Name: sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Процедура для анализа и сортировки Streptomyces гранул из двух-дневных жидкого выращенных культуры схематически представлено на рисунке 1. Подробная информация для метода приведены ниже. 1. Рост (в том числе подготовка медиа и буферов) <ol><li> Подготовка 1 мкл 10X забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, 80 г NaCl, 2 г KCl, 14,4 г Na 2 HPO 4, 2,4 г KH 2 PO 4 в 1 л дистиллированной воды доводили до рН 7,4). В момент использования прибавляют 100 мл 10х PBS до 900 мл дистиллированной воды, чтобы получить 1 л PBS. </li><li> Подготовка 1 л среды YEME (3 г Difco дрожжевого экстракта, 5 г Бакто пептон, 3 г Oxoid солодовый экстракт 10 г глюкозы, 340 г сахарозы, дистиллированная вода до 1 л) и 100 мл 2,5 М MgCl 2. Стерилизовать оба решения в автоклаве. Следует отметить, что и другие Streptomyces носители могут использоваться 4,14. </li><li> Добавить 100 мл YEME среду и 0,2 мл 2,5 М MgCl 2 встерильный 250 мл колбу Эрленмейера, оснащены металлическими спиральный пружин. Подготовьте столько колб как бактериальные образцы для изучения. </li><li> Инокулировать каждую колбу с 10 8 спор Streptomyces, чтобы получить концентрацию спор 10 6 спор / мл. Расти бактерии в течение 2 дней при 30 ° С при встряхивании при 180 оборотах в минуту. </li></ol> 2. Выборка <ol><li> Трансфер образец в 5 мл из каждой культуры к 15 мл трубки Сокол, используя стерильный 5 мл пипетки. Аккуратно встряхните культуру, принимая образец для того, чтобы выборка является репрезентативной для всей культуры. </li><li> При анализе проб сразу с Copas никаких шагов подготовки образца не требуется. Держите образец на льду и перейдите к шагу 3.1 этого протокола. При анализе проб на более позднем этапе, исправить гранул, как описано в шагах 2,3-2,5 этого протокола. Обратите внимание, что фиксация также предотвращает рост бактерий в системе труб, когда не правильно чистить после Analysэс. Убедитесь, что фиксация с формальдегида не препятствует вниз по течению анализы. Например, РНК не может быть изолирована от грибковых гранул после фиксации с формальдегидом. В противоположность этому, РНК был успешно выделен после фиксации 70% этанолом 12. </li><li> Добавить 600 мкл 37%-ного формальдегида в 5 мл образца и перемешать путем обращения трубки 3 раза. Fix образцы на льду в течение 30 мин. </li><li> Центрифуга образцов при 2500 х г в фиксированном ротора при 4 ° С в течение 10 мин. Осторожно удалите супернатант и мыть гранул с 5 мл PBS. </li><li> Повторите шаг 2,4 так, чтобы гранулы промывают PBS 2х. Образцы могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких недель. </li></ol> 3. Copas Анализ <ol><li> Убедитесь, что Copas Плюс, насос, компьютер и аргоновый лазер 488 нм включены и запустить программное обеспечение Biosort. Хотя включена, лазер будет по-прежнему в режиме ожидания модуса. </li><li> Проверьте, если бутылка оболочка жидкости заполнен иемкость для отработанных пуст. </li><li> Нажмите кнопку &quot;Пуск&quot;, а затем &quot;Выполнить&quot; для переключения аргоновый лазер на 488 нм из режима ожидания в на. После примерно 60 сек, когда лазер включен, нажмите &quot;Готово&quot;. </li><li> Проверьте манометров. Давления для &#39;оболочка&#39;, &#39;Образец&#39;, &#39;сортировщик &quot;и&quot; чистых &quot;следует читать вокруг 4.0, 0.5, 2.7, и 10.9 соответственно. </li><li> Установите флажок рядом с &quot;Давление OK». Затем система простые числа проточную ячейку и готов к использованию. </li><li> Стандартные настройки предполагаются с &#39;Delay&#39; в 11 и &#39;Ширина&#39; 7. Пороги устанавливаются на 50 для «Сигнал» и 40 для «TOF минимум&quot;, с TOF, представляющего время-рейс. (Для полноты: все &quot;Доходы&quot; устанавливаются на 1, триггер устанавливается в EXT (Extinction) и на вкладке &quot;Настройки» под &#39;Выберите скорость сканирования »2.50 МГц выбирается Совпадение установлен в&#39; Enhanced &#39;.). </li><li> Удалите оставшиеся воду из образца чашки апD добавить 0,1 мл образца Streptomyces с шага 2,2 или 2,5 в чашке вместе с PBS (около 50 мл). Убедитесь, что образец чашки плотно закрыта. </li><li> Нажмите &quot;Acquire&quot;, чтобы начать сбор данных. Управление скорость подачи для получения 30-50 событий в секунду. Если расход слишком высока, добавить PBS в кювету для образца. Если скорость потока слишком низкая, добавить больше образца. </li><li> Когда по меньшей мере 2500 события собраны нажмите кнопку &quot;Остановить&quot;. Чтобы сохранить все данные нажмите на ссылку &quot;магазин&quot; и сохраните файл для последующего статистического анализа. Программное обеспечение Biosort будет сохранять данные в четырех файлов, из которых только файл. TXT будет использоваться для последующего анализа. </li><li> Очистите образца чашку, удалив образец с помощью шприца по 50 мл и промывают водой 2х. </li><li> Повторите шаги 3.7-3.10, пока все образцы не анализируются. </li></ol> 4. Анализ данных <ol><li> Откройте файл. Текстовый и отбросить данные с EXT ниже 25 (с использованием, например, MS Excel). Этосоответствует мусора и сыпучих фрагментов гиф (для Aspergillus Нигер все данные со EXT ниже 150 отбрасываются) 4,12. Затем сохраните все тофы в одну колонку на равнине файл (для многих файлов данных это может быть автоматизировано на языке программирования R, Доступна с: &#39;TXT.&#39; <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Убедитесь SciLab (версия 5.3.2 или более поздней версии с http://www.scilab.org/) устанавливается вместе с библиотекой &quot;fittools&quot;, которая доступна, вместе с руководством, от: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Начните Scilab и запустить необходимые функции библиотеки fittools для моделирования данных. Короче говоря: Установите библиотеку fittools как показано в руководстве (требуется только один раз). <ol><li> Загрузите библиотеку fittools. </li><li> Считывание данных (&#39;. TXT &quot;файлов) в SciLab. </li><li>Войти преобразования данных (натуральный логарифм является функция журнала по умолчанию). </li><li> Установите модель 2 населения к данным. </li><li> Постройте график с гистограммы и модели (по желанию). </li><li> BootStrap данные (1000 повторах). </li><li> Установите модель к бутстрепа данных. </li><li> Получить при доверительном интервале оценочные 5 параметров. Это даст информацию о фракции участия (р) популяций, их 2 средствами (μ 1 и μ 2) и прилагаемая стандартных отклонения (α 1 и α 2). Кроме того, 95% доверительные интервалы определяются установкой с моделью после начальной загрузки (1000 повторов) 12,13,15. Когда доверительные интервалы средств не перекрываются, а доверительный интервал р между 0.025-0.975 набор данных можно объяснить как сочетание двух популяций нормальных распределений. (Примечание тыс.на участие фракции мелких гранул р, в то время как участие крупных гранул 1 -. р) Отношения между TOF и диаметра гранулы Streptomyces равна 0,57 × TOF + 159 мкм 4. </li></ol></li><li> В случае две популяции встречаются использование средние тофы как сортировка параметры в Copas как верхняя и нижняя граница для сортировки мелких и крупных гранул впоследствии. Обратите внимание, что и другие сортировки параметры могут быть выбраны в зависимости от требований пользователя. </li></ol> 5. Пелле Сортировка <ol><li> Загрузите образец Streptomyces, который должен быть отсортированы как описано в шаге 3.7. </li><li> Установить &#39;Сортировка Limits »и представить подробную информацию о минимальном (Lo) и максимальной (Hi) значений TOF. Кроме того, установлен область, выбрав &#39;Регионы&#39;, а затем &#39;Определить Gate Регион&#39; для выбора гранул с желаемыми размерами и свойствами. </li><li> Поместите 50 мл трубки ксобрать несколько гранул, которые отвечают сортировки параметров. Кроме того, микро-титр пластина может быть использована для сортировки отдельных гранул. Несколько гранулы (10 4 -10 5) необходимы для ДНК и извлечения белка. Один гранул достаточна для КПЦР анализа экспрессии генов, но несколько гранулы необходимы для РНК-последовательности. </li><li> Решите и установить количество гранул, которые должны быть отсортированы и нажмите &quot;Сортировать вручную&quot;, чтобы разобраться для выбранных параметров. Когда устанавливается количество гранул достигается, сортировка заканчивается автоматически. </li><li> Удалить осталось образца с 50 мл шприц с образца и мыть чашку с водой в 2 раза. Повторите шаги 5.1-5.5, если другие образцы должны быть отсортированы. </li><li> Перед выключением Copas промойте образец чашку с водой, чтобы удалить оставшиеся гранулы и очистить образец чашку с 70% этанола и / или 2% раствором гипохлорита в воде. Запустите образец хлорированной воды, чтобы очистить всю систему и повторить это с водой. Пустой тон переполнение контейнера и очистить или заменить фильтр, который находится в этом контейнере. </li><li> Когда закончите, нажмите кнопку &quot;СТОП&quot;, чтобы сбросить давление из системы. Когда двигатель останавливается закрыть программу и нажмите кнопку &quot;Shutdown без продувки. Затем выключите компьютер, Copas, лазер, и насос. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Проточная цитометрия позволила высокоскоростной анализ большого числа отдельных клеток, что способствовало более глубокому пониманию гетерогенности в клоновых популяциях 6. Обычный цитометрии потока не представляется возможным для анализа многоклеточных мицелиальных гранул стрептомицетов и грибов. Наша работа показала, что с высокой пропускной анализ Streptomyces гранул является возможным использованием Copas. Процедура, описанная здесь просто, быстро и надежно воспроизводимое. Критическим параметром иметь в виду, во время работы прибора является скорость потока, которая не должна превышать 100 событий / сек (шаг 3,8 этого протокола). Если концентрация гранул, и, следовательно, скорость потока, становится слишком высокой, значения TOF будет просчет, потому что прибор не может определить отдельные гранулы. Достаточно разбавления пробы добавлением PBS преодолевает эту проблему. Недостатки Использование Copas Плюс<html> д здесь имеет диаметр сопла 1 мм, который подходит для измерения частиц с размером в диапазоне от 30-700 мкм. Это сопло поэтому позволяет измерения гранул, образованных стрептомицетов. В случае мицелиальных грибов микро-колонии может быть больше, что ограничивает общую применимость Copas Plus. Copas XL может измерять частицы до 1500 мкм по размеру, но его чувствительность в нижней части диапазона диаметром меньше по сравнению с из Copas Plus. И Copas Плюс и Copas XL не может анализировать частиц менее 30 мкм. Это означает, что отдельные микробные споры или клетки не могут быть проанализированы. Кроме того, Copas не может точно анализировать небольшие агрегаты спор и клеток или очень малых микро-колоний. Для этого, регулярные анализаторы клеток следует использовать. Это ограничение преодолевается Biosorter Юнион Biometrica, который может анализировать частицы в диапазоне 1-1,500 мкм. Приз покупку однако гораздо выше. т &quot;&gt; Устранение неполадок Copas является надежным инструментом, который прост в эксплуатации. Тем не менее, иногда гранулы не обнаружено после загрузки образца в кювету для образца и началом измерения. Причиной, как правило, забиты запись трубка, которая может быть легко решена, нажав команду &quot;чистый&quot;. Это заставит гранулы обратно из системы труб в чашку для образца. Альтернативный причиной может быть то, что крышка не должным образом размещен на кювету для образца. Это приводит к потере давления и сопутствующего необнаружения гранул. Значение и будущие направления Мы здесь сосредоточены на анализе размера гранул но установка Copas также способен анализировать и сортировать на основе флуоресценции и плотности. Обнаружение флуоресценции позволяет анализировать экспрессию генов на основе журналистами, таких как GFP. Кроме того, композиция клеток может быть оценена. Еще более мощным является возможность отделить гранулы согласно Эти показателиОслабляет. Сортировка гранулы могут быть использованы для последующих анализов, в том числе все-омик исследований. В самом деле, мы уже отсортированы 60000 больших и 200000 маленьких гранул, и показали, что протеом значительно отличается между большими и малыми гранул 4. Таким образом, эта технология обеспечивает новый, ведет к улучшению стрептомицетов как сотовые заводов. Основное преимущество технологии Copas время. Предыдущие исследования на клеточных гранул проводили с использованием микроскопа, и это ограничивает количество гранул, которые могут быть проанализированы до нескольких сотен 16. Микроскопические исследования уже предположил существование двух популяций гранул в жидких выращенных Streptomyces культур 16. Действительно, две популяции гранул были обнаружены независимо от условий культивирования в большом количестве различных актиномицетов 4. Этот размер неоднородность не ограничивается нитевидных стрептомицетов, но наблюдалось также в нитчатых грибов 12 &lt;/ SUP&gt;. Во всех случаях, основные механизмы неоднородности пока не известны. Возможность сортировать пеллеты в зависимости от размера и флуоресценции позволяет разгадать такие механизмы.

Стрептомицетов являются нитевидные почвенные бактерии, которые хорошо известны за их знания, чтобы сделать антибиотики, а также соединения, которые могут быть использованы в качестве иммунодепрессантов или для борьбы с грибковыми инфекциями или рака 1,2. Кроме того, эти организмы вырабатывают ферменты, которые представляют интерес для широкого спектра промышленных применений 3. Большинство из этих коммерчески интересных соединений производятся в биореакторах. Рост стрептомицетов в биореакторах характеризуется образованием сложных структур взаимосвязанных гиф, известных как комки или гранулы. Эти многоклеточные структуры весьма неоднородны в отношении размера 4 и может достигать размеров, которые более чем в миллион раз больше, чем одноклеточного бактерии, такие как кишечная палочка или Сенная палочка. Хотя неоднородность рассматривается как полезного признака в естественных биологических системах 5, считается, производство ловушка в промышленности. Биореакторные культивации должны быть воспроизводимым и управляемым, чтобы получить максимально возможные урожаи. Детальное понимание роли каждого из типов гранул в биореакторе Поэтому крайне важно, чтобы улучшить стрептомицетов как клеточной фабрики. Проточная цитометрия обычно используется для анализа отдельных клеток в популяции 6. Flow цитометров может приобрести многопараметрическая информацию одновременно измерения характеристик клеток (например, размер, плотность и флуоресценции многоцветной). Таким образом, свойства клеток могут быть связаны таким образом способствуя нашему пониманию гетерогенности в культуре и существование различных популяциях клеток 6. Более специализированные инструменты позволили сортировать клетки в зависимости от заданных пользователем параметров. Например, мутанты могут быть подвергнуты скринингу. После сортировки, такие мутантные клетки можно культивировать для дальнейшей характеристики. Это уже доказали свою полезность, в частности,для улучшения продуктивности штаммов 7,8. Сопла проточных цитометров обычно позволяют для прохождения клеток с максимальным диаметром около 10 мкм. Таким образом, гранулы из стрептомицетов не могут быть проанализированы с регулярными цитометров. Они, однако, могут быть проанализированы с сложного объекта параметрического Analyzer и сортировщик (Copas). Подобно обычным цитометров, Copas может приобрести многопараметрических данных частиц в высокой пропускной образом. В зависимости от типа Copas размера частиц 10-1,500 мкм могут быть проанализированы. Кроме того, это позволяет для сортировки отдельных частиц, которые можно использовать для выращивания или после анализов, таких как выделения ДНК, РНК или белков. Copas был первоначально разработан для анализа и сортировки мелких многоклеточных организмов, таких как нематоды Caenorhabditis Элеганс 9, и эмбрионов и личинок Drosophila 10. Инструменты были также использованы для данио 11 Aй для нитчатых грибов 12,13. Последние организмы также образуют мицелия гранулы, которые даже больше, чем те, которые образованы на нитчатых бактерий. Недавно мы показали, что использование Copas также возможно для стрептомицетов 4. Мы здесь описывают экспериментальные порядок использования Copas оценить гранул неоднородность в Streptomyces coelicolor, в том числе подробную информацию о методологии для сортировки гранул в зависимости от размера. Пожалуйста, обратите внимание, однако, что этот способ также может быть использован для анализа других гранул, образующих стрептомицетов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Стрептомицеты являются нитчатые бактерии почвы, которые используются в промышленности для производства ферментов и антибиотиков. При выращивании в биореакторах, эти организмы образуют сети взаимосвязанных гиф, известный как гранулы, которые неоднородны по размеру. Здесь мы опишем метод для анализа и сортировки мицелия гранулы с помощью сложного объекта Параметрический Analyzer и сортировщик (Copas). Подробные инструкции приведены для применения прибора и основного статистического анализа данных. Кроме того, мы опишем, как гранулы могут быть отсортированы по пользовательских настроек, что позволяет дальнейшую обработку, например, при анализе РНК или содержанием белка. С помощью этой методики механизм, лежащий в гетерогенной рост может быть решена. Это будет способствовать улучшения стрептомицетов как клеточной фабрики, учитывая тот факт, что производительность коррелирует с размером гранул.

Copas измерения Streptomyces гранул Стрептомицеты образуют мицелия гранул в жидких культурах, которые имеют широкий диапазон размеров. Для анализа распределения размера гранул, 2-дневный старый жидкость выросли Streptomyces coelicolor культуру подвергали большим потоком частиц цитометрии с использованием Copas Plus Profiler оснащен 1 мм сопло. Типичный выход Copas является точечный график, например, визуализируется на рисунке 2А. Ось х представляет собой время пролета (TOF), что коррелирует с размером гранул (то есть это занимает больше времени для более крупных гранул пройти лазерный луч). По оси показывает вымирание, которое представляет собой оптическую плотность объекта. Каждая точка в точечной диаграммы соответствует отдельному событию, то есть одной гранулы прохождения лазерного луча. Важно отметить, что, когда образец слишком сосредоточены (т.е. когда лазер распознает более 100 событий / сек), Copas часто не удается обнаружить индивидуальный рellets. Это приводит к ложным значений TOF которые являются слишком высокими. Разбавления пробы снижает средние значения TOF, до точки, где дальнейшее разбавление не делает не одну влияние TOF. Эта точка достигается, когда гранулы приблизительно 100 / с были проанализированы. Построение точки данных в виде гистограммы показывает, что размеры не являются нормально распределенными (рис. 2б). Распределение по-видимому, быть искажены вправо. Вход преобразования набора данных также не приводит к нормальному распределению (рис. 2в). Чтобы оценить, насколько распределение размеров можно объяснить, если предположить смесь двух нормальных распределений данные были математически моделируется 12,15. Моделирование действительно указано, что распределение размера можно объяснить, если предположить существование двух различных популяций гранул. Население небольших гранул состоял из 92% всех гранул со средним размером 248 мкм, в то время как население большого PELпозволяет (8% всех гранул) имели средний размер 319 мкм (заметим, что две популяции предполагаются существовать, когда доля участия составляет от 2.5-97.5%). Сортировка Streptomyces гранул в зависимости от размера Были отсортированы Микро-колонии из популяций больших и малых гранул. С этой целью, средние размеры гранул из двух популяций были использованы для определения границ для сортировки. Гранулы меньшего размера, чем 248 мкм считались с небольшим населением гранул, а гранулы размером более 319 мкм считались из большого гранул населения (рис. 3), с тем чтобы ограничить сортировки гранул с перекрытием части два размера распределения. Микроскопический анализ отсортированных гранул показали их различные размеры (рис. 3). Собранные гранулы могут быть дополнительно использованы для ДНК, РНК или белка выделений. &lt;Попадания альт = &quot;Рисунок 1&quot; FO: контент-ширины = &quot;5 дюймов&quot; FO: Пребывание &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; Первоначально &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной установки для измерения и анализа Streptomyces гранулы с помощью Copas. Дополнительную информацию см. в экспериментальных процедур. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a> <img alt="Рисунок 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Рисунок 2. Размер гранул неоднородность в жидких выращенных Streptomyces культур. Copas анализ 2-дневных S. coelicolor YEME культура (А) указывает, что размеры гранул (обозначенные как время значений полет) обычно не распространятьD (B), и ни стало настолько когда преобразованного логарифмически (C). Вместо этого, были обнаружены две популяции гранул, которые отличаются по TOF (и, следовательно, размер). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a> <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Рисунок 3. Фракционирование Streptomyces гранул в зависимости от размера. Пеллеты с размером меньше, чем 248 мкм (указано в розовый) считались маленькие гранулы, в то время как гранулы с размером больше, чем 319 мкм (выделены синим цветом) считались крупные гранулы. Микроскопический анализ подтвердил разницу в размерах. Следует отметить, что эти размеры были рассчитаны из данных преобразованного логарифмически с использованием описанного отношения между TOF и Diameter из гранул Streptomyces, что составляет 0,57 × TOF + 159 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Жидкие выращенных культур Streptomyces характеризуются мицелиальных гранул, которые неоднородны по размеру. Мы здесь опишем метод для анализа и сортировки такие пеллеты в высокой пропускной образом. Эти гранулы могут быть использованы для дальнейшего анализа, которые обеспечат приводит к понимать и контролировать неоднородность роста.

Сортировка<em&gt; Streptomyces</em&gt; Сотовые Пеллеты Использование сложного объекта Параметрический Analyzer и сортировщик

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

Multi-Параметрический Островок Perifusion системы в микрожидкостных устройств Perifusion

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Липидов везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных Активированный сортировки клеток (LIMACS): новый метод для анализа Белково-липидные взаимодействия

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Сотовые конкретного анализа<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Флуоресценция активированная сортировка клеток для изоляции популяций склеакттинских клеток

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Использование анализатора метаболического потока клеток в реальном времени для мониторинга биоэнергетики остеобластов

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Выделение специфических для клеток РНК из замороженных образцов гетерогенных тканей без сортировки клеток

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...