Name: fibs-enabled noninvasive metabolic profiling
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00
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Wir danken Professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) für die freundliche Bereitstellung uns mit dem Glukose-FRET-Plasmid und Dr. Uwe Ludewig (Universität Hohenheim) für die freundliche Versorgung der Glutamin-FRET-Konstrukt in der pUTkan Pflanzenexpressionsvektor. AB wird durch die BBSRC Gezielte Priorität Studentprogramm finanziert. Sowohl CK und KP sind durch RCUK Fellowships in Biopharmaceuticals Verarbeitung unterstützt. CK möchte auch Lonza Biologics für die finanzielle Unterstützung bedanken. Das Zentrum für Synthetische Biologie und Innovation wird großzügig von der EPSRC unterstützt.

1. Zelllinie Revival und Wartung <ol><li> Revive CHO-Zellen in 9 ml CD-CHO-Medium mit 8 mM L-Glutamin und 10 ml / L 100x Hypoxanthin / Thymidin-Supplement (komplette Wachstumsmedium) ergänzt. </li><li> Zentrifuge bei 100 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml frisches vollständiges Wachstumsmedium. </li><li> Entfernen einer 1 ml Probe und bestimmen die Lebendzellkonzentration mittels Lichtmikroskopie mit der Trypanblau-Ausschluss-Verfahren in einer Zählkammer. </li><li> Initiieren einer Kultu...

<ol>
	<li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose,+lactate,+glutamate,+and+glutamine.">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li><li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection.">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li><li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors.">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li><li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors.">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li><li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors.">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures.">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li><li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture.">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+binding+proteins:+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering.">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li></ol>

Die FIBS ermöglichen in vivo und in situ Quantifizierung von Schlüsselmoleküle, in diesem Fall das Wachstum einschränkende Nährstoffe, die Unsicherheiten, die aus dem Abschrecken und Extraktionsverfahren. Die Ergebnisse legen nahe, dass es eine gute Korrelation zwischen der FIBS Signal und die intrazellulären Konzentrationen im Bereich von 1-5 mM für Glucose und 0,3-2 mM Glutamin. Im Batch-CHO-Zellkultur, sind diese Konzentrationen in den exponentiellen, stationär, und Anfang der Rückgang Phas...

Metabolite Überwachung hat verschiedene Anwendungen in der Bioverfahrenstechnik, einschließlich Prozessentwicklung, Medien-und Futtermittel-Design und Metabolic Engineering. Verschiedene Verfahren sind durch die Verwendung von enzymatischen 1, Chemie 2, 3 oder Bindungsassays für Konzentrationsmessungen zur Verfügung. Eine interessante Möglichkeit ist die Verwendung von Fluoreszenz-, Protein-basierte biologische in vivo-Sensoren, die Daten über die intrazelluläre Konzentration von Schlüsselmetaboliten. Im Ultra-Low-Volume-Assays, Fluoreszenz ist ein geeignetes Mittel, wie Miniaturisierung tatsächlich verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis von 4,5 und einer proteinbasierte Sensoren können genetisch codierten Sinne, dass keine exogenen Reagenzien zur Metabolitenanalyse notwendig sind. Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Biosensoren bestehen aus zwei fluoreszierenden Proteinen, die von einem Liganden-bindenden Domäne verbunden ist. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem photoangeregten Donor zu einem Akzeptor-Fluoreszenzmolekül locat<html> in unmittelbarer Nähe (&lt;100) ed. Liganden oder Bindungsspaltung bewirkt eine Konformationsänderung in den Sensor, der wiederum induziert eine Änderung in der Nähe der Fluorophore, die zu einer Änderung im FRET-Effizienz durch die Änderung im Emissionsspektrum gemessen. FRET integrierten biologischen Sensoren (FIBS) konstitutiv in der Zelllinie hergestellt und ihre spektralen Eigenschaften ändern sich die Konzentration des Metaboliten in der Zelle. FIBS haben schnelle Reaktionszeiten machen sie ideal für Messungen für dynamische Modelle 6. Zurück Anwendungen umfassen die Überwachung und mehrfache Einzel 7-9 10 Metaboliten und Bereitstellung von Daten über raumzeitliche Verteilung 11. Apo-Max, wobei die Ligandenbindung stört die Nähe der Fluorophore Senkung der Energieübertragung und Apo-Min, wobei die Ligandenbindung bringt die beiden Fluorophore in engeren Kontakt (Fig. 1): FIBS kann in zwei Konfigurationen erzeugt werden. _content &quot;&gt; In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Konstruktion von Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zelllinien, die konstitutiv ein FIBS ein Metabolit Glucose oder Glutamin dargestellt. eine Methodik für die Kalibrierung des Sensors in vivo eingerichtet, um künftige quantitative Freigabe Messungen der intrazellulären Metaboliten-Konzentration, wie in Fig. 2 dargestellt. Auf dieser Grundlage wird die intrazelluläre Konzentration von Glucose oder Glutamin in Fed-Batch-Kulturen von CHO-Zellen bestimmt werden, an denen die beiden Nährstoffe in hohen Konzentrationen in-Verfahren zugegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung des Fluoreszenzsignals von den FIBS und dem zuvor konstruierten Eichkurve ist genau Vorhersage der intrazellulären Konzentration möglich, von einem unabhängigen enzymatischen Test bestätigt. Dieses Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegenüber gegenwärtigen analytischen Techniken, da sie nicht invasiv ist, kostengünstige und schnell, was eine Echtzeit-Signal der FIBS, die mon seinwährend der Kultivierungs itored.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="936">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">CHO-S Cells</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;">11619-012</td>
			<td style="width:459px;">Cell line will vary depending on the goals of the study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">pCDNA4/TO vector&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">TransIT-PRO Transfection Reagent</td>
			<td style="width:120px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:120px;">MIR 5700</td>
			<td style="width:459px;">Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Zeocin</td>
			<td style="width:120px;">Invivogen</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">CD-CHO medium</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10743-011</td>
			<td style="width:459px;">Cell growth medium is dependent upon the cells under study</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">100X HT Supplement</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">11067-030</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">25030032</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">InfinitePRO 200 plate reader</td>
			<td style="width:120px;">Tecan</td>
			<td style="width:120px;">FLx800TBI</td>
			<td style="width:459px;">Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="190" rowspan="6" style="height:190px;width:239px;">Filters for plate reader</td>
			<td rowspan="6" style="width:120px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:120px;">30000463</td>
			<td rowspan="6" style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(520NM BW 10NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(430NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022787</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">(465NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Maxiprep Plasmid Purification Kit</td>
			<td style="width:120px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">12163</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">A22189</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">EnzyChrom&#160; Glutamine Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">BioAssay systems</td>
			<td style="width:120px;">EOAC-100</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Improved Neubauer haemocytometer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">MNK-420-010N</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Nuaire</td>
			<td style="width:120px;">NU-5510E</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibs-enabled noninvasive metabolic profiling

Im Zeitalter der Computerbiologie, neue Hochdurchsatz-Versuchssysteme, um zu füllen und zu verfeinern Modelle, so dass sie für Prognosezwecke validiert werden erforderlich. Idealerweise würden solche Systeme mit geringem Volumen, die Probenahme und destruktiven Analysen ausschließt, wenn die Zeit natürlich Daten erhalten werden sollen sein. Was benötigt wird, ist eine in-situ-Monitoring-Tool, das in Echtzeit und nichtinvasiv die notwendigen Informationen mitteilen können. Eine interessante Möglichkeit ist die Verwendung von Fluoreszenz-, Protein-basierte biologische in vivo-Sensoren als Reporter der intrazellulären Konzentrationen. Eine besondere Klasse von Biosensoren, die in vivo-Anwendungen in Metaboliten Quantifizierung gefunden ist, wird auf Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen, die von einem Ligandenbindungsdomäne basierend verbunden. FRET integrierten biologischen Sensoren (FIBS) konstitutiv in der Zelllinie hergestellt, sie haben schnelle Reaktionszeiten und ihre spektralen chaschaften bezogen auf die Konzentration des Metaboliten in der Zelle ändern. In dieser Arbeit wird das Verfahren zur Konstruktion des chinesischen Hamsters (CHO)-Zelllinien, die konstitutiv ein FIBS für Glukose und Glutamin und die Kalibrierung der FIBS in vivo im Batch Zellkultur, um zukünftige Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten-Konzentration zu ermöglichen beschrieben. Daten von Fed-Batch-Kulturen von CHO-Zellen zeigt, daß die FIBS konnte in jedem Fall, um die sich ergebende Änderung der intrazellulären Konzentration zu detektieren. Verwendung des Fluoreszenzsignals von den FIBS und der zuvor konstruierten Eichkurve wurde die intrazelluläre Konzentration genau bestimmt, wie durch einen unabhängigen enzymatischen Assay bestätigt.

Ein Überblick der Methoden ist in Fig. 2 dargestellt. In der hier vorgestellten Arbeit wurden CHO-Zellen mit dem Vektor FIBS und stabile Zelllinien transfiziert wurden bei einem Antibiotikum Druck von 400 ug / ml Zeocin selektiert. Daher wurden zwei verschiedene stabile Zelllinien, die konstitutiv die Glucose und Glutamin Sensoren geschaffen. Fig. 1 zeigt die Konfiguration der beiden Biosensoren in dieser Studie verwendet. Der Glukosesensor ist auf der Apo-Max-Prinzip und die entsprech...

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FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

Eine Beschreibung, wie Förster Resonance Energy Transfer integriert biologischen Sensoren (FIBS) zur in-situ-Kalibrierung Metabolic Profiling vorgestellt. Die FIBS kann verwendet werden, um die intrazellulären Spiegel von Metaboliten nicht-invasiv Unterstützung bei der Entwicklung von Stoffwechselmodelle und Hochdurchsatz-Screening von Bioprozess-Bedingungen zu messen.

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