Name: determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity
Uploaded: 2014-01-15T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity at JoVE.com

PLD har Canada Research Chair i Protein Engineering. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra Canadian Institutes of Health Research til PLD. Dette arbeidet ble også støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr. 23310171) og fra Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Vi er takknemlige til Dr. Chris Marshall og Mike Kuiper for banebrytende arbeid som førte til FIPA. Vi er også takknemlige til Dr. Sakae Tsuda for å tilby fasiliteter for noe av dette arbeidet og til Dr. Laurie Graham for å sette opp fluorescerende lyseksitasjons- og utslippsfiltre.

1. Voksende enkeltiskrystaller
<ol><li>Ta en ren metallpanne (15 cm diameter, 4,5 cm høy) som passer inn i, og kan flyte på, et etylenglykolkjølebad.</li>
	<li>Forbered polyvinylklorid (PVC) sylindriske former, (4,5 cm diameter, 3-4 cm høy, 4 mm tykk), ved å sage seksjoner fra et rør.<ol>
<li>Klipp et hakk (1 mm bredt, 2 mm høyt) på den ene siden (figur 1A).</li>
		<li>Forbered så mange former som kan passe komfortabelt inn i pannen (figur 1B). Merk: En studie viste at poly...

<ol>
	<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes.">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li><li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein.">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li><li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.">Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+clathrate+waters+bind+antifreeze+proteins+to+ice.">Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+bacterial+antifreeze+protein+as+an+adhesin+with+ice-binding+activity.">Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity.</a> Plos One. 7 (11), (2012).</li><li>Raymond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+ice-binding+proteins+change+the+structure+of+sea+ice.">Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).</li><li>Raymond, J. A., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Baardsnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ice-binding+face+for+type+i+antifreeze+protein.">New ice-binding face for type i antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li><li>Garnham, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging.">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li><li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations.">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal-surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Antson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+mechanism+of+ice+binding+by+type+iii+antifreeze+proteins.">Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins.</a> J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).</li><li>Graether, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect.">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li><li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals:+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity.">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site.">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li><li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins.">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li><li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biomolecules+to+ice+and+their+effects+upon+ice+growth.+1.+Measuring+adsorption+orientations+and+initial+results.">Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results.</a> Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+insect+antifreeze+protein+and+its+implications+for+ice+binding.">Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding.</a> J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+naturally+inactive+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein+into+one+that+can+stop+the+growth+of+ice.">Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).</li><li>Holt, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+antifreeze+proteins+and+poly(vinyl+alcohol)+on+the+nucleation+of+ice:+A+preliminary+study.">The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study.</a> Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).</li><li>Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+growing+large,+optically+''perfect''+ice+crystals.">A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals.</a> J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).</li><li>Hobbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ice physics. , 200-248 (1974).</li><li>Knight, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+crystallographic+etch+pits+on+ice,+and+its+application+to+the+study+of+hailstones.">Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones.</a> J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).</li><li>Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+antifreeze+polypeptide+and+its+mechanistic+implications.">Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications.</a> Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).</li><li>Sicheri, F., Yang, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+structure+and+mechanism+of+an+antifreeze+protein+from+winter+flounder.">Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder.</a> Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).</li><li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+glycopeptides+and+peptides+in+inhibition+of+crystallization+of+water+in+polar+fishes.">Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes.</a> Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).</li><li>Pertaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces.">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).</li><li>Kondo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+site+of+snow+mold+fungus+antifreeze+protein+deviates+from+structural+regularity+and+high+conservation.">Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).</li><li>Mok, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein.">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li><li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein.">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li><li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins.">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites.">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li></ol>

Charles Knights utvikling av isetsingsmetoden for bestemmelse av AFP-bundne isfly avanserte i stor grad studier på mekanismen for isbinding av AFPer. Mens strukturer av AFPer kunne løses ved røntgenkrystallografi26,27 var det ingen åpenbar metode for å utlede den komplementære overflaten på is som AFP bundet til. Da type I AFP fra vinterflunder i utgangspunktet ble karakterisert, ble det hypoteset å binde seg til de primære prismeplanene av is28. Imidlertid viste Knights banebrytende isetsi...

Produksjon av frostvæskeproteiner (AFPer) er en viktig overlevelsesmekanisme for noen organismer som lever i isbelastede miljøer. Inntil nylig ble det antatt at AFPs eneste funksjon var å forhindre eller bremse veksten av indre iskrystaller som ville blokkere sirkulasjon, forårsake vevsskade og osmotisk stress. Organismer som ikke tåler noen grad av frysing, for eksempel fisk, uttrykker AFPer for å fullstendig hemme iskrystallvekst1. Andre, som gress, er frysetolerante og uttrykker AFPer for å hemme isrekrystallisering som reduserer dannelsen av store iskrystaller i vevet2. Stabilisering av membraner ved lav temperatur er enda en funksjon som ble foreslått for AFP-ene3. Nylig ble det foreslått en ny rolle for AFP av en antarktisk bakterie, Marinomonas primoryensis, fra isdekkede brakvann4. Denne AFP er en del av en mye større adhesin protein5 som antas å feste bakterien til is for bedre tilgang til oksygen og næringsstoffer6. Andre mikrober er kjent for å utskille AFPer, noe som kan endre isstrukturen der de bor7.
AFPer har blitt funnet i noen fisk, insekter, planter, alger, bakterier, diatomer og sopp. De har bemerkelsesverdig avvikende sekvenser og strukturer i samsvar med deres utvikling fra forskjellige forfedre ved ulike anledninger; og likevel binder de seg alle til is og hemmer veksten av adsorpsjonshemmingsmekanismen8. AFP-ene har hver en bestemt overflate som fungerer som sitt isbindende sted (IBS). Disse har vanligvis blitt identifisert ved stedsstyrt mutagenese av overflaterester9-11. IBS er hypoteset om å arrangere vannmolekyler i et islignende mønster som samsvarer med spesifikke isplan. Dermed danner AFP sin ligand før binding til den5, 12. Isfly kan defineres av Miller-indeksene sine, og forskjellige AFPer kan binde seg til forskjellige fly. Dermed binder type I AFP fra vinterflunder til 20-21 pyramidale fly13, type III AFP binder både primært prisme og pyramidale fly ved hjelp av en sammensatt isbindende overflate11,14, mens gran budworm AFP, en hyperaktiv AFP, binder seg samtidig til både primære og basale fly15,16. Andre hyperaktive AFPer, som MpAFP, binder seg til flere isplan som vist ved deres fullstendige dekning av enkeltiskrystallhalvdeler5,17. Det er hypoteset, at evnen til hyperaktive AFPer til å binde basalplanet, så vel som andre fly, kan utgjøre deres 10 ganger høyere aktivitet over moderat aktive AFPer18. Selv om effektiviteten til hyperaktive AFPer er godt dokumentert, er deres evne til å binde seg til flere isfly fortsatt ikke forstått.
Den opprinnelige metoden for å bestemme AFP-bundet isfly ble utviklet av Charles Knight13,19. I denne metoden er en makroskopisk enkelt iskrystall montert på en hul metallstang (kald finger) og dannet til en halvkule ved å senke den ned i en halvkuleformet kopp fylt med avgasset vann. Deretter senkes halvkulen ned i en fortynnet løsning av AFPer, og et lag med is dyrkes fra AFP-løsningen på iskrystallhalvøya over flere timer styrt av temperaturen på etylenglykolen som sirkulerer gjennom den kalde fingeren. Iskrystallen fjernes fra løsningen, løsnes fra den kalde fingeren og plasseres i et -10 til -15 °C fryserom. Overflaten skrapes med et skarpt blad for å fjerne den frosne overflatefilmen av frostvæskeproteinoppløsning, og iskrystallen får lov til å sublimere i minst 3 timer. Etter sublimering kan isplanene bundet av AFPer ses på som hvite etsede mønstre avledet fra restprotein. Ishalvøya kan orienteres mot sin c-akseog a-akser, for å lokalisere basal- og prismeplanene til is, og bestemme Miller-indeksene til de etsede flekkene. 
Her beskriver vi en modifikasjon av den opprinnelige metoden for å bestemme AFP-bundne isplan, en metode vi refererer til som fluorescensbasert isplanaffinitet (FIPA)11. AFP-ene er fluorescerende merket med enten en chimerisk tag, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP)11,16,17,20, eller med et fluorescerende fargestoff som er kovalent bundet til AFP5,21. De fluorescerende merkede AFP-ene adsorbert til en enkelt iskrystall og overgrodd ved hjelp av samme eksperimentelle prosedyre som de originale isetsingsforsøkene. Omfanget av AFP-binding til den voksende ishalvøya kan overvåkes gjennom hele eksperimentet ved hjelp av en ultrafiolett (UV) lampe. Etter at eksperimentet er fullført, kan halvkulen tas direkte av den kalde fingeren og avbildes uten sublimering. Men om ønskelig kan halvkulen overlates til subklimatisering for å visualisere en tradisjonell is etsning. Modifikasjoner introdusert til FIPA-metodikken forkorter den tradisjonelle isetsingsprotokollen med flere timer. I tillegg er det potensial for samtidig avbildning av flere AFPer, hver med en annen fluorescerende etikett, for å visualisere de overlappende mønstrene til AFP-bundet isplan.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:177px;">NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">RTE7</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:177px;">Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant</td>
			<td style="width:95px;">Certified</td>
			<td style="width:145px;">29-3037-0</td>
			<td style="width:189px;">Common automotive antifreeze</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:177px;">Cold finger</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:177px;">Hemispherical cup</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:177px;">High Dual Output Lighting System</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td>
			<td style="width:189px;">Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:177px;">Camera</td>
			<td rowspan="2" style="width:95px;">Canon</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">EOS 50D</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:177px;">Emission Filters</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td>
			<td style="width:189px;">Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity

Frostvæskeproteiner (AFPer) uttrykkes i en rekke kaldharde organismer for å forhindre eller bremse intern isvekst. AFPer binder seg til spesifikke isplan gjennom sine isbindingsflater. Fluorescensbasert isplanaffinitet (FIPA) analyse er en modifisert teknikk som brukes til å bestemme isplanene som AFPene binder seg til. FIPA er basert på den opprinnelige isetsingsmetoden for å bestemme AFP-bundet isplan. Det gir klarere bilder i en forkortet eksperimentell tid. I FIPA-analyse er AFPer fluorescerende merket med en chimerisk tag eller et kovalent fargestoff som deretter sakte innlemmes i en makroskopisk enkeltiskrystall, som har blitt formet til en halvkule og orientert for å bestemme a- og c-aksene. Den AFP-bundne ishalvøya er avbildet under UV-lys for å visualisere AFP-bundne plan ved hjelp av filtre for å blokkere ikke-spesifikt lys. Fluorescerende merking av AFP-ene gjør det mulig å overvåke AFP-adsorpsjon i sanntid i is. Etikettene har vist seg å ikke påvirke flyene som AFPer binder seg til. FIPA-analyse introduserer også muligheten til å binde mer enn en annen merket AFP på samme enkelt iskrystall for å bidra til å differensiere bindingsplanene deres. Disse bruksområdene til FIPA bidrar til å fremme vår forståelse av hvordan AFPer binder seg til is for å stoppe veksten og hvorfor mange AFP-produserende organismer uttrykker flere AFP-isoformer.

Forberedelse og montering av den enkle iskrystallen er de to trinnene i FIPA-prosedyren der feil oftest gjøres. Avgjøre om den tilberedte iskrystallen er enkel, gjøres ved å undersøke den gjennom kryssede polaroider (figur 1D), som beskrevet i trinn 2.1 i protokolldelen. Hvis en multikrystallinsk iskrystall brukes til FIPA-analysen, vil resultatet bli diskontinuerlig binding av AFP-ene på halvkule uten et sammenhengende bindingsmønster (figur 6B). Hvis iskrystallgrensesnittene er ...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity at JoVE.com

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Frostvæskeproteiner (AFPer) binder seg til bestemte isplan for å forhindre eller bremse isveksten. Fluorescensbasert isplanaffinitet (FIPA) analyse er en modifikasjon av den opprinnelige isetsingsmetoden for bestemmelse av AFP-bundet isplan. AFPer er fluorescerende merket, innlemmet i makroskopiske enkeltiskrystaller og visualisert under UV-lys.

Bestemme isbindende fly av frostvæskeproteiner ved fluorescensbasert isplanaffinitet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW-opererte Novel nanoliter osmometer for Ice Binding Protein Undersøkelser

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse av Bestilte biomolekylære strukturer ved selvbygging av Short Peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond konformasjonsendring Endringer i Proteiner løst ved Photothermal bjelkenedbøying

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluorescens-basert overvåking av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimalisering av Syntetisk Proteiner: Identifisering av Interpositional Avhengig Hente Strukturelt og / eller Funksjonelt Koblede Rester

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Karakterisering av Hydratiserte Proteiner i vann ved Salvi og TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Sulfat Separasjon ved Selektiv Krystallisering med en Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

Bestemme den kjemiske sammensetningen av korrosjonsinhibitor / Metal grensesnitt med XPS: Minimere Post Immersion Oksidasjon

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

HS-MRM analysen for kvantifisering av verten celle proteiner i Protein Biopharmaceuticals av flytende kromatografi Ion mobilitet QTOF massespektrometri

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Oppnå moderat press i forseglet fartøy bruker tørris som en Solid CO2

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...