Name: bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome
Uploaded: 2014-03-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

Författarna tackar Dr Kent Seeley, chef för Centrum för Drug Discovery och innovation (CDDI) Proteomics Core Facility vid University of South Florida för att använda denna möjlighet. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCD bidrag R01 DC004295 till BHAs

Ethics Uttalande Experiment med möss vävnad godkändes av University of South Florida Institutional Animal Care och användning kommittén (protokoll 3931R, 3482R) som anges i riktlinjerna från National Institutes of Health. 1. Protein Extraction <ol><li> Isolera cochlea sensoriska epitel från 16 30 dagar gamla (P30) CBA / J möss och förvara vid -80 ° C. </li><li> På dagen för experimentet, tvätta vävnaden med 500 | il av 1 x fosfatbuffrad saltlösning ...

<ol>
	<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+-+Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Review - Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+induced+changes+in+the+expression+of+p38/MAPK+signaling+proteins+in+the+sensory+epithelium+of+the+inner+ear.">Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear.</a> J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).</li><li>Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+analysis+of+proteins+in+inner+ear+tissues+and+fluids+with+emphasis+on+endolymphatic+sac,+otoconia,+and+organ+of+Corti.">Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti.</a> Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).</li><li>Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+of+Corti-specific+polypeptides:+OCP-I+and+OCP-II.">Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II.</a> J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).</li><li>Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).</li><li>Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics+of+mouse+models+for+deafness,+a+discovery+strategy.">Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy.</a> Brain Res. 1091, 113-121 (2006).</li><li>Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Organ+of+Corti+Using+Nanoscale+Liquid+Chromatography+Coupled+with+Tandem+Mass+Spectrometry.">Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).</li><li>Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Transcriptomics,+Proteomics,+and+MicroRNA+Analyses+Reveals+Novel+MicroRNA+Regulation+of+Targets+in+the+Mammalian+Inner+Ear.">Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+/K+-ATPase+&#945;1Identified+as+an+Abundant+Protein+in+the+Blood-Labyrinth+Barrier+That+Plays+an+Essential+Role+in+the+Barrier+Integrity.+.">Na+/K+-ATPase &#945;1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. .</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+Bundles+Are+Specialized+for+ATP+Delivery+via+Creatine+Kinase.">Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase.</a> Neuron. 53, 371-386 (2007).</li><li>Chen, Z. Y., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inner+ear+gene+expression+database.">An inner ear gene expression database.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).</li><li>Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+gene+expression+in+the+inner+ear.">Ion channel gene expression in the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li><li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples.">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li><li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis.">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li><li>Wu, C. C., MacCoss, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+Tools+for+the+analysis+of+complex+biological+systems.">Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).</li><li>Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Two-Dimensional+Separation+of+Intact+Proteins+for+Bottom-Up+Tandem+Mass+Spectrometry+of+the+Human+CSF+Proteome.">Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome.</a> J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

<html> De viktigaste stegen för att maximera proteinidentifiering från cochlea sensoriska epitel är: 1) användning av flera endoproteinases för matsmältningen, 2) användning av flera separationstekniker, och 3) utnyttjande av en högupplösande masspektrometer. Tillämpningen av ett flertal enzymer ökar antalet peptider och förbättrar proteinsekvens täckning, därmed förbättra antalet identifierade proteiner från cochlea vävnaden. Trypsin, den vanligast använda proteas ger effektiv och specifik klyvning a...

Proteomik är studier av komplexa biologiska system genom att analysera proteinuttryck, funktion, modifieringar, och interaktioner 1. Flera metoder har använts för proteomanalys i innerörat, inklusive antikropp microarray 2, två-dimensionell gelelektrofores 3-5 och DIGE 6. Dock har endast ett begränsat antal proteiner identifierats och karakteriserats 2,7-10, jämfört med de över 10.000 gener och uttryckta sekvenstaggar (EST) som identifieras i innerörat 11,12, är MS den vanligaste och omfattande teknik i proteomik för proteinkarakterisering. Analys av komplexa proteomik prover, exempelvis snäckan, kan vara en utmaning. Men kombinationen av multipla separationstekniker med MS möjliggör identifieringen av ett större antal av peptider och proteiner, på grund av en ökad dynamisk koncentrationsintervall och toppkapacitet 13. Multidimensional chromatograPHY minskar mycket komplexa proteinblandningar genom att tillåta användning av olika adsorption mekanismer. Det finns två vanliga MS proteomanalys metoder, hagelgevär och bottom-up-proteomik. I shotgun proteomics, är en blandning av intakta proteiner enzymatiskt digererad och separerades med användning av flerdimensionell kromatografi med starka katjonbytar-kromatografi (SCX) följt av omvänd fas-vätskekromatografi (RPLC) 14,15. De separerade peptiderna utsätts för tandem MS-och databassökning 15. En stor fördel med denna teknik är att tusentals proteiner kan identifieras i en enda analys, och den teknik som är bättre anpassat till membranproteiner. I bottom-up-strategi, är proteinblandning separeras, vanligen i form av en-eller tvådimensionell elektrofores, och de enskilda proteinbanden eller fläckar klippa ut och smältes med ett enzym såsom trypsin, oftast resulterar i flera peptider. Emellertid har en annan nyarely utvecklat elektro tillvägagångssätt, som används i bottom-up-proteomik, är gelfri. Denna teknik fraktionerar proteinprover i flytande fas och gör dem mindre komplex före analys. Denna teknik är reproducerbar, ger hög proteinutvinning, och reducerar spridningen av höga förekommande proteiner i komplexa proteinprover 16. Peptider, till följd av separerade proteiner, analyseras med MS, med hjälp av peptidmassfingeravtrycks eller tandem MS (MS / MS), för att skapa sekvens taggar för databasen söker 17-19. Några av de stora fördelarna med att använda det underifrånperspektiv är förmågan att få högupplösta separationer och omfattande protein täckning. Bottom-up proteomik är den mest använda tekniken i proteomik 20 därmed flera bioinformatikverktyg är tillgängliga. Dessutom kan proteiner separeras i en komplex blandning före digerering, så det finns en större chans att identifiering. En av de stora utmaningarnaanvända innerörat för proteomik analys är dess ringa storlek, begränsad tillgänglighet, och celltyp mångfald 21. Dessutom nyckelproteiner som skiljer dess funktionalitet, såsom jonkanaler, transportörer och receptorer, är membranproteiner, som kan vara svåra att isolera 22. Således är förberedelse filter stödd prov (FASP) fördelaktigt för proteomik analyser av vävnader som är begränsade för proteinutvinning och som kräver rengöringsmedel för att lösa membran 23. Denna filtrering gör det möjligt att MS-analys av membran och lösliga proteiner och med avseende på förmågan att isolera peptider från lågmolekylära föroreningar 23,24. Den nuvarande protokollet beskriver vanligen använda proteomik metoder som kombineras och modifieras för att analysera både lösliga och membranproteiner och att maximera antalet protein ID från cochlea sensoriska epitelet. Vi kommer att beskriva med hjälp av hagelgevär proteomik med FASP multi-smältaion, jonbyteskromatografi, högupplösande MS, och dataanalys. Dessutom kommer vi att beskriva bottom-up proteomik med gelfri, FASP flera matsmältning, högupplösande MS, och dataanalys.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

Proteomik är en vanligt förekommande metod som kan ge insikter i komplexa biologiska system. Den cochlea sensoriska epitel innehåller receptorer som omvandlar den mekaniska energin av ljud i en elektrokemisk energi behandlas av de perifera och centrala nervsystemet. Flera proteomic tekniker har utvecklats för att studera cochlear innerörat, såsom två-dimensionell skillnad gelelektrofores (2D-DIGE), antikropp microarray och masspektrometri (MS). MS är den mest omfattande och mångsidigt verktyg i proteomik och i samband med separationsmetoder kan ge en fördjupad proteomen av biologiska prover. Separationsmetoder kombination med MS har förmågan att berika proteinprover, detektera lågmolekylära och hydrofoba proteiner och identifiera låga förekommande proteiner genom att minska proteomet dynamiskt område. Olika rötningsstrategier kan tillämpas på hela lysat eller fraktionerade protein lysat att öka peptid och proteinsekvenstäckning. Utnyttjande av olika separationstekniker, bland annat stark katjonbytare (SCX), omvänd fas (RP), och gel-elueras flytande fraktion entrapment elektrofores (gelfri) kan tillämpas för att minska prov komplexitet innan MS-analys för proteinidentifiering.

För att få den mest omfattande proteomen av cochlea sensoriska epitel, är snabb vävnad dissektion krävs före protein extraktion och provberedning. Två proteomik tekniker kan användas, hagelgevär och bottom-up proteomik. För att framställa prover för shotgun proteomics ades FASP uppslutning användes såsom illustreras i figur 1. Den FASP Metoden möjliggör koncentration av proteiner, avlägsnande av tvättmedel, och nedbrytning av proteiner med hjälp av flera enzymer. Det fanns två dubbla...

Watch this Scientific Journal Video about Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome at JoVE.com

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Bottom-up och Shotgun Proteomics att identifiera en omfattande Cochlear Proteome

Proteomanalys av cochlea sensoriska epitelet kan vara en utmaning på grund av sin ringa storlek och eftersom membranproteiner är svåra att isolera och identifiera. Både membran och lösliga proteiner kan identifieras genom att kombinera flera preparativa metoder och separationstekniker tillsammans med högupplösande masspektrometri.

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomik för att identifiera proteiner Interagera med P2X2 ligandreglerade munikationsvägar

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonal proteinrening underlättas av en liten Bispecific Affinity Tagg

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion av<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Ägg extrakt för att identifiera mikrotubuli-associerade RNA

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound masspektrometri - Ett kraftfullt verktyg för att identifiera nya c-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Icke-enzymatiska, Serumfri Tissue Culture of Pre-invasiva bröstförändringar för spontan generation av Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Xenopus laevis som en modell för att identifiera Översättning Nedskrivningar

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...