Name: bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome
Uploaded: 2014-03-07T14:30:00
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Os autores agradecem ao Dr. Kent Seeley, diretor do Center for Drug Discovery e Inovação (CDDI) Proteômica Núcleo Facilidade na Universidade do Sul da Flórida para o uso desta facilidade. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC004295 a BHAS

Declaração de Ética Experimentos utilizando tecido camundongos foram aprovados pela University of South Florida Animal Care Institucional e Comitê de Uso (Protocolos 3931R, 3482R), conforme estabelecido sob as diretrizes do National Institutes of Health. 1. Extração de Proteína <ol><li> Isolar epitélio sensorial da cóclea de 16 em 30 dias de idade (P30) camundongos CBA / J e armazenar a -80 ° C. </li><li> No dia da experiência, lavar o tecido com 500 ul...

<ol>
	<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+-+Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Review - Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+induced+changes+in+the+expression+of+p38/MAPK+signaling+proteins+in+the+sensory+epithelium+of+the+inner+ear.">Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear.</a> J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).</li><li>Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. 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Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li><li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples.">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li><li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis.">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li><li>Wu, C. C., MacCoss, M. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

<html> Os principais passos para maximizar a identificação de proteínas do epitélio sensorial da cóclea são: 1) uso de múltiplos endoproteinases para a digestão, 2) utilização de múltiplas técnicas de separação, e 3) a utilização de um espectrômetro de massa de alta resolução. A aplicação de enzimas múltiplas aumenta o número de péptidos e melhora a cobertura da sequência de proteína, portanto, melhorar o número de proteínas identificadas a partir do tecido da cóclea. Tripsina, a protease mai...

Proteomics é o estudo dos sistemas biológicos complexos, analisando a expressão da proteína, função, modificações, e interacções 1. Vários métodos têm sido utilizados para a análise do proteoma do ouvido interno, incluindo o anticorpo microarray 2, electroforese em gel bidimensional, 3-5, e DIGE 6. No entanto, apenas um número limitado de proteínas foram identificadas e caracterizadas 2,7-10, em comparação com os 10.000 e os genes marcadores de sequências expressas (ESTs) identificados no ouvido interno, 11,12, MS é a técnica mais utilizada abrangente e em proteômica para a caracterização de proteínas. A análise de amostras de proteômica complexas, como a cóclea, pode ser um desafio. No entanto, a combinação de várias técnicas de separação com MS permite a identificação de um maior número de peptídeos e proteínas, devido a um aumento da gama de concentração e capacidade dinâmica de pico 13. Cromatog Multidimensionalphy reduz misturas de proteínas altamente complexas, permitindo o uso de diferentes mecanismos de adsorção. Há duas abordagens de análise do proteoma MS comumente utilizados, espingarda e proteômica bottom-up. Em proteómica espingarda, uma mistura de proteínas intactas é enzimaticamente digeridas e separados utilizando cromatografia multidimensional com cromatografia de troca catiónica forte (SCX), seguido por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) 14,15. Os péptidos separados são submetidos a MS em tandem e base de dados em busca 15. Uma importante vantagem desta técnica é que milhares de proteínas podem ser identificadas em uma única análise e a técnica é mais adequada para as proteínas da membrana. Na abordagem de baixo para cima, a mistura de proteína é separada, normalmente por um ou electroforese bidimensional, e as bandas de proteínas individuais ou manchas cortadas e digeridas com uma enzima tal como a tripsina, geralmente resultando em péptidos múltiplos. No entanto, outra mais recentely desenvolvido abordagem eletroforética, usado em proteômica bottom-up, é GELFrEE. Esta técnica fracciona amostras de proteína em fase líquida e os torna menos complexo antes da análise. Esta técnica é reprodutível, oferece a recuperação da proteína, e diminui a distribuição de proteínas abundantes elevadas em amostras de complexos de proteínas 16. Peptídeos resultantes de proteínas separadas, são analisadas por MS, por meio de impressão digital em massa peptídeo ou conjunto MS (MS / MS), para criar etiquetas de seqüências do banco de dados em busca 17-19. Algumas das principais vantagens de se utilizar a abordagem bottom-up são a capacidade de obter separações de alta resolução e cobertura de proteína completa. Proteômica bottom-up é a técnica mais utilizada em proteômica 20, por isso, várias ferramentas de bioinformática estão disponíveis. Além disso, as proteínas podem ser separadas em uma complexa mistura, antes da digestão, para que haja uma maior chance de identificação. Um dos maiores desafiosno uso do ouvido interno para análise proteômica é seu pequeno tamanho, a acessibilidade restrita, e tipo de célula diversidade 21. Além disso, as proteínas principais que distinguem a sua funcionalidade, como os canais de iões, os transportadores e os receptores, são proteínas de membrana, as quais podem ser difíceis de isolar 22. Assim, a preparação da amostra auxiliado por filtro (FASP) é vantajoso para análises proteômicas de tecidos que são limitados para a extração de proteínas e que necessitam de detergentes para solubilizar as membranas 23. Esta filtragem permite a análise MS da membrana e as proteínas solúveis e para a capacidade de isolar péptidos a partir de contaminantes de baixo peso molecular 23,24. O presente protocolo descreve abordagens proteomic comumente utilizados que são combinadas e modificados para análise de proteínas, tanto solúveis e de membrana e para maximizar o número de IDs de proteína a partir do epitélio sensorial da cóclea. Vamos descrever usando proteômica shotgun com FASP multi-digeririônica, cromatografia de troca iônica, alta resolução MS, e análise de dados. Além disso, vamos descrever proteômica bottom-up com GELFrEE, FASP multi-digestão, alta resolução MS, e análise de dados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

Proteômica é uma abordagem comumente utilizado, que pode fornecer insights sobre sistemas biológicos complexos. O epitélio sensorial da cóclea contém receptores que transduzem a energia mecânica do som para uma energia electro-química processada pelos sistemas nervosos periférico e central. Diversas técnicas têm sido desenvolvidas proteomic para estudar o ouvido interno da cóclea, tais como electroforese bidimensional em gel de diferença (2D-DIGE), anticorpo do microarray, e espectrometria de massa (MS). MS é a ferramenta mais abrangente e versátil em proteômica e em conjunto com métodos de separação pode fornecer um proteoma em profundidade de amostras biológicas. Os métodos de separação combinadas com MS tem capacidade para enriquecer amostras de proteína, detectar baixo peso molecular e as proteínas hidrofóbicas, e identificar proteínas abundantes baixas, reduzindo a gama dinâmica do proteoma. Estratégias diferentes de digestão pode ser aplicado a todo o lisado ou lisado de proteína fraccionada para aumentar peptídeo e proteínacobertura seqüência. Utilização de técnicas de separação diferentes, incluindo permuta catiónica forte (SCX), em fase inversa (RP), e electroforese fracção aprisionamento líquido eluído-gel (GELFrEE) podem ser aplicadas para reduzir a complexidade da amostra antes da análise por MS para a identificação das proteínas.

Para obter o proteoma mais abrangente do epitélio sensorial da cóclea, a dissecção do tecido rápida é necessária antes da extração de proteínas e de preparação da amostra. Duas técnicas proteômicas pode ser usado, de espingarda e bottom-up proteômica. Para preparar amostras para proteómica espingarda, procedimento de digestão FASP foi utilizado como ilustrado na Figura 1. O método permite que FASP para concentração de proteínas, a remoção de detergentes, e a digestão de proteína...

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up e espingarda Proteômica para Identificar um Comprehensive Coclear Proteome

Análise do proteoma do epitélio sensorial da cóclea pode ser um desafio, devido ao seu pequeno tamanho e porque as proteínas da membrana são difíceis de isolar e identificar. Tanto a membrana e proteínas solúveis podem ser identificados através da combinação de vários métodos de preparação e de técnicas de separação junto com espectrometria de massa de alta resolução.

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologia

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produção de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrai identificar RNAs associada aos microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...