Name: fibs-enabled noninvasive metabolic profiling
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00
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우리는 친절 pUTKan 식물 발현 벡터 구축 FRET 글루타민을 공급하기위한 플라스미드 박사 우베 Ludewig (호헨 하임 대학교) FRET 친절하게 포도당으로 우리를 제공하기 위해 교수 울프 프로 머 (과학 카네기 연구소, 스탠포드 대학) 감사합니다. AB는 BBSRC 대상 우선 순위 Studentships 프로그램에 의해 자금 지원됩니다. CK와 KP은 모두 바이오 처리에 RCUK 동호회 지원합니다. CK는 재정적 지원 론자 생물 의약품에 감사하고자합니다. 합성 생물학 및 혁신 센터는 관대 EPSRC에 의해 지원됩니다.

1. 세포주 부흥 및 유지 <ol><li> 8 mM의 L-글루타민, 10 ㎖ / L 100 배의 산틴 / 티미 딘 보충 (완전 성장 매체)로 보충 9 ML CD-CHO 매체에 CHO 세포를 부활. </li><li> 5 분 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 신선한 완전 성장 배지 10 ㎖에 세포를 재현 탁. </li><li> 1 ㎖ 샘플을 제거하고 혈구에 트리 판 블루 염색 배제 방법을 사용하여 광학 현미경으로 가능한 세포 농도를 결정한다. </li><li> 125 ㎖의 3 × 10 5 세포...

<ol>
	<li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose,+lactate,+glutamate,+and+glutamine.">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li><li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection.">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li><li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein.">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li><li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system.">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels&#8212;the+Holy+Grail+in+muTAS.">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels&#8212;the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li><li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells.">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li><li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors.">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li><li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips.">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors.">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li><li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors.">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li><li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors.">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures.">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li><li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture.">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+binding+proteins:+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering.">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li></ol>

FIBS는 방법을 담금질 추출에서 발생하는 불확실성을 제거,이 경우 성장을 제한 영양소로, 생체 내 및 주요 분자의 현장 정량에 수 있습니다. 결과는 FIBS 신호 및 글루타민 및 글루코스 0.3-2 mm를 위해 1-5 mm 인 세포 내 농도 간의 상관 관계가 있다는 것을 시사한다. 배치 CHO 세포 배양,이 농도는, 지수 정지, 초기 하락 단계에서 발생된다. 지수 및 정지상은 적절한 공급 전략 디자인의 관?...

대사 산물의 모니터링은 공정 개발, 미디어 및 공급 설계 및 대사 공학을 포함한 바이오의 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 다양한 방법은 효소 1, 화학 2, 3 또는 결합 분석을 사용하여 농도를 측정 가능하다. 흥미로운 옵션은 형광등을 사용하는 것입니다, 단백질 기반의 주요 대사 산물의 세포 내 농도의 기자로 생체 내 생물학적 센서에. 소형화는 실제로 신호 대 잡음비의 4,5을 향상시키고 단백질 기반 센서 유전자 제공된 외인성 시약 대사 분석 필요 없다는 의미를 인코딩 할 수있는 매우 낮은 볼륨 내 분석, 형광 편리한 도구이다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 바이오 센서는 리간드 결합 도메인에 의해 연결된 두 개의 형광 단백질로 구성되어 있습니다. FRET은 수용체의 형광 분자 locat입니다에 사진 흥분 기증자로부터의 에너지의 비 복사 전송합니다<html> 근접 (&lt;100)에 에드. 리간드 결합 또는 벽개 차례로, 발광 스펙트럼의 변화에​​ 의해 측정 FRET 효율의 변화로 이어지는, 형광체의 근접성의 변화를 유도하고, 센서의 형태 적 변화를 일으키는. FRET 집적 생물학적 센서 (FIBS)는 구성 적 세포주 내에서 생산되고, 그 스펙트럼 특성은 세포 내의 대사 물질의 농도에 따라 변경. FIBS 동적 모델 6에 대한 측정을위한 이상적 빠른 응답 시간이있다. 이전 응용 프로그램은 7-9 단일 및 다중 열 대사를 모니터링하고 시공간 분포 (11)에 데이터를 제공하는 것을 포함. 리간드 결합 에너지 전송 및 리간드 결합 가까이 접촉 (그림 1)에 두 개의 형광 물질을 제공 아포 민을 낮추는 형광의 근접을 방해 아포 - 최대 : FIBS는 두 가지 구성으로 만들 수 있습니다. 이 작품에서 _content은 &quot;&gt;, 프로토콜은 구조적으로 신진 대사, 포도당 또는 글루타민 FIBS를 표현 (CHO) 세포주 중국어 햄스터 난소 구축을 위해 제공됩니다. 방법은 생체 내에서 센서의 교정에 설립되어 미래의 정량을 사용하도록 도 2에 제시된 것처럼. 이것을 기초 세포 내 대사 산물 농도의 측정은, 글루코스 또는 글루타민의 세포 내 농도가 어느이 영양분이 공정 중 높은 농도로 첨가하는, 유가 식 CHO 세포 배양에서 결정될 수있다. 결과 그것은 비 침습적, 저가이므로 독립적 효소 분석에 의해 확인 된 FIBS 및 이전 구성 검량선으로부터 형광 신호를 이용하여, 세포 내 농도의 정확한 예측이 가능하다는 것을 보여준다.이 방법은 현재의 분석 기술을 통해 상당한 이점을 제공한다 및 패스트 월 될 수 FIBS의 실시간 신호를주는문화 전반에 걸쳐 itored.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="936">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">CHO-S Cells</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;">11619-012</td>
			<td style="width:459px;">Cell line will vary depending on the goals of the study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">pCDNA4/TO vector&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">TransIT-PRO Transfection Reagent</td>
			<td style="width:120px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:120px;">MIR 5700</td>
			<td style="width:459px;">Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Zeocin</td>
			<td style="width:120px;">Invivogen</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">CD-CHO medium</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10743-011</td>
			<td style="width:459px;">Cell growth medium is dependent upon the cells under study</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">100X HT Supplement</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">11067-030</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">25030032</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">InfinitePRO 200 plate reader</td>
			<td style="width:120px;">Tecan</td>
			<td style="width:120px;">FLx800TBI</td>
			<td style="width:459px;">Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="190" rowspan="6" style="height:190px;width:239px;">Filters for plate reader</td>
			<td rowspan="6" style="width:120px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:120px;">30000463</td>
			<td rowspan="6" style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(520NM BW 10NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(430NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022787</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">(465NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Maxiprep Plasmid Purification Kit</td>
			<td style="width:120px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">12163</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">A22189</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">EnzyChrom&#160; Glutamine Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">BioAssay systems</td>
			<td style="width:120px;">EOAC-100</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Improved Neubauer haemocytometer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">MNK-420-010N</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Nuaire</td>
			<td style="width:120px;">NU-5510E</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibs-enabled noninvasive metabolic profiling

전산 생물학의 시대에, 새로운 높은 처리량 실험 시스템은 그들이 예측 목적의 유효성을 검사 할 수 있도록 모델을 채우고 세분화하기 위해 필요합니다. 이상적으로 그러한 시스템은 타임 코스 데이터가 수득 될 때 샘플링 및 파괴 분석을 배제 저용량, 것이다. 필요한 것은 실시간으로 그리고 간접적으로 필요한 정보를보고 할 수있는 시츄 모니터링 도구이다. 흥미로운 옵션은 형광등을 사용하는 것입니다, 단백질 기반의 세포 내 농도의 기자로 생체 내 생물학적 센서에. 대사 산물의 정량에 응용 프로그램을 발견했습니다 생체 바이오 센서의 하나의 특정 클래스는 리간드 결합 도메인에 의해 연결된 두 개의 형광 단백질 사이의 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기반으로합니다. 통합 생물 센서 (FIBS를) FRET이 구조적으로 세포주 내에서 생산, 그들은 빠른 응답 시간과 자신의 스펙트럼 차이세포 내 대사 산물의 농도에 따라 변경 racteristics. 본 논문에서는 세포 내 대사 산물 농도의 미래 정량을 가능하게하기 위해 구조적으로 포도당과 글루타민 FIBS를 표현 (CHO) 세포주 중국어 햄스터 난소를 구성하고 배치 세포 배양 생체 내에서 FIBS를 교정하는 방법이 설명되어 있습니다. 유가 식 CHO 세포 배양에서의 데이터 FIBS가 세포 내 농도의 결과 변화를 검출하는 각각의 경우에 수 있었다고 보여준다. 독립적 효소 분석에 의해 확인 된 FIBS 및 이전 구성 검량선으로부터 형광 신호를 이용하여, 세포 내 농도를 정확하게 측정 하였다.

방법론의 개요는 그림 2에 표시됩니다. 여기에 제시 한 연구에서, CHO 세포 FIBS 벡터와 안정 세포주에 형질 전환 된 400 ㎍ / ㎖의 오신의 항생제 압력에 선정되었다. 구조적으로 포도당과 글루타민 센서를 발현 개의 분리 안정한 세포주 따라서 생성되었다.도 1은 본 연구에서 사용 된 두 개의 바이오 센서의 구성을 도시한다. 글루코스 센서는 아포 - 맥스 원리에 근거하고 대...

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FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

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