Name: bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome
Uploaded: 2014-03-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

De auteurs danken dr. Kent Seeley, directeur van het Center for Drug Discovery en Innovatie (CDDI) Proteomics Core Facility aan de Universiteit van Zuid-Florida voor het gebruik van deze faciliteit. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCD subsidie ​​R01 DC004295 om BHAS

Ethiek Verklaring Experimenten met muizen weefsel werden goedgekeurd door de Universiteit van Zuid-Florida Institutional Animal Care en gebruik Comite (Protocollen 3931R, 3482R) zoals uiteengezet onder de richtlijnen van de National Institutes of Health. 1. Protein Extraction <ol><li> Isoleer cochleair sensorische epitheel van 16 30 dagen oude (P30) CBA / J muizen en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Op de dag van het experiment, was weefsel met 500 ui 1 x met fosfaa...

<ol>
	<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+-+Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Review - Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+induced+changes+in+the+expression+of+p38/MAPK+signaling+proteins+in+the+sensory+epithelium+of+the+inner+ear.">Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear.</a> J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).</li><li>Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+analysis+of+proteins+in+inner+ear+tissues+and+fluids+with+emphasis+on+endolymphatic+sac,+otoconia,+and+organ+of+Corti.">Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti.</a> Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).</li><li>Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+of+Corti-specific+polypeptides:+OCP-I+and+OCP-II.">Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II.</a> J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).</li><li>Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).</li><li>Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics+of+mouse+models+for+deafness,+a+discovery+strategy.">Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy.</a> Brain Res. 1091, 113-121 (2006).</li><li>Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Organ+of+Corti+Using+Nanoscale+Liquid+Chromatography+Coupled+with+Tandem+Mass+Spectrometry.">Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).</li><li>Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Transcriptomics,+Proteomics,+and+MicroRNA+Analyses+Reveals+Novel+MicroRNA+Regulation+of+Targets+in+the+Mammalian+Inner+Ear.">Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/K+-ATPase+&#945;1Identified+as+an+Abundant+Protein+in+the+Blood-Labyrinth+Barrier+That+Plays+an+Essential+Role+in+the+Barrier+Integrity.+.">Na+/K+-ATPase &#945;1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. .</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Bundles+Are+Specialized+for+ATP+Delivery+via+Creatine+Kinase.">Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase.</a> Neuron. 53, 371-386 (2007).</li><li>Chen, Z. Y., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inner+ear+gene+expression+database.">An inner ear gene expression database.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).</li><li>Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+gene+expression+in+the+inner+ear.">Ion channel gene expression in the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li><li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples.">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li><li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis.">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li><li>Wu, C. C., MacCoss, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+Tools+for+the+analysis+of+complex+biological+systems.">Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).</li><li>Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Two-Dimensional+Separation+of+Intact+Proteins+for+Bottom-Up+Tandem+Mass+Spectrometry+of+the+Human+CSF+Proteome.">Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome.</a> J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

<html> De belangrijkste te maximaliseren eiwit identificatie van de cochleaire sensorische epitheel zijn: 1) gebruik van meerdere endoproteïnases voor de spijsvertering, 2) gebruik van verschillende scheidingstechnieken, en 3) het gebruik van een hoge-resolutie massaspectrometer. De toepassing van verschillende enzymen verhoogt het aantal peptiden en verbetert eiwitsequentie dekking, vandaar verbetering van het aantal geïdentificeerde eiwitten van de cochleaire weefsel. Trypsine, de meest gebruikte protease biedt effic...

Proteomics is de studie van complexe biologische systemen door analyse van eiwitexpressie functie modificaties en interacties 1. Verscheidene werkwijzen zijn gebruikt voor proteoomanalyse van het binnenoor, waaronder antilichaam microarray 2, tweedimensionale gelelektroforese 3-5 en DIGE 6. Echter, slechts een beperkt aantal eiwitten geïdentificeerd en gekarakteriseerd 2,7-10, vergeleken met de meer dan 10.000 genen uitgedrukt sequence tags (EST&#39;s) die in het binnenoor 11,12, MS is de meest gebruikte techniek en uitgebreide in proteomics voor eiwitkarakterisering. Analyse van complexe proteomics monsters, zoals het slakkenhuis, kan een uitdaging zijn. De combinatie van verschillende scheidingstechnieken MS maakt de identificatie van een groter aantal peptiden en eiwitten, vanwege een verhoogd dynamisch concentratiebereik en piekvermogen 13. Multidimensionale chromatogPHY vermindert zeer complexe eiwitmengsels door het gebruik van verschillende adsorptie mechanismen. Er zijn twee veelgebruikte MS proteoom analyse benadering, shotgun en bottom-up proteomics. In shotgun proteomics, is een mengsel van intacte eiwitten enzymatisch gedigereerd en gescheiden onder toepassing multidimensionale chromatografie met sterke kation-uitwisselingschromatografie (SCX) gevolgd door omgekeerde fase vloeistofchromatografie (RPLC) 14,15. De afgescheiden peptiden worden onderworpen aan tandem MS en gegevensverzamelingzoeken 15. Een groot voordeel van deze techniek is dat duizenden proteïnen kunnen worden geïdentificeerd in een enkele analyse en de techniek beter geschikt voor membraaneiwitten. In de bottom-up benadering wordt het eiwit mengsel gescheiden, meestal door een-of tweedimensionale elektroforese, en het individuele eiwit banden of vlekken uitgesneden en geknipt met een enzym zoals trypsine, meestal resulterend in meerdere peptiden. Echter, andere recenterly ontwikkeld elektroforetische benadering, gebruikt in een bottom-up proteomics, is GELFrEE. Deze techniek fractioneert eiwitmonsters in vloeibare fase en maakt ze minder complex vóór de analyse. Deze techniek is reproduceerbaar, uitgerust met eiwitterugwinning en vermindert de distributie van high overvloedige proteïnen in complexe eiwitmonsters 16. Peptiden, als gevolg van gescheiden eiwitten, worden geanalyseerd door MS, door gebruik te maken peptidemassa fingerprinting of tandem MS (MS / MS), om sequence tags te creëren voor de database zoeken 17-19. Enkele van de belangrijkste voordelen van het gebruik van de bottom-up benadering zijn de mogelijkheid om hoge-resolutie scheidingen en uitgebreide eiwit dekking te verkrijgen. Bottom-up proteomics is de meest gebruikte techniek proteomics 20 derhalve verscheidene bioinformatica hulpmiddelen beschikbaar. Daarnaast kunnen eiwitten worden gescheiden in een complex mengsel vóór vertering, zodat er een grotere kans op identificatie. Een van de grote uitdagingenin het gebruik van het binnenoor voor proteomics analyse is het kleine formaat, beperkte toegankelijkheid en celtype diversiteit 21. Bovendien belangrijkste eiwitten die de functionaliteit onderscheiden, zoals ionkanalen, transporters en receptoren, zijn membraaneiwitten, die moeilijk zijn te isoleren 22. Dus kan het filter-aided monstervoorbereiding (FASP) is voordelig voor proteomics analyses van weefsels die zijn beperkt voor eiwitextractie en dat wasmiddelen vereisen om membranen 23 oplosbaar te maken. Deze filtering maakt het MS analyse van membraan en oplosbare eiwitten en op het vermogen om peptiden te isoleren uit laagmoleculaire verontreinigingen 23,24. Het onderhavige protocol beschrijft gebruikte proteomische benaderingswijzen die worden gecombineerd en aangepast aan zowel oplosbare als membraaneiwitten analyseren en het aantal eiwit ID van cochleaire sensorische epitheel maximaliseren. We zullen beschrijven met behulp shotgun proteomics met FASP multi-verterenion, ionenuitwisselingschromatografie, hoge resolutie MS en gegevensanalyse. Daarnaast zullen we bottom-up proteomics met GELFrEE, FASP multi-spijsvertering, hoge resolutie MS, en data-analyse te beschrijven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

Proteomics is een veel gebruikte aanpak die inzicht kan geven in complexe biologische systemen. De cochleaire sensorische epitheel bevat receptoren die de mechanische energie van het geluid transduceren in een elektro-chemische energie verwerkt door de perifere en centrale zenuwstelsel. Verschillende proteomische technieken ontwikkeld om het cochleair binnenoor, zoals twee-dimensionale differentiële gel elektroforese (2D-DIGE), antilichaam microarray en massaspectrometrie (MS) te bestuderen. MS is de meest uitgebreide en veelzijdige tool in proteomics en in combinatie met scheidingsmethoden kan een diepgaand proteoom van biologische monsters. Scheidingsmethoden gecombineerd met MS heeft de mogelijkheid te verrijken eiwitmonsters, detecteren lage molecuulgewicht en hydrofobe eiwitten en identificatie lage overvloedige eiwitten doordat het proteoom dynamisch bereik. Verschillende digestie strategieën kunnen worden toegepast op hele lysaat of gefractioneerd eiwit lysaat peptide en eiwitten verbeterensequence dekking. Gebruik van verschillende scheidingstechnieken, zoals sterke kationenwisselaar (SCX), omgekeerde fase (RP), en geëlueerd vloeibare fractie entrapment elektroforese (GELFrEE) kan worden toegepast om de complexiteit monster verminderen voorafgaand aan MS analyse voor proteïne-identificatie.

Om de meest uitgebreide proteoom van het cochleair sensorische epitheel te verkrijgen, wordt snel weefsel dissectie nodig voorafgaand aan eiwitextractie en monstervoorbereiding. Twee proteomics technieken kunnen worden gebruikt, shotgun en bottom-up proteomics. Om monsters voor shotgun proteomics bereiden werd FASP digestie procedure als geïllustreerd in figuur 1. De FASP werkwijze maakt concentratie van eiwitten, verwijdering van detergentia en vertering van eiwitten met meerdere enzymen. Er waren twe...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up en Shotgun Proteomics een uitgebreide Cochlear Proteome Identificeer

Proteoom analyse van de cochleaire sensorische epitheel kan een uitdaging vanwege zijn kleine formaat en omdat membraaneiwitten zijn moeilijk te isoleren en te identificeren. Zowel membraan en oplosbare eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door meerdere preparatieve methoden en scheidingstechnieken gecombineerd met hoge-resolutie massaspectrometrie.

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Productie van<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extracten aan microtubuli-geassocieerde RNA&#39;s identificeren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...