Name: determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity
Uploaded: 2014-01-15T14:15:00
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PLD ocupa la Cátedra de Investigación de Canadá en Ingeniería de Proteínas. Este trabajo fue financiado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a PLD. Este trabajo también fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (No. 23310171) y de la Institución japonesa de avance de la investigación en tecnología bioorientada (BRAIN). Estamos agradecidos a los Dres. Chris Marshall y Mike Kuiper por el trabajo pionero que condujo a FIPA. También estamos agradecidos al Dr. Sakae Tsuda por proporcionar instalaciones para algunos de estos trabajos y a la Dra. Laurie Graham por configurar los filtros de excitación y emisión de luz fluorescente.

1. Crecimiento de cristales de hielo individuales
<ol><li>Tome una sartén de metal limpia (15 cm de diámetro, 4,5 cm de alto) que se ajuste a, y pueda flotar en, un baño de enfriamiento de etilenglicol.</li>
	<li>Preparar moldes cilíndricos de cloruro de polivinilo (PVC), (4,5 cm de diámetro, 3-4 cm de alto, 4 mm de espesor), aserrado de secciones de una tubería.<ol>
<li>Corte una muesca, (1 mm de ancho, 2 mm de alto) en un lado (Figura 1A).</li>
		<li>Preparar tantos moldes que puedan caber cóm...

<ol>
	<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes.">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li><li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein.">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li><li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.">Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchored+clathrate+waters+bind+antifreeze+proteins+to+ice.">Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).</li><li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+a+bacterial+antifreeze+protein+as+an+adhesin+with+ice-binding+activity.">Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity.</a> Plos One. 7 (11), (2012).</li><li>Raymond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+ice-binding+proteins+change+the+structure+of+sea+ice.">Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).</li><li>Raymond, J. A., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Baardsnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ice-binding+face+for+type+i+antifreeze+protein.">New ice-binding face for type i antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li><li>Garnham, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging.">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li><li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations.">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal-surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Antson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+mechanism+of+ice+binding+by+type+iii+antifreeze+proteins.">Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins.</a> J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).</li><li>Graether, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect.">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li><li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals:+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity.">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site.">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li><li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins.">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li><li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biomolecules+to+ice+and+their+effects+upon+ice+growth.+1.+Measuring+adsorption+orientations+and+initial+results.">Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results.</a> Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+insect+antifreeze+protein+and+its+implications+for+ice+binding.">Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding.</a> J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+naturally+inactive+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein+into+one+that+can+stop+the+growth+of+ice.">Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).</li><li>Holt, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+antifreeze+proteins+and+poly(vinyl+alcohol)+on+the+nucleation+of+ice:+A+preliminary+study.">The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study.</a> Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).</li><li>Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+growing+large,+optically+''perfect''+ice+crystals.">A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals.</a> J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).</li><li>Hobbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ice physics. , 200-248 (1974).</li><li>Knight, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+crystallographic+etch+pits+on+ice,+and+its+application+to+the+study+of+hailstones.">Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones.</a> J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).</li><li>Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+antifreeze+polypeptide+and+its+mechanistic+implications.">Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications.</a> Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).</li><li>Sicheri, F., Yang, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+structure+and+mechanism+of+an+antifreeze+protein+from+winter+flounder.">Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder.</a> Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).</li><li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+glycopeptides+and+peptides+in+inhibition+of+crystallization+of+water+in+polar+fishes.">Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes.</a> Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).</li><li>Pertaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces.">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).</li><li>Kondo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+site+of+snow+mold+fungus+antifreeze+protein+deviates+from+structural+regularity+and+high+conservation.">Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).</li><li>Mok, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein.">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li><li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein.">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li><li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins.">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites.">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li></ol>

El desarrollo del método de grabado en hielo por Charles Knight para la determinación de planos de hielo ligados a AFP avanzó enormemente los estudios sobre el mecanismo de unión de hielo por AFP. Mientras que las estructuras de las AFP podían resolverse mediante cristalografía de rayos X26,27, no existía un método obvio para deducir la superficie complementaria sobre hielo a la que se unían las AFP. Cuando se caracterizó inicialmente la AFP tipo I de la platija invernal, se planteó la hipótesis de...

La producción de proteínas anticongelante (AFP) es un importante mecanismo de supervivencia de algunos organismos que viven en ambientes cargados de hielo. Hasta hace poco, se pensaba que la única función de las AFP era prevenir o retardar el crecimiento de cristales de hielo internos que bloquearían la circulación, causarían daño tisular y estrés osmótico. Los organismos que no pueden tolerar ningún grado de congelación, como los peces, expresan AFP para inhibir completamente el crecimiento de cristales de hielo1. Otros, como la hierba, son tolerantes a la congelación y expresan AFP para inhibir la recristalización del hielo que reduce la formación de grandes cristales de hielo en sus tejidos2. La estabilización de membranas a baja temperatura es otra función que se sugirió para las AFP3. Recientemente, se sugirió un nuevo papel para la AFP de una bacteria antártica, Marinomonas primoryensis, de lagos salobres cubiertos de hielo4. Esta AFP es parte de una proteína adhesina5 mucho más grande que se cree que une la bacteria al hielo para un mejor acceso al oxígeno y los nutrientes6. Se sabe que otros microbios secretan AFP, lo que podría alterar la estructura del hielo en el que viven7.
Las AFP se han encontrado en algunos peces, insectos, plantas, algas, bacterias, diatomeas y hongos. Tienen secuencias y estructuras notablemente divergentes consistentes con su evolución de diferentes progenitores en varias ocasiones; y, sin embargo, todos ellos se unen al hielo e inhiben su crecimiento por el mecanismo adsorción-inhibición8. Cada una de las AFP tiene una superficie específica que actúa como su sitio de unión al hielo (SII). Estos han sido típicamente identificados por mutagénesis dirigida por el sitio de residuos superficiales9-11. El IBS se presume para organizar las moléculas de agua en un patrón hielo-como que coincida con planos específicos del hielo. Así el AFP forma su ligand antes de atando a él5, 12. Los planos de hielo se pueden definir por sus índices de Miller, y diferentes AFP pueden unirse a diferentes planos. Así, la AFP tipo I de la platija invernal se une a los planos piramidales20-21 13,la AFP tipo III se une tanto al prisma primario como a los planos piramidales utilizando una superficie compuesta de unión al hielo11,14,mientras que el gusano de abeto AFP, un AFP hiperactivo, se une simultáneamente tanto al plano primario como al basal15,16. Otras AFP hiperactivas, como las AFP mp,se unen a múltiples planos de hielo como lo demuestra su cobertura completa de hemisferios de cristal de hielo individuales5,17. Se presume, que la capacidad de las AFP hiperactivas para unirse al plano basal, así como a otros planos, puede explicar su actividad 10 veces mayor sobre las AFP moderadamente activas18. Aunque la eficiencia de las AFP hiperactivas está bien documentada, su capacidad para unirse a múltiples planos de hielo todavía no se entiende.
El método original para determinar los aviones de hielo ligados a las AFP fue desarrollado por Charles Knight13,19. En este método, un solo cristal de hielo macroscópico se monta sobre una varilla metálica hueca (dedo frío) y se forma en un hemisferio sumergiéndolo en una copa hemisférica llena de agua desgastada. Luego, el hemisferio se sumerge en una solución diluida de AFP y se cultiva una capa de hielo de la solución de AFP en el hemisferio de cristal de hielo durante varias horas controladas por la temperatura del etilenglicol que circula a través del dedo frío. El cristal de hielo se retira de la solución, se desprende del dedo frío y se coloca en una sala de congelador de -10 a -15 °C. La superficie se raspa con una hoja afilada para eliminar la película superficial congelada de la solución de proteína anticongelante y se permite que el cristal de hielo sublite durante al menos 3 horas. Después de la sublimación, los planos de hielo unidos por AFP se pueden ver como patrones grabados en blanco derivados de la proteína residual. El hemisferio de hielo se puede orientar a sus ejes c ya, para localizar los planos basal y prisma del hielo, y determinar los índices de Miller de los parches grabados.
Aquí describimos una modificación del método original para determinar planos de hielo unidos a AFP, un método al que nos referimos como afinidad de plano de hielo basada en fluorescencia (FIPA)11. Las AFP se etiquetan fluorescentemente con una etiqueta quimérica, como la proteína fluorescente verde (GFP)11,16,17,20,o con un tinte fluorescente unido covalentemente a la AFP5,21. Las AFP etiquetadas fluorescentemente se adsorben en un solo cristal de hielo y se sobrecrean utilizando el mismo procedimiento experimental que los experimentos originales de grabado en hielo. La extensión de la unión de AFP al hemisferio de hielo en crecimiento se puede monitorear a lo largo del experimento utilizando una lámpara ultravioleta (UV). Una vez completado el experimento, el hemisferio puede ser sacado directamente del dedo frío y foto foto, sin sublimación. Sin embargo, si se desea, el hemisferio se puede dejar sublimar para visualizar un grabado de hielo tradicional. Las modificaciones introducidas en la metodología FIPA acortan el protocolo tradicional de grabado en hielo en varias horas. Además, existe la posibilidad de obtener imágenes simultáneas de varias AFP, cada una con una etiqueta fluorescente diferente, para visualizar los patrones superpuestos de los planos de hielo unidos a AFP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:177px;">NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">RTE7</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:177px;">Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant</td>
			<td style="width:95px;">Certified</td>
			<td style="width:145px;">29-3037-0</td>
			<td style="width:189px;">Common automotive antifreeze</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:177px;">Cold finger</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:177px;">Hemispherical cup</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:177px;">High Dual Output Lighting System</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td>
			<td style="width:189px;">Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:177px;">Camera</td>
			<td rowspan="2" style="width:95px;">Canon</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">EOS 50D</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:177px;">Emission Filters</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td>
			<td style="width:189px;">Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity

Las proteínas anticongelante (AFP) se expresan en una variedad de organismos resistentes al frío para prevenir o retardar el crecimiento interno del hielo. Las AFP se unen a planos específicos de hielo a través de sus superficies de unión al hielo. El análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA) es una técnica modificada utilizada para determinar los planos de hielo a los que se unen las AFP. FIPA se basa en el método original de grabado en hielo para determinar los planos de hielo unidos a AFP. Produce imágenes más claras en un tiempo experimental acortado. En el análisis FIPA, las AFP se etiquetan fluorescentemente con una etiqueta quimérica o un tinte covalente y luego se incorporan lentamente en un solo cristal de hielo macroscópico, que ha sido preformado en un hemisferio y orientado para determinar los ejes a y c. El hemisferio de hielo unido a AFP se toma imágenes bajo luz UV para visualizar planos unidos a AFP utilizando filtros para bloquear la luz inespecífica. El etiquetado fluorescente de las AFP permite el monitoreo en tiempo real de la adsorción de AFP en el hielo. Se ha encontrado que las etiquetas no influyen en los planos a los que se unen las AFP. El análisis FIPA también introduce la opción de unir más de un AFP etiquetado de manera diferente en el mismo cristal de hielo para ayudar a diferenciar sus planos de unión. Estas aplicaciones de FIPA están ayudando a avanzar en nuestra comprensión de cómo las AFP se unen al hielo para detener su crecimiento y por qué muchos organismos productores de AFP expresan múltiples isoformas de AFP.

La preparación y el montaje del único cristal de hielo son los dos pasos del procedimiento FIPA donde los errores se comen con mayor frecuencia. La determinación de si el cristal de hielo preparado es único se realiza examinándolo a través de polaroids cruzadas (Figura 1D),como se describe en el paso 2.1 de la sección de protocolo. Si se utiliza un cristal de hielo multicristalino para el análisis FIPA, el resultado será la unión discontinua de las AFP en el hemisferio sin un patrón de unión ...

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Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Las proteínas anticongelante (AFP) se unen a planos específicos de hielo para prevenir o retardar el crecimiento del hielo. El análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA) es una modificación del método original de grabado en hielo para la determinación de planos de hielo unidos a AFP. Las AFP están etiquetadas fluorescentemente, incorporadas en cristales de hielo macroscópicos individuales y visualizadas bajo luz UV.

La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW operado Novela Osmometer nanolitros de Investigaciones de hielo de fijación con proteínas

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Investigación

Química

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Monitoreo basado en la fluorescencia de PAD4 actividad a través de un sustrato Analog Pro-fluorescencia

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimización de las proteínas sintéticas: Identificación de interposicional Dependencias de indicación Estructuralmente y / o Residuos Funcionalmente Vinculados

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

La separación por cristalización selectiva sulfato con un ligando bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

La determinación de la composición química del inhibidor de corrosión / Metal Interfaces con XPS: Reducción al mínimo del anuncio Inmersión Oxidación

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Alcanzar presiones moderadas en recipientes sellados usando hielo seco sólido CO2 fuente

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...