Name: bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome
Uploaded: 2014-03-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

המחברים מודים לד&quot;ר קנט סילי, מנהל המרכז לגילוי תרופות וחדשנות (CDDI) מתקן פרוטאומיקה ליבה באוניברסיטה של ​​דרום פלורידה לשימוש במתקן זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NIDCD R01 DC004295 לBHAS

הצהרת אתיקה ניסויים באמצעות רקמות עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת הדרום פלורידה בבעלי חיים מוסדי טיפול השתמש הוועדה (הפרוטוקולים 3931R, 3482R) כפי שנקבעו על פי ההנחיות של המכון הלאומי לבריאות. 1. הפקת ...

<ol>
	<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+-+Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Review - Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+induced+changes+in+the+expression+of+p38/MAPK+signaling+proteins+in+the+sensory+epithelium+of+the+inner+ear.">Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear.</a> J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).</li><li>Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+analysis+of+proteins+in+inner+ear+tissues+and+fluids+with+emphasis+on+endolymphatic+sac,+otoconia,+and+organ+of+Corti.">Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti.</a> Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).</li><li>Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+of+Corti-specific+polypeptides:+OCP-I+and+OCP-II.">Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II.</a> J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).</li><li>Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).</li><li>Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics+of+mouse+models+for+deafness,+a+discovery+strategy.">Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy.</a> Brain Res. 1091, 113-121 (2006).</li><li>Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Organ+of+Corti+Using+Nanoscale+Liquid+Chromatography+Coupled+with+Tandem+Mass+Spectrometry.">Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).</li><li>Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Transcriptomics,+Proteomics,+and+MicroRNA+Analyses+Reveals+Novel+MicroRNA+Regulation+of+Targets+in+the+Mammalian+Inner+Ear.">Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/K+-ATPase+&#945;1Identified+as+an+Abundant+Protein+in+the+Blood-Labyrinth+Barrier+That+Plays+an+Essential+Role+in+the+Barrier+Integrity.+.">Na+/K+-ATPase &#945;1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. .</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Bundles+Are+Specialized+for+ATP+Delivery+via+Creatine+Kinase.">Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase.</a> Neuron. 53, 371-386 (2007).</li><li>Chen, Z. Y., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inner+ear+gene+expression+database.">An inner ear gene expression database.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).</li><li>Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+gene+expression+in+the+inner+ear.">Ion channel gene expression in the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li><li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples.">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li><li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis.">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li><li>Wu, C. C., MacCoss, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+Tools+for+the+analysis+of+complex+biological+systems.">Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).</li><li>Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Two-Dimensional+Separation+of+Intact+Proteins+for+Bottom-Up+Tandem+Mass+Spectrometry+of+the+Human+CSF+Proteome.">Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome.</a> J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

<html> צעדי המפתח למקסם זיהוי חלבון מהאפיתל חושית השבלול הם: 1) שימוש בendoproteinases מרובה לעיכול, 2) שימוש בטכניקות הפרדה מרובות, ו3) ניצול של ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. היישום של אנזימים מרובים מגדיל את מספר פפטידים ומשפר את כיסוי רצף חלבון, ומכאן שיפור במספר חלבונים המזוה...

פרוטאומיקה היא המחקר של מערכות ביולוגיות מורכבות על ידי ניתוח ביטוי חלבון, תפקוד, שינויים, ואינטראקציות 1. כמה שיטות כבר נוצלו לניתוח proteome של האוזן הפנימית, כולל נוגדן microarray 2, ג&#39;ל אלקטרופורזה דו ממדי 3-5, וDIGE 6. עם זאת, רק מספר מוגבל של חלבונים זוהה ואופיינו 2,7-10, בהשוואה לגנים מעל 10,000 ותגים הביעו רצף (ESTs) המזוהים באוזן הפנימית 11,12, הטרשת הנפוצה היא הטכניקה המקיפה ביותר והנפוץ לשימוש בפרוטאומיקה לאפיון חלבונים. ניתוח של דגימות proteomic מורכבות, כגון השבלול, יכול להיות מאתגר. עם זאת, שילוב של טכניקות הפרדה מרובות עם MS מאפשר זיהוי של מספר גדול יותר של פפטידים וחלבונים, בשל טווח ריכוז דינמי מוגבר וקיבולת שיא 13. chromatogra רב ממדיPHY מפחית תערובות חלבון מורכבות מאוד על ידי המאפשר שימוש במנגנוני ספיחה שונים. ישנן שתי גישות נפוצות MS ניתוח proteome, רובה ציד ופרוטאומיקה מלמטה למעלה. בפרוטאומיקה רובה הציד, תערובת של חלבונים שלמים מתעכלת enzymatically והמופרד באמצעות כרומטוגרפיה רב ממדית עם כרומטוגרפיה קטיון מטבע חזקה (SCX) ואחריו כרומטוגרפיה הפוכה-שלב נוזלי (RPLC) 14,15. פפטידים המופרדים חשופים לטנדם MS ומסד נתוני חיפוש 15. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא כי אלפי חלבונים יכולים להיות מזוהה בניתוח יחיד והטכניקה היא מתאימה יותר לחלבונים בממברנה. בגישה מלמטה למעלה, תערובת החלבונים מופרדת, בדרך כלל על ידי אחד או אלקטרופורזה דו ממדים, ולהקות חלבון או כתמים הבודדים לגזור ומתעכלות עם אנזים כגון טריפסין, בדרך כלל כתוצאה מפפטידים מרובים. עם זאת, עוד יותר אחרוניםly פיתח גישת electrophoretic, המשמש בפרוטאומיקה מלמטה למעלה, הוא GELFrEE. טכניקה זו fractionates דגימות חלבון בנוזל שלב והופכת אותם פחות מורכב לפני הניתוח. טכניקה זו היא לשחזור, מציעה התאוששות חלבון גבוהה, ומפחיתה את החלוקה של חלבונים בשפע גבוהים בדגימות חלבון מורכבות 16. פפטידים, וכתוצאה מחלבונים הופרדו, נותחו על ידי MS, באמצעות טביעת אצבע פפטיד המונית או טנדם MS (MS / MS), כדי ליצור רצף תגים עבור מסד הנתונים חיפוש 17-19. חלק מן היתרונות העיקריים של שימוש בגישה מלמטה למעלה הוא היכולת להשיג הפרדות ברזולוציה גבוהה וכיסוי חלבון מקיף. פרוטאומיקה מלמטה למעלה היא הטכניקה הנפוצה ביותר בפרוטאומיקה 20, ולכן, כמה כלים לביואינפורמטיקה זמינים. בנוסף, ניתן להפריד חלבונים בתערובת מורכבת לפני העיכול, ולכן יש סיכוי גדול יותר של הזדהות. אחד האתגרים הגדוליםבשימוש באוזן הפנימית לניתוח proteomic הוא הגודל שלה קטן, נגישות מוגבלת, וגיוון סוג התא 21. בנוסף, חלבונים מרכזיים המבדילה את הפונקציונליות שלו, כגון תעלות יונים, מובילים וקולטנים, הם חלבונים בממברנה, אשר יכול להיות קשה לבודד 22. לכן, הכנה בעזרת מסנן מדגם (FASP) היא יתרון עבור ניתוחי proteomic של רקמות כי הם מוגבלים להפקת חלבון ושדורשת חומרי ניקוי לsolubilize קרומים 23. סינון זה מאפשר ניתוח MS של הממברנה וחלבונים מסיסים וליכולת לבודד פפטידים ממזהמים במשקל מולקולריים נמוכים 23,24. הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישות proteomic נפוצות שמשולבות והותאמו לניתוח חלבונים הן מסיסים וקרום וכדי למקסם את מספר תעודות הזהות של חלבון מהאפיתל החושית השבלול. נתאר באמצעות פרוטאומיקה רובה עם FASP רב לעכליון, כרומטוגרפיה החלפת יונים, ברזולוציה גבוהה בטרשת נפוצה, וניתוח נתונים. בנוסף, נתאר פרוטאומיקה מלמטה למעלה עם GELFrEE, FASP רב לעיכול, ברזולוציה גבוהה בטרשת נפוצה, וניתוח נתונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

פרוטאומיקה היא גישה נפוץ שיכול לספק תובנות לתוך מערכות ביולוגיות מורכבות. האפיתל החושית השבלול מכילה קולטנים שtransduce האנרגיה מכאנית של קול לאנרגית אלקטרו כימי מעובד על ידי מערכת עצבים ההיקפית ומרכזית. כמה טכניקות proteomic פותחו כדי ללמוד את שבלול האוזן פנימית, כגון אלקטרופורזה דו ממדי ג&#39;ל ההבדל (2D-DIGE), microarray נוגדן, וספקטרומטריית מסה (MS). הטרשת הנפוצה היא הכלי המקיף והמגוונים ביותר בפרוטאומיקה בשיתוף עם שיטות הפרדה יכולה לספק proteome מעמיקה של דגימות ביולוגיות. יש שיטות הפרדה בשילוב עם MS היכולת להעשיר דגימות חלבון, לזהות במשקל מולקולרי נמוך וחלבונים הידרופובי, ולזהות חלבונים בשפע נמוכים על ידי צמצום הטווח הדינמי proteome. ניתן ליישם אסטרטגיות עיכול שונות לכל lysate או לlysate חלבון המופרד כדי לשפר את פפטיד וחלבוניםכיסוי רצף. ניצול של טכניקות שונות הפרדה, כוללים חילופי חזקים קטיון (SCX), התהפך השלב (RP), ואלקטרופורזה-eluted ג&#39;ל הנוזלי מלכוד שבריר (GELFrEE) ניתן ליישם כדי להפחית את מורכבות מדגם לפני ניתוח MS לזיהוי חלבון.

כדי להשיג את proteome המקיפה ביותר של האפיתל החושית השבלול, נתיחת רקמות מהירה נדרשת לפני מיצוי חלבון והכנת מדגם. ניתן להשתמש בשתי שיטות proteomic, פרוטאומיקה רובה ומלמטה למעלה. כדי להכין את הדגימות לפרוטאומיקה רובה הציד, הליך עיכול FASP שימש כפי שמודגם באיור 1. שיטת FASP ?...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

מלמטה למעלה ופרוטאומיקה Shotgun לזהות מקיף שבלול Proteome

ניתוח Proteome של האפיתל החושית השבלול יכול להיות מאתגר בשל גודלו הקטן ובגלל חלבוני קרום קשים לבודד ולזהות. הממברנה וחלבונים מסיסים שניהם יכולים להיות מזוהות על ידי שילוב של שיטות הכנה של מספר רב של טכניקות והפרדה יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה.

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...