלחת מייקר כייל ניתן להשתמש כדי למיין כדורים בודדים. כדורים מרובים (10 4 -10 5) יש צורך לדנ&quot;א ומיצוי חלבון. גלולה אחת מספיקה לניתוח qPCR של ביטוי גנים, אבל כדורים מרובים יש צורך ברצף RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליט ולקבוע את מספר כדורים שצריכים להיות מסודרים ולחץ על &quot;מיין באופן ידני&quot; כדי למיין לפי הפרמטרים שנבחרו. כאשר מגיע לסכום הקבוע של כדורים, המיון מסתיים באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נשארו מדגם עם מזרק 50 מיליליטר מהכוס המדגם ולשטוף את הכוס עם 2x מים. חזור על שלבים 5.1-5.5 אם דוגמאות אחרות צריכים להיות מסודרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני כיבוי Copas לשטוף את כוס המדגם עם מים כדי להסיר את כדורים שנותרו ולנקות את הכוס המדגם עם EtOH 70% ו / או היפוכלוריט 2% במים. הפעל מדגם של מים עם כלור לניקוי המערכת כולה ולחזור על זה עם מים. לא ריקהוא הצפת מיכל ונקי או להחליף את המסנן שנמצא במכל הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשתסיים, לחץ על &#39;עצור&#39; כדי לשחרר את הלחץ מהמערכת. כאשר מפסיק מנוע לסגור את התכנית ולחץ על &quot;כיבוי ללא טיהור &#39;. ואז לכבות את המחשב, Copas, לייזר, ומשאבה. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Cytometry זרימה אפשרה הניתוח המהיר של כמויות גדולות של תאים בודדים, אשר תרם להבנה של ההטרוגניות שלנו באוכלוסיות משובטים 6. cytometry זרימה הסדיר הוא לא ריאלי עבור ניתוח של כדורי mycelial תאיים של streptomycetes ופטריות. העבודה שלנו הוכיחה כי ניתוח תפוקה גבוהה של כדורי Streptomyces אפשרי באמצעות Copas. ההליך המתואר כאן הוא פשוט, מהיר, ושחזור מאוד. הפרמטר הקריטי שכדאי לזכור בעת הפעולה של המכשיר הוא מהירות הזרימה, שלא תעלה על 100 אירועים / שניות (שלב 3.8 של פרוטוקול זה). אם ריכוז גלולה, ולכן גם את מהירות הזרימה, הופך להיות גבוהים מדי, ערכי TOF יהיו שגו משום שהמכשיר לא מצליח לזהות את כדורים בודדים. מספיק דילול המדגם על ידי התוספת של PBS מתגבר על הבעיה הזו. מגבלות שימוש Copas פלוס<html> ד כאן יש קוטר נחיר של 1 מ&quot;מ, אשר מתאים למדידת חלקיקים בגודל שנע 30-700 מיקרומטר. נחיר זה ולכן מאפשר מדידת כדורים שהוקמו על ידי streptomycetes. במקרה של פטריות פילמנטיות מייקר המושבות עשויות להיות גדולות יותר, המגבילה את התחולה הכללית של פלוס Copas. Copas XL יכול למדוד חלקיקים עד 1,500 מיקרומטר בגודל אבל את הרגישות שלו בטווח התחתון של קוטר היא פחות בהשוואה לזה של פלוס Copas. שני פלוס Copas וXL Copas לא יכולים לנתח את החלקיקים קטנים יותר מאשר 30 מיקרומטר. משמעות הדבר הוא כי לא ניתן לנתח נבגים של חיידקים או תאים בודדים. בנוסף, Copas אולי לא במדויק לנתח מצרפים קטנים של נבגים ותאים או מייקר המושבות קטנות מאוד. לשם כך, יש להשתמש בנתחים סלולריים רגילים. מגבלה זו היא להתגבר על ידי Biosorter של איחוד Biometrica, שיכול לנתח את החלקיקים בטווח של 1-1,500 מיקרומטר. הפרס רכישת אולם הוא גבוה יותר. t &quot;&gt; פתרון בעיות Copas הוא מכשיר חזק כי הוא קל לתפעול. עם זאת, לפעמים כדורים לא מזוהים לאחר טעינת מדגם לתוך כוס המדגם והחל המדידה. הסיבה היא בדרך כלל צינור הזנה סתום, אשר בקלות יכולה להיפתר על ידי לחיצה על הפקודה &quot;נקייה&quot;. זה יאלץ את כדורים בחזרה ממערכת צינורות לתוך כוס המדגם. סיבה אלטרנטיבית יכולה להיות שהמכסה אינה ממוקמת כראוי על כוס המדגם. זה מוביל לירידה בלחץ והכישלון במקביל לאיתור כדורים. משמעותו וכיוונים עתידיים אנחנו כאן התמקדנו בניתוח של גודל גלולה אבל התקנת Copas היא גם מסוגלת לנתח וסוג המבוסס על הקרינה וצפיפות. גילוי הקרינה מאפשר לנו לנתח את ביטוי גנים המבוסס על כתבים כגון ה-GFP. יתר על כן, בהרכב של תאים יכול להיות מוערך. אפילו חזק יותר היא האפשרות להפריד בין כדורים לפי parame אלהters. כדורים מסודר יכולים לשמש לניתוחים במורד הזרם, ובכלל זה מחקרים כל omics. ואכן, אנחנו מסודרים בעבר 60,000 כדורים 200,000 קטנים וגדולים, והוכיחו כי proteome הייתה שונה באופן משמעותי בין כדורים קטנים והגדולים 4. טכנולוגיה זו ולכן מספקת מוביל חדש כדי לשפר את streptomycetes כמפעלי תא. היתרון העיקרי של טכנולוגית Copas הוא זמן. מחקרים קודמים על כדורי תא בוצעו באמצעות מיקרוסקופ, וזה מגביל את מספר כדורים שניתן לנתח עד כמה מאות 16. מחקרים מיקרוסקופית כבר הציעו את קיומם של שתי אוכלוסיות של כדורים בתרבויות Streptomyces-גדל נוזל 16. ואכן, שתי אוכלוסיות של כדורים התגלו ללא קשר לתנאי תרבות במספר גדול של streptomycetes שונה 4. ההטרוגניות גודל זה אינה מוגבל לstreptomycetes פילמנטיות, אך נצפתה גם בפטריות פילמנטיות 12 &lt;/ Sup&gt;. בכל המקרים, את המנגנון הבסיסי של הטרוגניות עדיין לא ידוע. האפשרות למיין כדורים לפי גודל וקרינה מאפשרת לנו לפענח מנגנונים כאלה.

Streptomycetes הם חיידקי פילמנטיות אדמה שידועים היטב למיומנות שלהם כדי להפוך את האנטיביוטיקה, כמו גם תרכובות שיכולים לשמש כשמה כן היא, או כדי להילחם בזיהומים פטרייתיים או 1,2 הסרטן. בנוסף, אורגניזמים אלה מייצרים אנזימים שיש בם עניין למגוון רחב של יישומים תעשייתיים 3. רוב התרכובות מעניינות מסחרי אלה מיוצרים בbioreactors. צמיחה של streptomycetes בbioreactors מאופיינת על ידי היווצרות של מבנים מורכבים של העובש ביניהם, הידועים כגושים או כדורים. מבנים רב תאיים אלה הם הטרוגנית מאוד ביחס לגודל 4 ויכולים להגיע לגדלים שהם יותר ממיליון פעמים גדולות יותר מאשר חיידק חד תאי כגון Escherichia coli או Bacillus subtilis. למרות ההטרוגניות נחשבת כתכונה מועילה במערכות ביולוגיות טבעיות 5, זה נחשב מכשול ייצור בתעשייה. ביוcultivations כור צריך להיות לשעתקו ושליטה כדי להשיג התשואות הגבוהות ביותר אפשריות. הבנה מפורטת של תפקידו של כל אחד מהסוגים גלולה בbioreactor לכן חיונית כדי לשפר streptomycetes כמפעל תא. Cytometry זרימה משמשת בדרך כלל כדי לנתח תאים בודדים באוכלוסייה 6. cytometers הזרימה יכול לרכוש מידע multiparametric זמנית על ידי מדידת מאפיינים של התאים (כגון גודל, צפיפות, וקרינה ססגוני). בדרך זו, יכולים להיות מתואם מאפייני תא ובכך תורמים להבנה שלנו של ההטרוגניות בתוך תרבות ואת קיומם של אוכלוסיות שונות של תאים 6. מכשירים יותר מיוחדים הפכו אותו ניתן למיין תאים על פי פרמטרים המוגדר על ידי משתמש. לדוגמא, יכולות להיות מוקרנת מוטציות. בעקבות מיון, יכולים להיות מתורבתים תאים שעברו מוטציה כזו לאפיון נוסף. זה כבר הוכיח את עצמו שימושי, בין השאר,כדי לשפר את הפרודוקטיביות של זני 7,8. חרירי זרימת cytometers בדרך כלל לאפשר המעבר של תאים בקוטר מרבי של כ 10 מיקרומטר. לכן, גלולות של streptomycetes לא יכולות להיות מנותחות עם הזרימה cytometers הרגיל. הם, לעומת זאת, יכולים להיות מנותחים עם האובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן (Copas). כמו הזרימה cytometers הרגיל, Copas יכול לרכוש נתונים multiparametric של חלקיקים באופן תפוקה גבוה. בהתאם לסוג של Copas ניתן לנתח 10-1,500 מיקרומטר בגודל חלקיקים. בנוסף, היא מאפשרת למיון של חלקיקים בודדים שיכול לשמש לטיפוח או ניתוחים במורד הזרם, כגון הבידוד של DNA, RNA, או חלבונים. Copas תוכנן בתחילה לניתוח ומיון של אורגניזמים רב תאיים קטנים, כגון elegans נמטודות Caenorhabditis 9, ועוברי דרוזופילה וזחלי 10. המכשירים יש גם שימשו ל11 דג הזברהnd ל12,13 פטריות פילמנטיות. גם אורגניזמים האחרונים יוצרים כדורי mycelial שהם אפילו גדולים יותר מאלה שנוצרו על ידי חיידקי פילמנטיות. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי השימוש בCopas הוא גם ריאלי עבור streptomycetes 4. אנחנו כאן מתארים את ההליך הניסיוני לשימוש בCopas כדי להעריך את ההטרוגניות גלולה בcoelicolor Streptomyces, כולל פרטים על המתודולוגיה למיין כדורים לפי גודל. שים לב, עם זאת, כי בשיטה זו יכולה לשמש גם לניתוח streptomycetes יוצרי גלולה האחר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes הם חיידקי אדמת פילמנטיות המשמשים בתעשייה לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה. כאשר גדלו בbioreactors, אורגניזמים אלה יוצרים רשתות של העובש ביניהם, המכונה כדורים, שהם הטרוגניים בגודל. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח ולכדורים מסוג mycelial באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן (Copas). מקבלות הוראות מפורטות לשימוש במכשיר ואת הניתוח הסטטיסטי הבסיסי של הנתונים. יתר על כן אנו מתארים כיצד ניתן למיין כדורים בהתאם להגדרות משתמש מוגדר, המאפשר עיבוד במורד הזרם, כגון הניתוח של RNA או תכולת חלבון. שימוש במתודולוגיה זו ניתן לטפל הצמיחה הטרוגנית הבסיסית המנגנון. זה יהיה סייע לשיפור streptomycetes כמפעל תא, בהתחשב בעובדה שהפריון בקורלציה עם גודל גלולה.

מדידות Copas של כדורי Streptomyces Streptomycetes יוצר כדורי mycelial בתרבויות נוזליים שיש להם מגוון רחב של גדלים. כדי לנתח את התפלגות גודל גלולה, נוזל 2 יום ישן תרבות coelicolor Streptomyces גדלה היה נתון לזרימת חלקיקים גדולה cytometry באמצעות Copas פלוס Profiler מצויד בזרבובית של 1 מ&quot;מ. פלט Copas טיפוסי הוא עלילת פיזור כגון דמיינו באיור 2 א. ציר x מייצג את (TOF) בזמן של הטיסה, אשר עולה בקנה עם גודל גלולה (כלומר זה לוקח יותר זמן לכדורים גדולים יותר כדי להעביר את קרן הלייזר). ציר ה-Y מציגה את ההכחדה, המייצגת את הצפיפות האופטית של האובייקט. כל נקודה בעלילת הפיזור מתאימה לאירוע בודד, כלומר גלולה אחת שעוברת את קרן הלייזר. חשוב לציין, כאשר המדגם מרוכז מדי (כלומר, כאשר הלייזר מזהה יותר מ -100 אירועים / sec), Copas לעתים קרובות לא מצליח לזהות את p פרטellets. זה מוביל לערכי TOF שווא, כי הם גבוהים מדי. דילול המדגם מפחית את ערכי TOF ממוצע, עד לנקודה שבה מדלל נוסף עושה אין השפעה ארוכה יותר TOF. הוא הגיע לנקודה זו, כאשר כ 100 כדורים / sec נותחו. שרטוט נקודות נתונים להיסטוגרמה מצביע על כך שהגדלים אינם מתפלגים נורמלי (איור 2). החלוקה נראית להיות מוטה לצד ימין. התחבר הפיכת ערכת הנתונים גם לא הוביל להתפלגות נורמלית (איור 2 ג). כדי להעריך אם התפלגות הגודל יכולה להיות מוסברת על ידי הנחה בתערובת של שתי התפלגויות נורמליות נתונים היה במתכונת 12,15 מתמטית. דוגמנות אכן ציינה כי התפלגות הגודל יכולה להיות מוסברת על ידי הנחת שקיומם של שתי אוכלוסיות שונות של כדורים. האוכלוסייה של כדורים קטנים כללה 92% מהכדורים בגודל ממוצע של 248 מיקרומטר, ואילו האוכלוסייה של פל הגדולמאפשר לי (8% מכל כדורים) היו בגודל ממוצע של 319 מיקרומטר (שים לב ששתי אוכלוסיות הם הניחו להתקיים כאשר חלק קטן ההשתתפות הוא בין 2.5-97.5%). מיון של כדורי Streptomyces לפי גודל מיקרו-מושבות מהאוכלוסיות של כדורים קטנים וגדולים מוינו. לשם כך, גדלי גלולה הממוצע של שתי האוכלוסיות שימשו כדי להגדיר את הגבולות למיון. פלטות קטנות יותר מאשר 248 מיקרומטר נחשבו מאוכלוסיית גלולה הקטנה, ואילו כדורים גדולים יותר מאשר 319 מיקרומטר נחשבו מאוכלוסיית הכדור הגדולה (איור 3), כדי להגביל את המיון של כדורים מהחלק החופף של הגודל שני הפצות. ניתוח מיקרוסקופי של כדורים ממוינים הראה הגדלים שונים שלהם (איור 3). כדורים שנאספו יכולים לשמש עוד לדנ&quot;א, רנ&quot;א, או בידודי חלבון. &lt;גובה img = &quot;איור 1&quot; עבור: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; src איור 1. ייצוג סכמטי של הגדרת הניסוי כדי למדוד ולנתח את כדורי Streptomyces באמצעות Copas. לפרטים ראו בפרוצדורות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> איור 2. ההטרוגניות גודל גלולה בתרבויות Streptomyces-גדל נוזליים. ניתוח Copas של ס &#39;2 ימים בת תרבות YEME coelicolor () מצביעה על כך שגדלי גלולה (המסומנים כזמן של ערכי טיסה) הם בדרך כלל לא להפיץד (ב), ולא להיות כל כך כש- הפך יומן (C). במקום זאת, שתי אוכלוסיות של כדורים שונים בTOF (ובכך גודל) התגלו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> איור 3. חלוקה של כדורי Streptomyces לפי גודל. פלטות בגודל קטן יותר מ248 מיקרומטר (מסומנים בורוד) נחשבו לכדורים קטנים, ואילו כדורים בגודל גדול יותר מ319 מיקרומטר (מסומן בכחול) נחשבו לכדורים גדולים. ניתוח מיקרוסקופי אישר את ההבדל בגודל. שים לב שגדלים אלה חושבו מהנתונים הפכו יומן באמצעות היחסים המתוארים בין TOF ודiameter של גלולה Streptomyces, אשר שווה 0.57 × TOF + 159 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

תרבויות Streptomyces-גדל נוזל מאופיינים בכדורי mycelial כי הם הטרוגנית בגודל. אנחנו כאן מתארים שיטה לניתוח וסוג כזה כדורים באופן תפוקה גבוהה. כדורים אלה יכולים לשמש לניתוחים נוספים, אשר יספק מוביל להבין ולשלוט ההטרוגניות צמיחה.

מיון של<em&gt; Streptomyces</em&gt; פלטות ניידים באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

Multi-פרמטרית Perifusion איילט מערכת בתוך התקן Perifusion Microfluidic

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

לבודד רנ"א ספציפיים לסוג תא מדגימות רקמות הטרוגניות קפואות ללא מיון תאים

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...