Name: sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Det förfarande för att analysera och sortera Streptomyces pellets från en två dagar gamla vätskeodlade kulturen representeras schematiskt i Figur 1. Detaljer för förfarandet ges nedan. 1. Tillväxt (Inklusive Beredning av media och buffertar) <ol><li> Bered en yl 10X fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 i 1 liter destillerat vatten, justerat till pH 7,4). Vid tidpunkten för användning tillsätt 100 ml 10 x PBS till 900 ml destillerat vatten för att erhålla en L PBS. </li><li> Förbered ett L i YEME-medium (3 g Difco jästextrakt, 5 g Bacto-pepton, 3 g Oxoid maltextrakt, 10 g glukos, 340 g sackaros, destillerat vatten upp till 1 liter) och 100 ml 2,5 M MgCl2. Sterilisera båda lösningarna genom autoklavering. Observera att även andra Streptomyces media kan användas 4,14. </li><li> Tillsätt 100 ml YEME medium och 0,2 ml 2,5 M MgCl2 till ensteril 250 ml Erlenmeyerkolv försedd med metall ringlar fjädrar. Förbered så många flaskor som bakterieprover för att studera. </li><li> Inokulera varje kolv med 10 8 sporer av Streptomyces för att erhålla en sporkoncentration av 10 6 sporer / ml. Odla bakterier i 2 dagar vid 30 ° C under skakning vid 180 rpm. </li></ol> 2. Provtagning <ol><li> Överför 5 ml prov från varje kultur till ett 15 ml Falcon-rör med användning av en steril 5 ml pipett. Skaka försiktigt kulturen samtidigt som provet för att säkerställa att provet är representativt för hela kulturen. </li><li> När proverna analyseras omedelbart med copas inga provberedningssteg är nödvändiga. Förvara provet på is och gå vidare till steg 3.1 i detta protokoll. När prover analyseras vid en senare tidpunkt, fixa pellets som beskrivs i steg från 2,3 till 2,5 i detta protokoll. Observera att fixeringen förhindrar också tillväxten av bakterier i slangsystemet när inte ordentligt rengjorda efter analyses. Se till att fixering med formaldehyd inte hämmar analyser nedströms. Till exempel skulle RNA inte isoleras från svamp pellets efter fixering med formaldehyd. Däremot var RNA framgångsrikt isolerades efter fixering med 70% etanol 12. </li><li> Lägg till 600 l av 37% formaldehyd till 5 ml prov och blanda genom att vända röret 3x. Fäst proverna på is under 30 min. </li><li> Centrifugera proverna vid 2500 x g i en fixerad rötor vid 4 ° C under 10 min. Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta pelleten med 5 ml PBS. </li><li> Upprepa steg 2.4, så att pelletsen tvättas med PBS 2x. Proverna kan förvaras i PBS vid 4 ° C under flera veckor. </li></ol> 3. Copas Analys <ol><li> Se till copas Plus, pumpen datorn och 488 nm argonlaser är påslagna och starta Biosort programvara. Även om påslagen, kommer lasern fortfarande vara i standby-modus. </li><li> Kontrollera om flaskan skärmvätskan är full ochavfallsflaskan är tom. </li><li> Klicka på &quot;Start&quot; och sedan &quot;RUN&quot; för att växla 488 nm argon laser från standby till den. Efter cirka 60 sekunder, när lasern är på, klicka på &quot;Klar&quot;. </li><li> Kontrollera tryckmätare. Trycken för &quot;Mantel&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Sorter&quot; och &quot;Clean&quot; bör läsa runt 4,0, 0,5, 2,7, och 10,9 respektive. </li><li> Klicka på kryssrutan bredvid &quot;Pressure OK&quot;. Systemet primtal sedan i flödescellen och är redo för användning. </li><li> Standardinställningar antas med &quot;Försening&quot; vid 11 och &quot;bredd&quot; 7. Trösklar har fastställts till 50 för &quot;Signal&quot; och 40 för &quot;TOF Minimum&quot;, med TOF representerar time-of-flight. (För fullständig: alla &quot;Vinster&quot; är satt till 1, avtryckaren är inställd på EXT (Extinction) och i &quot;Configuration&quot;-fliken under &quot;Välj avsökningshastighet&quot; 2,50 MHz väljs Tillfällighet är satt till &quot;Enhanced&quot;.). </li><li> Ta bort överblivna vattnet från provkoppen ettd till 0,1 ml av Streptomyces prov från steg 2.2 eller 2.5 i koppen tillsammans med PBS (ca 50 ml). Se till att provkoppen är ordentligt stängd. </li><li> Klicka på &quot;Acquire&quot; för att börja samla in data. Hantera flödet hastighet för att få mellan 30-50 händelser per sekund. Om flödet är alltför hög, tillsätt PBS till provkoppen. Om flödeshastigheten är för låg, tillsätt mer prov. </li><li> När minst 2.500 händelser samlas klicka &quot;STOP&quot;. För att spara alla uppgifter klicka &quot;Store&quot; och spara filen för senare statistisk analys. Den Biosort programvara kommer att spara data i fyra filer, varav endast den. Txt-fil kommer att användas för den efterföljande analysen. </li><li> Rengör provkoppen genom avlägsnande av prov med en 50 ml spruta och tvättning med vatten 2x. </li><li> Upprepa steg från 3,7 till 3,10, tills alla prover analyseras. </li></ol> 4. Dataanalys <ol><li> Öppna. Txt-filen och kasta data med en EXT lägre än 25 (med hjälp av till exempel MS Excel). Dettamotsvarar skräp och lösa hyfernas fragment (för Aspergillus niger alla data med en EXT lägre än 150 kasseras) 4,12. Spara sedan alla tofs i en kolumn i en vanlig &quot;txt.&quot; Fil (för många datafiler detta kan automatiseras i programspråket R, tillgänglig från: <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Se till Scilab (version 5.3.2 eller nyare från http://www.scilab.org/) installeras tillsammans med &quot;fittools&quot; bibliotek, som finns, tillsammans med handboken, från: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Starta Scilab och kör de nödvändiga funktionerna i fittools biblioteket för att modellera data. Kort sagt: Installera fittools bibliotek som visas i manualen (endast behövs en gång). <ol><li> Fyll på fittools biblioteket. </li><li> Läs data (&quot;txt.&quot; Fil) till Scilab. </li><li>Logga omvandla informationen (naturliga logaritmen är standardloggfunktion). </li><li> Montera modell av 2 populationer till data. </li><li> Rita en kurva med histogrammet och modell (tillval). </li><li> Bootstrap data (1000 replikat). </li><li> Montera modell till stroppade datamängder. </li><li> Få konfidensintervallen uppskattningar av de fem parametrarna. Detta kommer att ge information om de deltagande fraktionen (p) av befolkningen, deras 2 medel (μ 1 och μ 2) och de medföljande standardavvikelser (α 1 och α 2). Dessutom är 95% konfidensintervall bestäms genom återmontering med modellen efter bootstrapping (1.000 replikat) 12,13,15. När konfidensintervallen av medel inte överlappar varandra och konfidensintervallet för p är mellan 0,025-0,975 dataset kan förklaras som en kombination av två populationer av normalfördelningar. (Notera: evid deltagande fraktion av små pellets är p, medan deltagande av stora pellets är 1 -. p) Förhållandet mellan TOF och diametern för en Streptomyces-pelleten motsvarar 0,57 × TOF + 159 | im 4. </li></ol></li><li> I det fall två populationer finns användning genomsnitts tofs som sorterings parametrar i Copas som den övre och nedre gränsen för att sortera de små och stora pellets därefter. Observera att även andra sorterings parametrar kan väljas beroende på vilka krav på användaren. </li></ol> 5. Pellet Sorting <ol><li> Fyll på Streptomyces provet som måste sorteras såsom beskrivs i steg 3,7. </li><li> Ställ &quot;Sortering Gränser&quot; och lämna uppgifter om den minimala (Lo) och maximal (Hi) TOF värden. Alternativt ange ett område genom att välja &quot;Regioner&quot; och sedan &quot;Definiera Gate Region&quot; för att välja pellets med önskade dimensioner eller egenskaper. </li><li> Placera en 50 ml rör tillsamla flera pellets som uppfyller sorteringsparametrarna. Alternativt kan en mikro-titer platta användas för att sortera enskilda pellets. Flera pellets (10 4 -10 5) behövs för DNA-och proteinutvinning. En enstaka pellet är tillräcklig för qPCR analys av genuttryck, men flertal pelletar behövs för RNA-sekvensering. </li><li> Bestäm och ange antalet pellets som måste sorteras och klicka på &quot;Sortera manuellt&quot; för att sortera för de valda parametrarna. När den inställda mängden pellets nås, avslutas sorteringen automatiskt. </li><li> Ta vänster över provet med en 50 ml spruta från provkoppen och tvätta koppen med vatten 2x. Upprepa steg från 5,1 till 5,5, om andra prover behöver sorteras. </li><li> Innan avstängning av copas skölj provkoppen med vatten för att avlägsna de återstående pellets och rengör provkopp med 70% EtOH och / eller 2% hypoklorit i vatten. Kör ett prov av klorerat vatten för att rengöra hela systemet och upprepa detta med vatten. Tomma tHan flödar över behållaren och rengör eller byt ut filtret som finns i denna behållare. </li><li> När du är klar klickar du på &quot;STOPP&quot; för att släppa ut trycket ur systemet. När motorn stannar stänger programmet och klicka på &quot;Shutdown utan rensning&quot;. Slå sedan av datorn, det Copas, lasern, och pumpen. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Flödescytometri har gjort det möjligt för höghastighetståg analys av ett stort antal enskilda celler, som bidragit till vår förståelse av heterogenitet i klonala populationer 6. Regelbunden flödescytometri är inte möjligt för analys av de flercelliga mycelie pelletar av Streptomyces och svampar. Vårt arbete har visat att hög genomströmning analys av Streptomyces pellets är möjlig med hjälp av copas. Det förfarande som beskrivs här är enkel, snabb och mycket reproducerbar. Den kritiska parametern att tänka på vid användning av instrumentet är flödeshastigheten, vilket inte bör överstiga 100 händelser / sek (steg 3.8 i detta protokoll). Om pellets koncentrationen, och därmed också flödeshastigheten blir för hög, kommer TOF värden räknat fel på grund av att instrumentet inte detektera enskilda pellets. Tillräckligt späda provet genom tillsats av PBS övervinner detta problem. Begränsningar Den copas Plus användning<html> d här har en munstycksdiameter av 1 mm, som är lämplig för mätning av partiklar med en storlek inom intervallet 30-700 | im. Detta munstycke gör därför mäta pellets bildas av Streptomyces. I fallet med trådsvampar mikrokolonier kan vara större, vilket begränsar den generella tillämpbarheten av Copas Plus. Den copas XL kan mäta partiklar upp till 1500 | im i storlek, men dess känslighet i det lägre intervallet av diametern är mindre jämfört med den för den copas Plus. Både Copas Plus och Copas XL kan inte analysera partiklar mindre än 30 um. Detta innebär att individuella mikrobiella sporer eller celler som inte kan analyseras. Dessutom kan den copas inte noggrant analysera små aggregat av sporer och celler eller de mycket små mikrokolonier. För detta bör regelbundna cell analysatorer användas. Dessa begränsningar elimineras genom Biosorter av Union Biometrica, som kan analysera partiklar i intervallet 1-1,500 xm. Förvärvspriset är dock högre. t &quot;&gt; Felsökning Den copas är ett robust instrument som är lätt att manövrera. Men ibland pellets ej detekteras efter laddning av ett prov i provkoppen och mätningen påbörjas. Orsaken är oftast en igensatt ingångsröret, som lätt kan lösas genom att trycka på &quot;ren&quot;-kommando. Detta kommer att tvinga nämnda pellets tillbaka från rörsystemet in i provkoppen. En alternativ orsak kan vara att locket inte är korrekt placerad på provkoppen. Detta leder till att tryckförlusten och åtföljande misslyckande att detektera pelletar. Betydelse och framtida inriktningar Vi här fokuserat på analys av pelletstorlek men copas setup är också kunna analysera och sortera utifrån fluorescens och täthet. Fluorescensdetektion gör att vi kan analysera genuttryck utifrån reportrar såsom GFP. Vidare kan utvärderas kompositionen av celler. Ännu mer kraftfull är möjligheten att skilja pellets enligt dessa parametalen. Sorterat pellets kan användas för efterföljande analyser, inklusive alla-genomik studier. Ja, som tidigare sorterade vi 60.000 stora och 200.000 små pellets, och visade att proteomet var signifikant mellan stora och små pellets 4. Denna teknik ger därför nya ledningar för att förbättra Streptomyces som cellfabriker. Den viktigaste fördelen med Copas tekniken är dags. Tidigare studier av cellpelletar utfördes med användning av mikroskopi, och detta begränsar det antal pellets som kan analyseras upp till flera hundra 16. Mikroskopi studier redan föreslagit att det finns två populationer av pellets i vätskeodlade Streptomyces kulturer 16. I själva verket var två populationer av pellets tolkade oberoende av odlingsbetingelser i ett stort antal olika Streptomyces 4. Denna storlek heterogenitet är inte begränsad till trådformiga Streptomyces, men observerades även i trådsvampar 12 &lt;/ Sup&gt;. I samtliga fall är de bakomliggande mekanismerna för heterogenitet ännu ej känt. Möjligheten att sortera pellets beroende på storlek och fluorescens gör att vi kan reda ut sådana mekanismer.

Streptomyces är trådformiga jordbakterier som är väl kända för sin skicklighet att göra antibiotika samt föreningar som kan användas som immunsuppressiva medel eller för att bekämpa svampinfektioner eller cancer 1,2. Dessutom är dessa organismer producerar enzymer som är av intresse för ett brett spektrum av industriella tillämpningar 3. De flesta av dessa är kommersiellt intressanta föreningar produceras i bioreaktorer. Tillväxten av Streptomyces i bioreaktorer karaktäriseras av bildandet av komplexa strukturer av sammankopplade hyfer, så kallade klumpar eller pellets. Dessa flercelliga strukturer är mycket heterogen med avseende på storlek 4 och kan nå storlekar som är mer än en miljon gånger större än en encellig bakterie såsom Escherichia coli eller Bacillus subtilis. Även heterogenitet betraktas som en positiv egenskap i naturliga biologiska system 5, anses det vara ett produktionsfallgrop i industrin. Bioreaktor odlingar måste vara reproducerbara och kontrollerbara för att få högsta möjliga avkastning. En detaljerad förståelse av den roll som var och en av pelletstyper i en bioreaktor är därför avgörande för att förbättra Streptomyces som en cellfabrik. Flödescytometri används vanligen för att analysera enskilda celler i en population 6. Flödescytometrar kan förvärva multiparameter information genom att samtidigt mäta egenskaper hos cellerna (såsom storlek, densitet och multicolor fluorescens). På detta sätt kan cellegenskaper korreleras därigenom bidra till vår förståelse av heterogenitet inom en kultur och förekomsten av distinkta populationer av celler 6. Mer specialiserade instrument har gjort det möjligt att sortera celler enligt användardefinierade parametrar. Exempelvis kan mutanter screenas. Efter sortering, kan sådana muterade celler odlas för ytterligare karakterisering. Detta har redan visat sig vara användbar, bland annatför att höja produktiviteten i stammarna 7,8. Munstyckena i flödescytometrar tillåter typiskt för passage av celler med en maximal diameter av ca 10 | im. Därför kan pellets av Streptomyces inte analyseras med regelbundna flödescytometrar. De kan dock analyseras med den komplexa objektet parametriska Analyzer och Sorter (Copas). Som vanliga flödescytometrar kan copas förvärva multiparameter data av partiklar i en hög genomströmning sätt. Beroende på vilken typ av copas 10-1,500 fim stora partiklar kan analyseras. Dessutom möjliggör den för sortering av enskilda partiklar, som kan användas för odling eller analyser nedströms, såsom isolering av DNA, RNA eller proteiner. Copas ursprungligen utformad för analys och sortering av små flercelliga organismer, såsom nematoden Caenorhabditis elegans 9 och Drosophila-embryon och larver 10. Instrumenten har också använts för zebrafisk 11 and för trådsvampar 12,13. De senare organismerna bildar också mycelie pellets som är ännu större än de som bildas av trådformiga bakterier. Vi har nyligen visat att användningen av copas är också möjligt för Streptomyces 4. Vi här beskriva den experimentella proceduren för att använda copas att bedöma pellets heterogenitet i Streptomyces coelicolor, inklusive uppgifter om den metod för att sortera pellets beroende på storlek. Observera dock att metoden också kan användas för analys av andra pelletsbildande Streptomyces.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomyces är trådformiga jordbakterier som används inom industrin för produktion av enzymer och antibiotika. När odlas i bioreaktorer, dessa organismer bildar nätverk av sammankopplade hyfer, som kallas pellets, som är heterogena i storlek. Här beskriver vi en metod för att analysera och sortera mycelie pellets med hjälp av en komplex Object parametrisk Analyzer och Sorter (Copas). Detaljerade instruktioner ges för användning av instrumentet och grundläggande statistisk analys av data. Vi beskriver dessutom hur pellets kan sorteras enligt användardefinierade inställningar, vilket gör det möjligt för nedströms behandling såsom analys av RNA eller proteininnehåll. Genom att använda denna metod mekanismen underliggande heterogena tillväxt kan tacklas. Detta kommer att vara avgörande för att förbättra Streptomyces som en cellfabrik, med tanke på att produktiviteten korrelerar med pelletstorlek.

Copas mätningar av Streptomyces pelletar Streptomyces bildar mycelie pellets i flytande kulturer som har ett brett utbud av storlekar. För att analysera pelletstorleksfördelningen, en 2-dagars gammal vätska odlas Streptomyces coelicolor kultur utsattes för stor partikel flödescytometri med användning av en copas Plus Profiler utrustad med ett 1 mm munstycke. En typisk copas utsignal är ett spridningsdiagram såsom visualiseras i fig. 2A. X-axeln representerar den tid-of-flight (TOF), som korrelerar med pelletsstorlek (dvs det tar längre tid för större pellets passerar laserstrålen). Y-axeln visar den utplåning, som representerar den optiska densiteten av objektet. Varje punkt i punktdiagrammet motsvarar en enskild händelse, det vill säga en enda pellet som passerar laserstrålen. Viktigt när provet är alltför koncentrerad (dvs när lasern upptäcker mer än 100 händelser / sek), den Copas misslyckas ofta för att upptäcka enskilda pellets. Detta leder till falska TOF-värden som är för höga. Utspädning av provet minskar de genomsnittliga TOF värden upp till en punkt där ytterligare utspädnings gör inte längre inverkan TOF. Denna punkt är nådd då ca 100 pellets / sek analyserades. Plotta datapunkterna i ett histogram anger att storlekarna inte är normalfördelade (Figur 2B). Fördelningen tycks luta åt höger. Logga omvandla datamängden inte heller leda till en normalfördelning (figur 2C). För att bedöma om storleksfördelningen kan förklaras genom att man antar en blandning av två normalfördelningar av uppgifter var matematiskt modelleras 12,15. Modellering verkligen visade att storleksfördelningen kan förklaras genom att anta att det finns två distinkta populationer av pellets. Populationen av små pellets bestod av 92% av samtliga pelletar med en medelstorlek av 248 ^ m, medan populationen av stora pellåter (8% av alla pellets) hade en genomsnittlig storlek av 319 nm (observera att två populationer anses förekomma, när deltagandet fraktionen är mellan 2,5 till 97,5%). Sortering av Streptomyces pellets beroende på storlek Mikro kolonier från de populationer av stora och små pellets sorterades. För detta ändamål har de genomsnittliga pelletstorlekar för de två populationer som används för att definiera gränserna för sortering. Pellets som är mindre än 248 | im ansågs vara från den lilla pelleten befolkningen, medan pellets som är större än 319 um ansågs vara från den stora pellet populationen (Fig. 3), för att begränsa sortering av pellets från den överlappande delen av två storleks fördelningar. Mikroskopisk analys av sorterade pellets visade sina distinkta storlekar (Figur 3). De uppsamlade pellets kan dessutom användas för DNA, RNA eller protein isoleringar. &lt;img alt = &quot;Bild 1&quot; fo: innehåll-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figur 1. Schematisk bild av experimentuppställning för att mäta och analysera Streptomyces pellets med hjälp copas. För detaljer, se experimentella procedurer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Figur 2. Pellet storlek heterogenitet i vätskeodlade Streptomyces kulturer. Copas analys av en två dagar gammal S. coelicolor YEME kultur (A) visar att pelletstorlekar (anges som tid för flygvärden) är normalt inte distribuerad (B), och inte heller blir så när log-transformerade (C). Istället var två populationer av pellets som skiljer sig i TOF (och därmed storlek) upptäcks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figur 3. Fraktionering av Streptomyces pellets beroende på storlek. Pellets med en storlek mindre än 248 nm (anges i rosa) ansågs vara små pellets, medan pellets med en storlek större än 319 nm (indikeras i blått) ansågs vara stora pellets. Mikroskopisk analys bekräftade skillnaden i storlek. Observera att dessa storlekar beräknades från log-transformerade data genom att använda den beskrivna förhållandet mellan TOF och diameter av en Streptomyces pellets, vilket är lika med 0,57 × TOF + 159 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Vätske vuxit Streptomyces kulturer kännetecknas av mycelie pellets som är heterogena i storlek. Vi här beskriver en metod för att analysera och sortera dessa pellets i en hög genomströmning sätt. Dessa pellets kan användas för vidare analyser, som kommer att ge potentiella kunder att förstå och kontrollera tillväxten heterogenitet.

Sortering av<em&gt; Streptomyces</em&gt; Cell Pellets Använda en komplex Object parametrisk Analyzer och Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

En Multi-parametriska Islet Perifusion System inom en mikroflödessystem Perifusion enhet

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell särskild analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blad Använda fluorescensaktiverad cellsortering

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Fluorescensaktiverad cellsortering för isolering av scleractinian cell populationer

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Använda realtidscellmetabolisk flödesanalysator för att övervaka osteoblastbioenergetik

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Isolera celltypspecifika RNA från snap-frozen heterogena vävnadsprover utan cellsortering

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...