Name: sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Fremgangsmåten for å analysere og sortere Streptomyces pellets fra en to-dagers gammel væske-vokst kultur er skjematisk representert i figur 1. Detaljer for fremgangsmåten er angitt nedenfor. En. Vekst (herunder utarbeidelse av medier og buffere) <ol><li> Tilbered en L av 10x fosfatbufret saltvann (PBS, 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na HPO 2 til 4, 2,4 g KH PO 2 4 i 1 l destillert vann justert til pH 7,4). Ved tidspunktet for bruk tilsett 100 ml 10 x PBS til 900 ml med destillert vann for å oppnå en L PBS. </li><li> Tilbered en L av YEME-medium (3 g Difco gjærekstrakt, 5 g Bacto pepton, 3 g Oxoid maltekstrakt, 10 g glukose, 340 g sukrose, destillert vann opp til 1 L) og 100 ml 2,5 M MgCl2. Steriliser begge løsninger ved autoklavering. Merk at også andre Streptomyces medier kan brukes til 4,14. </li><li> Tilsett 100 ml YEME medium og 0,2 ml 2,5 M MgCl 2 til ensterile 250 ml Erlenmeyer-kolbe utstyrt med metall kveilet fjærer. Forbered så mange kolber som bakterieprøver for å studere. </li><li> Inokuler hver kolbe med 10 8 sporer av Streptomyces å oppnå en sporekonsentrasjon på 10 6 sporer / ml. Grow bakterier for to dager ved 30 ° C mens rist ved 180 rpm. </li></ol> 2. Sampling <ol><li> Overfør en 5 ml prøve fra hver kultur til et 15 ml Falcon rør ved hjelp av en steril 5 ml pipette. Rist kulturen mens man tar prøven for å sikre at prøven er representativ for hele kulturen. </li><li> Når prøvene er analysert umiddelbart med empleo ingen prøveopparbeidelse tiltak er nødvendig. Hold prøven på is og gå videre til trinn 3.1 av denne protokollen. Når prøvene er analysert på et senere tidspunkt, løse pellets som er beskrevet i trinn 2.3 til 2.5 i denne protokollen. Legg merke til at fikseringen også hindrer vekst av bakterier i rør-systemet når det skal rengjøres etter analyses. Sørg for at fiksering med formaldehyd ikke hindrer nedstrøms analyser. For eksempel, RNA ble ikke isolert fra sopp pellets etter fiksering med formaldehyd. I kontrast, ble RNA isolert med hell etter fiksering med 70% etanol 12. </li><li> Til 600 ul av 37% formaldehyd i 5 ml av prøven og blandes ved å snu røret 3x. Fiks prøvene på is i 30 min. </li><li> Sentrifuger prøvene ved 2500 x g i en fast rotor ved 4 ° C i 10 min. Fjern forsiktig supernatanten og vask pellets med 5 ml PBS. </li><li> Gjenta trinn 2.4, slik at pelletene blir vasket med PBS 2x. Prøvene kan lagres i PBS ved 4 ° C i flere uker. </li></ol> Tre. Copas Analysis <ol><li> Kontroller at Copas Plus, pumpen, datamaskinen og 488 nm argon laser er slått på og starte Biosort programvare. Selv slått på, vil laseren fortsatt være i standby-modus. </li><li> Sjekk om skjede væske flasken er full ogavfalls flasken er tom. </li><li> Klikk &quot;Start&quot; og deretter &quot;Kjør&quot; for å slå den 488 nm argonlaser fra standby til på. Etter ca 60 sek, når laseren er på, klikker du på &quot;Done&quot;. </li><li> Kontroller trykkmålere. Presset for &#39;skjede &quot;,&quot; Sample &quot;,&quot; Sortering&#39; og &#39;rent&#39; bør lese rundt 4,0, 0,5, 2,7, og 10,9 kroner. </li><li> Klikk på boksen ved siden av &quot;Pressure OK &#39;. Systemet deretter primer strømningscellen, og er klar til bruk. </li><li> Standardinnstillingene er antatt med Stans &#39;på 11 og&#39; Bredde &#39;syv. Terskelverdier er angitt ved 50 for &#39;Signal&#39; og 40 for &#39;TOF Minimum &quot;, med TOF representerer time-of-flight. (For fullstendighet: alle &quot;Gevinst&quot; er satt til 1, avtrekkeren er satt til EXT (Extinction) og i kategorien &#39;Konfigurasjon&#39; under &#39;Velg scan rate&#39; 2,50 MHz valgt Tilfeldighet er satt til &#39;Forbedret&#39;.). </li><li> Fjern restene vann fra prøvekoppen end legg 0,1 ml av Streptomyces prøven fra trinn 2.2 eller 2.5 i koppen sammen med PBS (ca. 50 ml). Kontroller at prøvekopp er skikkelig lukket. </li><li> Klikk på &#39;Hent&#39; for å begynne å samle inn data. Håndtere strømmen hastighet for å få mellom 30-50 hendelser per sekund. Hvis vannmengden er for høy, tilsett PBS til prøvekoppen. Hvis flyten hastigheten er for lav, legge mer prøven. </li><li> Når minst 2500 hendelser samles klikk &#39;STOP&#39;. For å lagre all data klikk &#39;Lagre&#39; og lagre filen for senere statistisk analyse. Den Biosort programvaren vil lagre dataene i fire filer, hvorav bare det. Txt fil vil bli brukt for den påfølgende analysen. </li><li> Rengjør prøvekoppen ved å fjerne prøven med en 50 ml sprøyte og vasking med vann 2x. </li><li> Gjenta trinn 3.7 til 3.10 inntil alle prøver blir analysert. </li></ol> 4. Data Analysis <ol><li> Åpne. Txt-fil og kast data med en EXT lavere enn 25 (ved hjelp av for eksempel MS Excel). Dettetilsvarer rusk og løse hyphal fragmenter (for Aspergillus niger alle data med en EXT lavere enn 150 forkastes) 4,12. Deretter lagrer alle TOFS i en kolonne i en vanlig &#39;txt.&#39; Filen (for mange datafiler dette kan automatiseres i programmeringsspråket R, tilgjengelig fra: <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Sørg Scilab (versjon 5.3.2 eller nyere fra http://www.scilab.org/) er installert sammen med &quot;fittools &#39;bibliotek, som er tilgjengelig, sammen med den manuelle, fra: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Begynn Scilab og kjøre de nødvendige funksjonene i fittools biblioteket for å modellere dataene. Kort sagt: Installer fittools bibliotek som vist i manualen (kun trengte én gang). <ol><li> Laste fittools bibliotek. </li><li> Les data (&#39;txt.&#39; Fil) inn Scilab. </li><li>Logg transformere dataene (naturlig log er standardloggfunksjon). </li><li> Monter modell av to populasjoner til dataene. </li><li> Plotte en graf med histogram og modell (valgfritt). </li><li> Bootstrap dataene (1000 replikat). </li><li> Monter modellen til de bootstrapped datasett. </li><li> Få konfidensintervallene estimater av de fem parametrene. Dette vil gi informasjon om deltakelse fraksjon (p) av befolkningen, deres to midler (μ 1 og μ 2) og de ​​tilhørende standardavvik (α 1 og α 2). Videre er 95% konfidensintervall bestemmes ved montering med modellen etter at bootstrapping (1000 replikat) 12,13,15. Når konfidensintervaller av middel ikke overlapper hverandre, og konfidensintervallet for p er mellom 0,025 til 0,975 datasettet kan forklares som en kombinasjon av to populasjoner av normalfordelinger. (Merk thved medvirkning brøkdel av små pellets er p, mens deltakelse av store pellets er 1. -. p.) Forhold mellom TOF og diameteren av en Streptomyces pellet lik 0,57 x TOF + 159 mikrometer 4.. </li></ol></li><li> I tilfelle to populasjoner er funnet bruk gjennomsnittlig TOFS som sortering parametere i Copas som øvre og nedre grensen for å sortere de små og store pellets senere. Merk at også andre sortering parametere kan velges avhengig av krav til brukeren. </li></ol> 5. Pellet Sorting <ol><li> Legg Streptomyces prøven som skal sorteres, som beskrevet i trinn 3.7. </li><li> Sett &#39;Sortering Limits &quot;og gi detaljer om minimal (Lo) og maksimal (Hi) TOF verdier. Alternativt kan du stille et område ved å velge &quot;Regioner&quot; og deretter &quot;Define Gate Region &#39;for å velge pellets med de ønskede dimensjoner eller egenskaper. </li><li> Plasser en 50 ml tube tilsamle flere pellets som oppfyller sortering parametere. Alternativt kan en mikro-titer-plate brukes for å sortere individuelle pellets. Flere pellets (10 4 -10 5) er nødvendig for DNA-og proteinutvinning. En enkelt pellet er tilstrekkelig for qPCR analyse av genekspresjon, men flere pellets er nødvendig for RNA-sekvensering. </li><li> Bestem og angi antall pellets som må sorteres og klikk &#39;Sorter manuelt&#39; for å sortere for de utvalgte parametre. Når den innstilte mengden av pellets er nådd, avsluttes sortering automatisk. </li><li> Ta til venstre over prøven med en 50 ml sprøyte fra prøvekoppen og vaske koppen med vann 2x. Gjenta trinn 05.01 til 05.05 hvis andre prøver må sorteres. </li><li> Før nedleggelse empleo skylle prøvekopp med vann for å fjerne de resterende pellets og rengjør prøvekopp med 70% EtOH og / eller 2% hypokloritt i vann. Kjør en prøve av klorvann for å rense hele systemet, og gjenta dette med vann. Tom than flomme over beholderen og rengjør eller skift filteret som ligger i denne beholderen. </li><li> Når du er ferdig, klikk &quot;STOP&quot; for å slippe ut trykket fra systemet. Når motoren stopper lukker programmet og klikk &quot;Shutdown uten sletting &#39;. Slå deretter av datamaskinen, den Copas, laseren, og pumpen. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Flowcytometri har aktivert høyhastighets analyse av et stort antall enkeltceller, noe som bidro til vår forståelse av heterogenitet i klonale populasjoner seks. Vanlig flowcytometri er ikke mulig for analyse av de flercellede mycelie pellets av streptomycetes og sopp. Vårt arbeid har vist at høy-throughput analyser av Streptomyces pellets er mulig ved hjelp av Copas. Prosedyren er skissert her er enkel, rask, og reproduserbar. Den kritiske parameter å huske på under bruk av instrumentet er flyten hastighet, noe som ikke bør overstige 100 hendelser / sek (trinn 3,8 av denne protokollen). Dersom pelleten konsentrasjon, og derved også strømningshastigheten blir for høy, vil de TOF verdiene miscalculated fordi apparatet ikke klarer å påvise individuelle pellets. Tilstrekkelig fortynne prøven ved tilsetning av PBS overvinner dette problem. Begrensninger Den Copas Plus bruk<html> d her har et munnstykke med diameter 1 mm, som er egnet for måling av partikler med en størrelse i området 30 til 700 mikrometer. Dette munnstykket kan derfor måle pellets dannet av streptomycetes. I tilfelle av filamentøse fungi mikrokoloniene kan være større, noe som begrenser den generelle anvendbarhet av Copas Plus. Den Copas XL kan måle partikler opp til 1500 mikrometer i størrelse, men dens følsomhet i det nedre område av diameter er mindre i forhold til den av Copas Plus. Både Copas Plus og Copas XL kan analysere partikler mindre enn 30 mikrometer. Dette innebærer at de enkelte sporer eller mikrobielle celler ikke kan analyseres. I tillegg kan Copas ikke nøyaktig analysere små aggregater av sporer og celler eller de meget små mikro-kolonier. For dette bør vanlige celleanalyseutstyr kan brukes. Denne begrensning overvinnes med fore Biosorter av Union Biometrica, som kan analysere partikler i området fra 1-1,500 mikrometer. Kjøpet premien er imidlertid høyere. t &quot;&gt; Feilsøking Den Copas er et robust instrument som er lett å betjene. Imidlertid, og til pellets er ikke detektert etter innlasting av en prøve i prøvekoppen og start av målingen. Årsaken er vanligvis en tett oppføring tube, som enkelt kan løses ved å trykke på &#39;rent&#39; kommando. Dette vil tvinge de pellets tilbake fra rørsystem inn i prøvekoppen. En alternativ grunn kan være at lokket ikke er riktig plassert på prøvekoppen. Dette fører til trykktap og samtidig unnlatelse av å detektere pellets. Betydning og fremtidige retninger Vi her fokusert på analyse av pellet størrelse, men empleo oppsettet er også i stand til å analysere og sortere basert på fluorescens og tetthet. Fluorescensdeteksjon gjør oss i stand til å analysere genuttrykk basert på journalister som GFP. Videre kan sammensetningen av cellene bli vurdert. Enda kraftigere er muligheten til å skille pellets i henhold til disse pararegistre. Sortert pellets kan anvendes for nedstrøms analyser, herunder alle-omics studier. Ja, vi tidligere sortert 60000 store og 200.000 små pellets, og viste at proteomet var signifikant forskjellig mellom store og små pellets fire. Denne teknologien gir derfor nye kunder for å forbedre streptomycetes som cellefabrikker. Den viktigste fordelen av Copas teknologien er på tide. Tidligere studier av cellepelletene ble utført ved hjelp av mikroskopi, og dette begrenser antallet pellets som kan analyseres opptil flere hundre 16. Mikros studier allerede foreslått eksistensen av to populasjoner av pellets i væske vokst Streptomyces kulturer 16. Faktisk ble to populasjoner av pellets detektert uavhengig av dyrkningsbetingelser i et stort antall forskjellige streptomycetes 4. Denne størrelsesheterogeniteten er ikke begrenset til trådformede streptomycetes, men ble også observert i filamentøse sopp 12 &lt;/ Sup&gt;. I alle tilfeller blir de underliggende mekanismer for heterogenitet ennå ikke kjent. Muligheten til å sortere pellets i henhold til størrelse og fluorescens gjør oss i stand til å løse slike mekanismer.

Streptomycetes er trådformede jordbakterier som er godt kjent for sine ferdigheter for å gjøre antibiotika, så vel som forbindelser som kan brukes som immunsuppressiva, eller for å bekjempe sopp-infeksjoner eller cancer 1,2. I tillegg er disse organismer produserer enzymer som er av interesse for en rekke industrielle anvendelser 3. De fleste av disse er kommersielt interessante forbindelser er produsert i bioreaktorer. Vekst av streptomycetes i bioreaktorer er karakterisert ved dannelsen av komplekse strukturer av sammenknyttede hyfer, kjent som klumper eller pelleter. Disse flercellede strukturer er svært heterogen med hensyn til størrelse 4 og kan nå størrelser som er mer enn en million ganger større enn en encellet bakterie som Escherichia coli eller Bacillus subtilis. Selv om heterogenitet regnes som en gunstig egenskap i naturlige biologiske systemer 5, regnes det som en produksjonsfallgruve i bransjen. BioReaktor cultivations må være reproduserbar og kontrollerbar å oppnå høyest mulig avkastning. En detaljert forståelse av rollen til hver av de typer pellets i en bioreaktor er derfor viktig å forbedre streptomycetes som en cellefabrikk. Flowcytometri er ofte brukt til å analysere enkeltceller i en befolkning seks. Flowcytometere kan skaffe multiparametric informasjon ved samtidig måling av egenskapene til cellene (slik som størrelse, densitet og flerfarget fluorescens). På denne måte kan celleegenskaper korreleres og dermed bidra til forståelsen av heterogenitet i en kultur og eksistensen av distinkte populasjoner av celler 6. Mer spesialiserte instrumenter har gjort det mulig å sortere celler i henhold til brukerdefinerte parametere. For eksempel, kan mutanter bli vist. Etter sortering, kan slike muterte celler dyrkes for videre karakterisering. Det har allerede vist seg å være nyttige, blant annetå øke produktiviteten til stammer 7,8. Dysene i flowcytometere vanligvis tillater passasje av celler med en maksimal diameter på omtrent 10 mikrometer. Derfor kan pellets av streptomycetes ikke bli analysert med jevne flowcytometere. De kan imidlertid bli analysert med Complex Object Parametric Analyzer og Sortering (Copas). Som vanlige flowcytometere kan Copas skaffe multiparametric data for partikler i en høy gjennomstrømning måte. Avhengig av typen av Copas 10-1,500 mikrometer store partikler kan analyseres. Dessuten gir det mulighet for sortering av individuelle partikler som kan brukes for dyrking eller nedstrøms-analyser, slik som isolering av DNA, RNA eller proteiner. Copas ble opprinnelig designet for analyse og sortering av små flercellede organismer, slik som nematode Caenorhabditis elegans 9, og Drosophila embryoer og larver 10. Instrumentene har også blitt brukt for sebrafisk 11 and for trådformede sopp 12,13. De sistnevnte organismer også danne myceliske pellets som er enda større enn det som er dannet av trådformede bakterier. Vi har nylig vist at bruken av Copas er også mulig for streptomycetes 4. Vi her beskrive den eksperimentelle prosedyren for bruk av empleo å vurdere pellet heterogenitet i Streptomyces coelicolor, inkludert detaljer om metodikk for å sortere pellets etter størrelse. Legg imidlertid merke til, at denne metoden kan også benyttes for analyse av andre pellet-dannende streptomycetes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes er trådformede jordbakterier som brukes i industrien for produksjon av enzymer og antibiotika. Når dyrket i bioreaktorer, disse organismene lagar nettverk av sammenhengende hyfer, kjent som pellets, som er heterogene i størrelse. Her beskriver vi en metode for å analysere og sortere myceliske pellets ved hjelp av et komplekst objekt Parametrisk Analyzer og Sortering (Copas). Detaljerte instruksjoner for bruken av apparatet og den grunnleggende statistisk analyse av dataene. Vi beskriver videre hvordan pellets kan sorteres i henhold til brukerdefinerte, noe som gjør det mulig for nedstrøms prosessering slik som analyse av RNA eller protein-innhold. Ved hjelp av denne metoden mekanismen underliggende heterogene vekst kan takles. Dette vil være medvirkende til å forbedre streptomycetes som en cellefabrikk, med tanke på at produktiviteten korrelerer med pellet størrelse.

Copas målinger av Streptomyces pellets Streptomycetes danne myceliske pellets i flytende kulturer som har et bredt spekter av størrelser. For å analysere pellet størrelsesfordeling, en 2-dagers gamle væske dyrkes Streptomyces coelicolor Kulturen ble utsatt for stor partikkel strømningscytometri ved bruk av en Copas Plus Profiler utstyrt med en 1 mm dyse. En typisk empleo utgang er et spredningsdiagram som visualisert i figur 2A. X-aksen representerer tiden-of-flight (TOF), som korrelerer med pellet-størrelse (dvs. at det tar lengre tid for større pellets til å passere laserstrålen). Y-aksen viser den utryddelse, som representerer den optiske tettheten av gjenstanden. Hvert punkt i spredningsdiagrammet tilsvarer en enkelt hendelse, det vil si en enkelt pellet som passerer laserstrålen. Viktigere, når prøven er for konsentrert (dvs. når laseren registrerer mer enn 100 arrangementer / sek), den Copas ofte ikke klarer å oppdage enkelte pellets. Dette fører til falske TOF verdier som er for høy. Fortynne prøven reduserer gjennomsnittlig TOF verdier, opp til et punkt der ytterligere fortynning gjør ikke lenger innvirkning TOF. Dette punktet er nådd når ca 100 pellets / sek ble analysert. Plotting av datapunktene i et histogram indikerer at størrelsene ikke er normalfordelt (figur 2B). Fordelingen ser ut til å være skjev til høyre. Logg transformere datasettet heller ikke føre til en normalfordeling (figur 2C). For å vurdere om størrelsesfordeling kan forklares ved å anta en blanding av to normalfordelinger dataene ble matematisk modellert 12,15. Modellering faktisk tydet på at størrelsesfordelingen kan forklares ved å anta at det finnes to distinkte populasjoner av pellets. Populasjonen av små pellets besto av 92% av alle pellets med en midlere størrelse på 248 mikrometer, mens den populasjon av store pellar (8% av alle pellets) hadde en gjennomsnittlig størrelse på 319 mikrometer (merk at to populasjoner antas å foreligge når deltakelse brøkdel er mellom 2,5 til 97,5%). Sortering av Streptomyces pellets etter størrelse Mikro-kolonier fra bestander av store og små pellets ble sortert. For dette formål, ble den gjennomsnittlige pelletsstørrelser av de to populasjoner som brukes for å definere grensene for sortering. Pellets som er mindre enn 248 mikrometer ble ansett å være fra de små pellets populasjonen, mens pellets som er større enn 319 mikrometer ble ansett for å være av stor pellet populasjonen (figur 3), for å begrense sortering av pellets av det overlappende parti av de to størrelser distribusjoner. Mikroskopisk analyse av sorterte pellets viste sine distinkte størrelser (figur 3). De oppsamlede pelleter kan videre brukes for DNA, RNA eller protein isoleringer. &lt;img alt = &quot;Figur 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figur 1. Skjematisk fremstilling av det eksperimentelle oppsettet for å måle og analysere Streptomyces pellets ved hjelp empleo. For detaljer, se eksperimentelle prosedyrer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figur 2. Pelletstørr heterogenitet i væske vokst Streptomyces kulturer. Copas analyse av en to-dagers gammel S. coelicolor YEME kultur (A) indikerer at pelletsstørrelser (angitt som Time of Flight verdier) er normalt ikke distribuered (B), og heller ikke blir så når log-transformert (C). I stedet ble to populasjoner av pellets som varierer i TOF (og dermed størrelse) oppdaget. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figur 3. Fraksjonering av Streptomyces pellets etter størrelse. Pellets med en størrelse mindre enn 248 mikrometer (angitt i rosa) ble vurdert til å være små pellets, mens pellets med en størrelse større enn 319 mikrometer (markert med blått) ble ansett å være store pellets. Mikroskopisk analyse bekreftet at forskjellen i størrelse. Merk at disse størrelsene ble beregnet ut fra de log-transformerte data ved hjelp av den beskrevne forholdet mellom TOF og diameter av en Streptomyces pellets, noe som tilsvarer 0,57 × TOF + 159 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større bilde.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Væske dyrkes Streptomyces kulturer er kjennetegnet ved mycelie pellets som er heterogene i størrelse. Vi her beskrive en metode for å analysere og sortere slike pellets i en high-throughput måte. Disse pellets kan anvendes for videre analyser, som vil gi ledninger for å forstå og kontrollere veksten heterogenitet.

Sortering av<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cell Pellets Bruke et komplekst objekt Parametrisk Analyzer og Sortering

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell konkret analyse av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Leaves med fluorescens Aktivert Cell Sortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescensaktivert cellesortering for isolering av sklerractiniske cellepopulasjoner

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bruke sanntidscelle metabolsk fluksanalysator for å overvåke osteoblastbioenergetikk

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Isoler celletypespesifikke RNAer fra snapfrosne heterogene vevsprøver uten cellesortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...