Name: visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר את פלטפורמת מונפלייה ריו ההדמיה (MRI) שבו בוצעו הרכישות. הם מודים איזבל כריסטינה לופז מחייה, אלכסנדרה מץ, אירינה Lassot, סולאנז&#39; Desagher, פביאן Loustalot, וירג&#39;יני Georget לעזרתם בחלקים שונים של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-N ° DEQ20111223745).

כל הליכי בעלי החיים בפרוטוקול זה הם בהקפדה עם ההנחיות של הוראת מועצת הקהילה האירופית של 24 נובמבר 1986 (86-609/EEC). בית העכברים בקבוצה, המאפשרים כרצונך מודעת מזון ומים. לשמור אותם בסביבה מבוקרת (C ° 22 ± 1, ± 55 לחות 5%) עם שעות 12: שעות אור 12: מחזור כהה (אור על שעת 7:00 בבוקר). <p clas...

<ol>
	<li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+granules:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability.">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules:+the+Tao+of+RNA+triage.">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules.">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li><li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein.">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li><li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein:+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1.">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li><li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+G3BPs:+tissue+specific+expression,+chromosomal+localisation+and+rasGAP(120)+binding+studies.">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li><li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC&#945;+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress.">PKC&#945; Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li><li>Tourri&#232;re, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp:+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization.">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li><li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+helicase+VIII:+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein,+an+element+of+the+ras+transduction+pathway.">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li><li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha,+entry+to+cytoplasmic+stress+granules,+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs.">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li><li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+(G3BP)+is+a+modulator+of+USP10,+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease.">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li><li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP.">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li><li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+G3BP1,+the+stress+granules+assembly+factor,+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons.">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult.">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li><li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly.">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li><li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase/ERK-Dependent+Mechanism.">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li><li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture.">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li><li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2&#945;+phosphorylation.">Large G3BP-induced granules trigger eIF2&#945; phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li></ol>

השלבים הקריטיים ביותר בדאגת פרוטוקול transfection ועוד במיוחד רכישות הזמן לשגות, שצריך להיות במעקב צמוד על מנת להפחית את cytotoxicity. תרבות של תאים ראשוניים היא לא חלק קשה, כל עוד תנאים סטריליים נשמרים והזהירות לנקוט על מנת למנוע נזק במהלך ?...

גרגרי מתח (SGS) הם מוקדי cytoplasmic שאינם קרומיים נוצרו כתגובה מגן סלולרית ללחץ סביבתי, כגון טמפרטורה גבוהה, סטרס חמצוני, היפוקסיה, הלם אוסמוטי, קרינת UV, מניעת גלוקוז, או זיהום ויראלי 1. הם יכולים להיגרם על ידי טיפול כימי עם תרכובות כמו arsenite נתרן, אשר מפעיל לחץ חמצוני. SGS לצבור ribonucleoprotein נתקעה תרגום נעצר שליח (mRNPs) קומפלקסים 2, sequestering mRNAs ממכונות translational, וההרכבה שלהם יכולה להיות מופעלת על ידי זירחון של eIF2α (גורם ייזום אוקריוטים 2 α). SGS הם מבנים דינמיים אשר מחליפים רכיבים עם polysomes וגרגרים אחרים כמו P-הגופות. הם מהווים &quot;מרכז מיון&quot; שבו mRNAs מסודרים ומעובד או תרגום, reinitiation, השפלה, או אריזה לmRNPs הלא polysomal היציב 3. ההרכבה של SGS היא ב מהירut זה תהליך הדרגתי עם אגרגטים קטנים רבים ראשוניים שלהתגבש לתוך גרגרים גדולים יותר. השימוש במעכבים כימיים המשבשים או לייצב microtubules מראה כי רשת microtubule נדרשת לדינמיקת SG כוללים תהליכי הרכבה, גיבוש ופירוק. ההרכבה הדינמית של SGS גם מקודמת על ידי צבירה של חלבוני קושרי RNA ספציפיים (RNA-BP) כמו TIA-1 (T-cell פנימי אנטיגן-1) וTIAR (חלבון הקשורים ל-TIA-1), אשר מסוגל dimerize ולקדם polysome פירוק והניתוב של mRNAs ל4 SGS. G3BP (חלבון RasGAP SH3 תחום מחייב) הוא RNA-BP כזה שמתאים לSGS כאשר תאים הדגישו עם arsenite או טמפרטורה גבוהה, וביטוי יתר של G3BP dephosphorylated יכול לגרום להרכבת SGS 5. G3BP הוא RNA-BP אבולוציונית שימור שהיה בתחילה אפיין דרך האינטראקציה שלו עם חלבון הפעלת ראס-GTPase (RasGAP p120 6); אך אינטראקציה זו הייתה לאחרונה וביקרה 7. משפחת G3BP כוללת שני חברים ביונקים, G3BP1 (המכונה G3BP) וG3BP2 8. שני חלבוני colocalize בSGS, כאשר תאים נחשפים למתח 9. G3BPs מהווה תחום NTF2 N-מסוף הציע להשפיע על הלוקליזציה שלהם וoligomerization, ואחריו פרולין עשיר מוטיבים (PxxP), ולאחר מכן מוטיבים בטרמינל C-קשורים RNA מחייב: RNA-ההכרה המוטיב הקנונית (RRM) עם מוטיבים RNP1 וRNP2 שימור , ואחריו תיבת ארגינין-גליצין עשיר (RGG). מעניין לציין, כי הניתוח של חלקים שונים של החלבון על ידי בניית תחומים שונים התמזגו EGFP הראה כי תחום כמו NTF2 ותחום המחייב-RNA היו מגויס באופן יעיל ביותר לSGS, המצביע על חשיבותם של המאפיינים של dimerization ו-RNA מחייב ב ההרכבה של SGS. מודלים מגוונים חשפו פונקציות שונות של חלבוני G3BP במבחנה 10-13.שיבוש של G3BP בעכברים הראו את החשיבות של חלבון זה בגידול התפתחותית והישרדות 14, כמו גם תפקיד חשוב לG3BP במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתאפיינת באטקסיה וליקויים בזיכרון עבודה המרחבי 15. מחסור G3BP מוביל להומאוסטזיס פלסטיות עצבי וסידן שהשתנה, הקמת קשר ישיר בין היווצרות SG ומחלות ניווניות 15. זה כן חשוב להיות מסוגל ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים ראשוניים כמו תאי עצב. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לבחון את ההרכבה של SGS המכיל G3BP1 בתאים ראשוניים תחת טיפול arsenite. זה יכול לשמש כדי לחקור הרכבה SGS בתנאים שונים, לדוגמא סוגים שונים של לחצים. זה גם יכול להיות מותאם לגרגירים או מרכיבים אחרים אחרים של SGS. ואכן, בפרוטוקול זה מתמקד בG3BP1, אבל יש סמני גרגרי מתח אחרים כמו TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (פיגור שחלבון ה-X שביר תסמונת נפשית) 16, (חלבון קושר DNA תגובת transactive 43) TDP-43 17 או Staufen 18. בפרט, חלבונים כמו TIA-1 / R הם, כמו G3BP, nucleating חלבוני RNA מחייבים שיכול לגרום להרכבת SGS כאשר ביטוי יתר, גם אם SGS נוצר השונים יכול להיות שונה בתפקוד, ויסות ותמלילים כרוכים בכך. Transfection של גרסה מתויג fluorophore של כל אחד מהמרכיבים המרכזיים אלה או nucleators של SGS יכול להתבצע להרכבת תמונה מסוימת SGS ודינמיקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:312px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21331</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Trypsin</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass bottom B-35</td>
			<td style="width:153px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">627860/627861</td>
			<td>Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HeBS</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">21103</td>
			<td>Pre-warm at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:153px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">DU-110-A</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">P-110-BUF</td>
			<td>Very thin, tips 0,1 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Small scissors</td>
			<td style="width:153px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">CM-85-BS</td>
			<td>Can be useful to remove hippocampi</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyplus transfection JetPEI reagent&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Ozyme</td>
			<td style="width:119px;">101-10</td>
			<td>MEFs transfection, follow the forward protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:153px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of g3bp stress granules dynamics in live primary cells

ניתן דמיינו SGS בתאים על ידי immunostaining של מרכיבי חלבון מסוימים או הפולה + mRNAs. SGS הם מאוד דינמי והמחקר של ההרכבה וגורלם חשוב להבין התגובה התאית ללחץ. המחסור בגורמים מרכזיים של SGS כמו G3BP (חלבון קושר תחום RasGAP SH3) מוביל לפגמים התפתחותיים בעכברים ובשינויים של מערכת העצבים המרכזית. כדי ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים מאורגניזם, תאים ראשוניים ניתן תרבות ובצע את הלוקליזציה של transfected רכיב מתויג של SGS. אנו מתארים ניסוי הזמן לשגות להתבונן SGS המכיל G3BP1 בfibroblasts העכבר עוברי (MEFs). גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור SGS המכיל G3BP בנוירונים בשידור חי, שהוא חיוני כפי שהוצג לאחרונה כי SGS אלה נוצרים בהתפרצות של מחלות ניווניות כמו אלצהיימר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל מרכיב גוף סלולארי וחלבון גרגר אחר, ובביצועעם בעלי חיים מהונדסים, המאפשר הלימוד החי של דינמיקת גרגרים למשל בהעדר גורם ספציפי של גרגרים אלה.

היווצרות גרגר מתח היא חשובה בתגובה של תאים ללחץ, ומאפשרת הסתגלות סלולרית עם תרגום נתקע, עד שהלחץ יש לו פינה, הקשורים למניעת מות תאים מתוכנת. היתרי assay זה ללמוד את SGS בתאים ראשוניים, על ידי ביצוע הלוקליזציה של מרכיבי חלבון SGS המרכזיים (איור 1). G3BP, גורם מפתח של ההר?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells at JoVE.com

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

גרגרי מתח (SGS) הם גרגרי cytoplasmic RNA המכילים חלקיקים נתקע ribonucleoprotein (RNPs), וחשובים בתגובה תאית ללחצים שונים. דינמיקה של SGS יכולה להיות מיושמת בתאי חיים על ידי הדמיה הלוקליזציה של רכיב מתויג של SGS בתאים ראשוניים transfected אחרי המתח.

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

שיטות לסיווג מוקדים Cytoplasmic כמו גרגרי מתח יונקים

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...