Name: determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity
Uploaded: 2014-01-15T14:15:00
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PLD hat den Canada Research Chair in Protein Engineering inne. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Canadian Institutes of Health Research an die PLD finanziert. Diese Arbeit wurde auch durch ein Grant-in-Aid für wissenschaftliche Forschung von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Nr. 23310171) und von der Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN) unterstützt. Wir danken Drs. Chris Marshall und Mike Kuiper für die Pionierarbeit, die zur FIPA geführt hat. Wir sind auch Dr. Sakae Tsuda für die Bereitstellung von Einrichtungen für einige dieser Arbeiten und Dr. Laurie Graham für den Aufbau der Fluoreszenzlicht-Erregungs- und Emissionsfilter dankbar.

1. Wachsende Einzelne Eiskristalle
<ol><li>Nehmen Sie eine saubere Metallwanne (15 cm Durchmesser, 4,5 cm Höhe), die in ein Ethylenglykol-Kühlbad passt und auf einem Schwimmen schwimmt.</li>
	<li>Polyvinylchlorid (PVC) zylindrische Formen vorbereiten, (4,5 cm Durchmesser, 3-4 cm hoch, 4 mm dick), durch Sägen von Profilen aus einem Rohr.<ol>
<li>Schneiden Sie eine Kerbe, (1 mm breit, 2 mm hoch) auf einer Seite (Abbildung 1A).</li>
		<li>Bereiten Sie so viele Formen vor, die bequem in die Pfanne passe...

<ol>
	<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes.">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li><li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein.">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li><li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.">Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+clathrate+waters+bind+antifreeze+proteins+to+ice.">Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+bacterial+antifreeze+protein+as+an+adhesin+with+ice-binding+activity.">Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity.</a> Plos One. 7 (11), (2012).</li><li>Raymond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+ice-binding+proteins+change+the+structure+of+sea+ice.">Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).</li><li>Raymond, J. A., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Baardsnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ice-binding+face+for+type+i+antifreeze+protein.">New ice-binding face for type i antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li><li>Garnham, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging.">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li><li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations.">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal-surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Antson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+mechanism+of+ice+binding+by+type+iii+antifreeze+proteins.">Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins.</a> J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).</li><li>Graether, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect.">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li><li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals:+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity.">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site.">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li><li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins.">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li><li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biomolecules+to+ice+and+their+effects+upon+ice+growth.+1.+Measuring+adsorption+orientations+and+initial+results.">Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results.</a> Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+insect+antifreeze+protein+and+its+implications+for+ice+binding.">Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding.</a> J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+naturally+inactive+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein+into+one+that+can+stop+the+growth+of+ice.">Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).</li><li>Holt, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+antifreeze+proteins+and+poly(vinyl+alcohol)+on+the+nucleation+of+ice:+A+preliminary+study.">The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study.</a> Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).</li><li>Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+growing+large,+optically+''perfect''+ice+crystals.">A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals.</a> J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).</li><li>Hobbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ice physics. , 200-248 (1974).</li><li>Knight, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+crystallographic+etch+pits+on+ice,+and+its+application+to+the+study+of+hailstones.">Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones.</a> J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).</li><li>Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+antifreeze+polypeptide+and+its+mechanistic+implications.">Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications.</a> Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).</li><li>Sicheri, F., Yang, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+structure+and+mechanism+of+an+antifreeze+protein+from+winter+flounder.">Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder.</a> Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).</li><li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+glycopeptides+and+peptides+in+inhibition+of+crystallization+of+water+in+polar+fishes.">Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes.</a> Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).</li><li>Pertaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces.">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).</li><li>Kondo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+site+of+snow+mold+fungus+antifreeze+protein+deviates+from+structural+regularity+and+high+conservation.">Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).</li><li>Mok, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein.">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li><li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein.">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li><li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins.">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites.">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li></ol>

Entwicklung der Eisätzmethode durch Charles Knight zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisflugzeugen hat die Studien über den Mechanismus der Eisbindung durch AFPs weit fortgeschritten. Während Strukturen von AFPs durch Röntgenkristallographie26,27 gelöst werden konnten, gab es keine offensichtliche Methode, um die komplementäre Oberfläche auf Eis abzuleiten, an die sich die AFP gebunden hatte. Als Typ I AFP von Winterflunder zunächst charakterisiert wurde, wurde es angenommen, an die primären Prismaebe...

Die Produktion von Frostschutzproteinen (AFPs) ist ein wichtiger Überlebensmechanismus einiger Organismen, die in eisbeladenen Umgebungen leben. Bis vor kurzem dachte man, dass die einzige Funktion von AFPs darin bestand, das Wachstum von inneren Eiskristallen zu verhindern oder zu verlangsamen, die die Durchblutung blockieren, Gewebeschäden verursachen und osmotischen Stress verursachen würden. Organismen, die kein Einfrieren vertragen, wie Fische, drücken AFPs aus, um das Eiskristallwachstum vollständig zu hemmen1. Andere, wie Gras, sind frosttolerant und drücken AFPs aus, um die Eisrekristallisation zu hemmen, die die Bildung großer Eiskristalle in ihren Geweben reduziert2. Die Stabilisierung von Membranen bei niedriger Temperatur ist eine weitere Funktion, die für die AFPs vorgeschlagen wurde3. Kürzlich wurde eine neue Rolle für die AFP eines antarktischen Bakteriums, Marinomonas primoryensis, aus eisbedeckten Brackseenvorgeschlagen 4. Diese AFP ist Teil eines viel größeren Adhesin-Proteins5, von dem angenommen wird, dass es das Bakterium an Eis anheftet, um einen besseren Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen zu erhalten6. Andere Mikroben sind dafür bekannt, AFPs zu sezernieren, was die Struktur des Eises, in dem sie leben, verändern könnte7.
AfPs wurden in einigen Fischen, Insekten, Pflanzen, Algen, Bakterien, Diatomen und Pilzen gefunden. Sie haben bemerkenswert unterschiedliche Sequenzen und Strukturen, die mit ihrer Entwicklung von verschiedenen Vorläufern bei verschiedenen Gelegenheiten übereinstimmen; und doch binden sie alle an Eis und hemmen sein Wachstum durch den Adsorptionsinhibitionsmechanismus8. Die AFPs haben jeweils eine bestimmte Oberfläche, die als eisbindende Stelle (IBS) fungiert. Diese wurden typischerweise durch standortgesteuerte Mutagenese von Oberflächenrückständen9-11identifiziert. Die IBS wird vermutet, um Wassermoleküle in einem eisähnlichen Muster zu arrangieren, das bestimmten Eisebenen entspricht. So bildet die AFP ihren Liganden, bevor sie an sie bindet5, 12. Eisebenen können durch ihre Miller-Indizes definiert werden, und verschiedene AFPs können an verschiedene Ebenen binden. So bindet Typ I AFP von Winterflunder an die 20-21 Pyramidenebenen13, Typ III AFP bindet sowohl primäre Prisma als auch Pyramidenebenen mit einer zusammengesetzten Eisbindungsfläche11,14, während der Fichtenknospenwurm AFP, ein hyperaktiver AFP, gleichzeitig an die Primär- und Basalebene15,16bindet. Andere hyperaktive AFPs, wie MpAFP, binden an mehrere Eisebenen, wie ihre vollständige Abdeckung von einzelnen Eiskristallhemisphärenzeigt 5,17. Es wird vermutet, dass die Fähigkeit von hyperaktiven AFPs, die Basalebene zu binden, sowie andere Ebenen, für ihre 10-fache höhere Aktivität gegenüber mäßig aktiven AFPs18verantwortlich sein kann. Obwohl die Effizienz hyperaktiver AFPs gut dokumentiert ist, ist ihre Fähigkeit, sich an mehrere Eisebenen zu binden, immer noch nicht verstanden.
Die ursprüngliche Methode zur Bestimmung der AFP-gebundenen Eisflugzeuge wurde von Charles Knight13,19entwickelt. Bei dieser Methode wird ein makroskopischer Einzeleiskristall auf einen hohlen Metallstab (Kaltfinger) montiert und zu einer Hemisphäre geformt, indem er in einen halbkugelförmigen Becher mit entgastem Wasser getaucht wird. Dann wird die Hemisphäre in eine verdünnte Lösung von AFPs getaucht und eine Eisschicht wird von der AFP-Lösung auf die Eiskristall-Hemisphäre über mehrere Stunden angebaut, die durch die Temperatur des Ethylenglykols gesteuert wird, das durch den kalten Finger zirkuliert. Der Eiskristall wird aus der Lösung entfernt, vom kalten Finger gelöst und in einen Gefrierraum von -10 bis -15 °C gelegt. Die Oberfläche wird mit einer scharfen Klinge abgekratzt, um den gefrorenen Oberflächenfilm der Frostschutzproteinlösung zu entfernen, und der Eiskristall darf sich für mindestens 3 Stunden sublimieren. Nach der Sublimation können die eisebenen, die von AFPs gebunden sind, als weiß geätzte Muster gesehen werden, die aus Restproteinen abgeleitet sind. Die Eishalbkugel kann an ihrer c-Achseund a-Achsenausgerichtet werden, um die Basal- und Prismenebenen des Eises zu lokalisieren und die Miller-Indizes der geätzten Flecken zu bestimmen.
Hier beschreiben wir eine Modifikation der ursprünglichen Methode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen, eine Methode, die wir als fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität (FIPA)11bezeichnen. Die AFPs sind fluoreszierend entweder mit einem chimären Etikett, wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP)11,16,17,20, oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff kovalent an die AFP5,21gebunden. Die fluoreszierend markierten AFPs werden auf einen einzigen Eiskristall adsorbiert und mit dem gleichen experimentellen Verfahren wie die ursprünglichen Eisätzexperimente überwuchert. Das Ausmaß der AFP-Bindung an die wachsende Eishalbkugel kann während des gesamten Experiments mit einer ultravioletten (UV) Lampe überwacht werden. Nach Abschluss des Experiments kann die Hemisphäre direkt vom kalten Finger abgenommen und ohne Sublimation abgebildet werden. Wenn gewünscht, kann die Hemisphäre jedoch sublimiert werden, um einen traditionellen Eisätz zu visualisieren. Änderungen, die an der FIPA-Methodik vorgenommen wurden, verkürzen das traditionelle Eisätzprotokoll um mehrere Stunden. Darüber hinaus besteht das Potenzial, mehrere AFPs mit jeweils einem anderen fluoreszierenden Etikett gleichzeitig zu bebildern, um die überlappenden Muster von AFP-gebundenen Eisebenen zu visualisieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:177px;">NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">RTE7</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:177px;">Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant</td>
			<td style="width:95px;">Certified</td>
			<td style="width:145px;">29-3037-0</td>
			<td style="width:189px;">Common automotive antifreeze</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:177px;">Cold finger</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:177px;">Hemispherical cup</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:177px;">High Dual Output Lighting System</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td>
			<td style="width:189px;">Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:177px;">Camera</td>
			<td rowspan="2" style="width:95px;">Canon</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">EOS 50D</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:177px;">Emission Filters</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td>
			<td style="width:189px;">Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity

Frostschutzproteine (AFPs) werden in einer Vielzahl von kalt-harten Organismen exprimiert, um das interne Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. AFPs binden sich durch ihre Eisbindungsflächen an bestimmte Eisebenen. Die FiPA-Analyse (Fluoreszenzbasierte Eisebene)ist eine modifizierte Technik zur Bestimmung der Eisebenen, an die die AFPs binden. FIPA basiert auf der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. Es erzeugt klarere Bilder in einer verkürzten experimentellen Zeit. In der FIPA-Analyse werden AFPs fluoreszierend mit einem chimären Tag oder einem kovalenten Farbstoff beschriftet und dann langsam in einen makroskopischen Einzeleiskristall eingearbeitet, der zu einer Hemisphäre vorgeformt und zur Bestimmung der A- und C-Achsenausgerichtet ist. Die AFP-gebundene Eishalbkugel wird unter UV-Licht dargestellt, um AFP-gebundene Ebenen mithilfe von Filtern zu visualisieren, um unspezifisches Licht zu blockieren. Die fluoreszierende Kennzeichnung der AFPs ermöglicht die Echtzeitüberwachung der AFP-Adsorption in Eis. Es wurde festgestellt, dass die Beschriftungen die Ebenen, an die AFPs gebunden sind, nicht beeinflussen. Die FIPA-Analyse führt auch die Möglichkeit ein, mehr als einen unterschiedlich markierten AFP auf demselben einzigen Eiskristall zu binden, um ihre Bindungsebenen zu differenzieren. Diese Anwendungen der FIPA tragen dazu bei, unser Verständnis dafür zu fördern, wie AFPs an Eis binden, um ihr Wachstum zu stoppen, und warum viele AFP-produzierende Organismen mehrere AFP-Isoformen ausdrücken.

Die Vorbereitung und Montage des einzelnen Eiskristalls sind die beiden Schritte des FIPA-Verfahrens, bei denen am häufigsten Fehler gemacht werden. Die Bestimmung, ob der vorbereitete Eiskristall einzeln ist, erfolgt durch Untersuchung durch gekreuzte Polaroide (Abbildung 1D), wie in Schritt 2.1 des Protokollabschnitts beschrieben. Wenn ein multikristalliner Eiskristall für die FIPA-Analyse verwendet wird, wird das Ergebnis eine diskontinuierliche Bindung der AFPs auf der Hemisphäre ohne ein kohären...

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Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Frostschutzproteine (AFPs) binden an bestimmte Eisebenen, um das Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. Die Fluoreszenzbasierte Eisebene (FIPA)-Analyse ist eine Modifikation der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. AFPs werden fluoreszierend beschriftet, in makroskopische Einzeleiskristalle integriert und unter UV-Licht visualisiert.

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Forschung

Chemie

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimierung der synthetische Proteine: Bezeichnung interpositional Abhängigkeiten Anzeige- strukturell und / oder funktionell verknüpft Rückstände

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Sulfate Trennung durch selektive Kristallisation mit einer Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

Die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Corrosion Inhibitor / Metal-Schnittstellen mit XPS: Minimierung Beitrag Tauch Oxidation

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Mäßiger Druck in verschlossenen Gefäßen, die Verwendung von Trockeneis als Solid CO2 zu erreichen

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...