Name: isolation and preparation of bacterial cell walls for compositional analysis by ultra performance liquid chromatography
Uploaded: 2014-01-15T13:45:00
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Este trabajo fue apoyado por el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH DP2OD006466 (a K.C.H.). Los autores agradecen a Russell Monds por una demostración práctica del método y por las discusiones científicas.

1. Cultivar cultivos bacterianos en 2,5 ml de medios durante la noche
Volver a diluir los cultivos 1:100 en 250 ml de medios frescos y crecer a OD600 de 0.7-0.8. Prepare una solución de dodecil sulfato de sodio al 6% (SDS) en agua.
PRECAUCIÓN: El polvo de SDS es peligroso - evite inhalar el polvo de SDS; use una máscara sobre la nariz y la boca.
2. Día 1 - El desestecimiento de cultivos bacterianos se realiza en el transcurso d...

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	<li>den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+rod-shaped+sacculi.">Morphogenesis of rod-shaped sacculi.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).</li><li>Holtje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+stress-bearing+and+shape-maintaining+murein+sacculus+of+Escherichia+coli.">Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).</li><li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+peptidoglycan+backbone+help+bacteria+to+establish+infection.">Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection.</a> Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).</li><li>Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vancomycin+resistance+in+enterococci:+reprogramming+of+the+D-ala-D-Ala+ligases+in+bacterial+peptidoglycan+biosynthesis.">Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis.</a> Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).</li><li>Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+at+its+peaks:+how+chromatographic+analyses+can+reveal+bacterial+cell+wall+structure+and+assembly.">Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly.</a> Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).</li><li>Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli.">The Composition of the murein of Escherichia coli.</a> J. Biol. 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V., Labischinski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).</li><li>Boylen, C. W., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratio+of+teichoic+acid+and+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Bacillus+subtilis+following+spire+germination+and+during+vegetative+growth.">Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth.</a> J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).</li><li>Sutow, A. B., Welker, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+composition+of+the+cell+walls+of+Bacillus+stearothermophilus.">Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus.</a> J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).</li><li>Wang, W. S., Lundgren, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+of+a+chemolithotrophic+bacterium,+Ferrobacillus+ferrooxidans.">Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans.</a> J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).</li><li>de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penicillin+binding+proteins:+role+in+initiation+of+murein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).</li><li>Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Streptococcus+faecalis+Andrewes+and+Horder+and+Streptococcus+faecium+Orla-Jensen+based+on+the+amino+acid+composition+of+their+murein.">Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein.</a> J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).</li><li>Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+a+preeminent+technique+in+pharmaceutical+analysis.">UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis.</a> Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).</li><li>Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+&amp;#34;ultra+performance&amp;#34;+liquid+chromatography+coupled+to+oa-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies.">High resolution &amp;#34;ultra performance&amp;#34; liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li><li>Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+in+microbiological+diagnostics-identification+of+microorganisms+and+beyond+(mini+review).">MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review).</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).</li></ol>

Un paso crítico en este procedimiento es el paso 3.1 del segundo día de preparación de la muestra. Si el SDS se ha precipitado durante la noche, o si las muestras se han almacenado en SDS al 4% durante varias semanas a temperatura ambiente, las muestras deben reboiled durante al menos 1 hora para volver a resolver el SDS. Una causa común de precipitación de SDS es el uso de medios con sales de potasio, por lo que el potasio debe evitarse en los medios si es posible. Como se mencionó en la sección resultados repres...

El objetivo del método descrito en este documento es aislar las paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) y digerir el peptidoglicano (PG) de modo que la cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) se pueda utilizar para proporcionar información como la identidad de los componentes muropeptide y sus concentraciones, la longitud promedio de las hebras de glicanos y la fracción de material involucrado en los reticulados entre las hebras. Para una discusión detallada de la bioquímica pg y las especies de muropeptide, hay varias revisiones excelentes que describen la estructura pg y su papel en la infección, resistencia, morfogénesis, y el crecimiento1-6. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para el análisis de PG fue desarrollada inicialmente por Glauner y Schwarz en la década de 1980, y más recientemente se ha mejorado y aplicado ampliamente en los laboratorios de Miguel de Pedro y Waldemar Vollmer. Los métodos anteriores utilizaron análisis de aminoácidos o cromatografía de papel, técnicas lentas y tediosas que no producen evaluaciones precisas o completas de los componentes de la pared celular.
El análisis uplc se puede implementar fácilmente en cualquier laboratorio de investigación básica que tenga acceso a una ultracentrífuga y UPLC. El método UPLC que presentamos a continuación aísla sacculi completo, proporcionando así información completa y cuantitativa sobre todas las especies químicas en él. Este método produce una cuantificación precisa de todos los muropeptides a través de una población de bacterias, todo dentro de una ejecución de UPLC de 20 minutos. La implementación de este método implica sólo habilidades básicas de laboratorio, sin una inversión financiera significativa en materiales. Para ejecutar los pasos de este método, los investigadores solo necesitan ser expertos en pipetear, preparar tampones y enzimas, y ajustar el pH, haciéndolo accesible a una amplia gama de disciplinas científicas. La elección de las enzimas utilizadas en este protocolo depende de la especie de bacteria que se está analizando; el protocolo descrito aquí es útil para Escherichia coli,y se ha encontrado generalmente para ser adecuado para aislar sacculi de otros organismos gramnegativos. La consulta con la literatura se recomienda al aplicar este método a las bacterias Gram-positivas; en estas especies, la purificación de sacculus ha sido tradicionalmente más difícil. En particular, este método puede tener que ser alterado en términos de elección de enzimas y la duración de los tiempos de digestión para acomodar las paredes más gruesas y los polímeros accesorios como los ácidos teicoicos de las bacterias Gram-positivas. La primera enzima en este protocolo escinde la lipoproteína externa de la membrana (tal como lipoproteína de Braun, o Lpp) accesorio al peptidoglycan, de tal modo liberando todo pero el C-terminal di- (o tri-) péptido del Lpp de la pared celular. Este paso es necesario al examinar enterobacterias, pero muchas otras bacterias Gram-negativas no tienen equivalentes de Lpp, y por lo tanto este paso se puede omitir. Una segunda enzima se escinde específicamente después del componente de ácido murámico del peptidoglicano, solubilizando la subunidad disacárido que forma la especie muropeptide. Para proporcionar una evaluación precisa de la arquitectura de la PG, se debe tener cuidado al digerir los sacculi para evitar la escisión de los puentes cruzados o cualquier otra parte del tallo del péptido.
Aunque las composiciones químicas de peptidoglicano de más de 100 cepas de ~ 40 especies bacterianas han sido analizadas por HPLC, no se han realizado análisis con la tecnología UPLC. Además, el trabajo anterior ha caracterizado peptidoglicano de sólo una pequeña fracción del dominio bacteriano, en parte limitado por el rendimiento de hplc. Por lo tanto, la difusión de este método a tantos investigadores como sea posible, y la implementación en las plataformas uplc, será fundamental para impulsar los estudios fisiológicos de la gran fracción de especies bacterianas cuyo peptidoglicano aún no ha sido categorizado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Pronase E</td>
			<td style="width:115px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">E629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mutanolysin from Streptomyces</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">452882</td>
			<td>Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orthophosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">79607</td>
			<td>Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td>Sodium azide is a poison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex 0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH strips (pH range 0-6)</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M95863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene Falcon tubes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13 mm x 100 mm glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:119px;">60CM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial</td>
			<td style="width:115px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000327C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:115px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9820</td>
			<td>SDS powder is hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Instrumentation</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Waters Acquity UPLC H-Class system, including:</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#181;m column</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC PDA Detector</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waters Fraction Collector III</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and preparation of bacterial cell walls for compositional analysis by ultra performance liquid chromatography

La pared celular bacteriana es crítica para la determinación de la forma celular durante el crecimiento y la división, y mantiene la integridad mecánica de las células frente a presiones de turgencia de varias atmósferas en magnitud. A través de las diversas formas y tamaños del reino bacteriano, la pared celular se compone de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos cortos. La importancia central del peptidoglicano para la fisiología bacteriana subyace a su uso como diana antibiótica y ha motivado estudios genéticos, estructurales y biológicos celulares de cómo se ensambla robustamente durante el crecimiento y la división. No obstante, las investigaciones extensas todavía se requieren caracterizar completamente las actividades enzimáticas dominantes en síntesis del peptidoglycan y la composición química de paredes celulares bacterianas. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un poderoso método analítico para cuantificar las diferencias en la composición química de las paredes de las bacterias cultivadas bajo una variedad de condiciones ambientales y genéticas, pero su rendimiento a menudo es limitado. Aquí, presentamos un procedimiento sencillo para el aislamiento y la preparación de paredes celulares bacterianas para análisis biológicos de peptidoglicano a través de HPLC y Cromatografía Líquida de Ultra Rendimiento (UPLC), una extensión de HPLC que utiliza bombas para entregar presiones ultra altas de hasta 15,000 psi, en comparación con 6,000 psi para HPLC. En combinación con la preparación de las paredes celulares bacterianas presentadas aquí, los inyectores de muestras de bajo volumen, los detectores con altas tasas de muestreo, volúmenes de muestra más pequeños y tiempos de ejecución más cortos de UPLC permitirán una alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicano y la biología celular bacteriana fundamental en la mayoría de los laboratorios biológicos con acceso a una ultracentrífuga y UPLC.

Utilizando el procedimiento descrito en la Figura 1,la muestra final debe consistir en al menos 200 μl de solución transparente que se haya filtrado directamente en un vial de UPLC (paso 4.4). La separación uplc de los diversos muropeptides en una muestra bacteriana se basa en su solubilidad relativa entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria de la columna. Las columnas C18 de fase invertida proporcionan una matriz fuertemente hidrofóbica para separar las especies de muropeptide basándose ...

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Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

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