Name: fibs-enabled noninvasive metabolic profiling
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00
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Agradecemos ao professor Lobo Frommer (Carnegie Institution for Science, da Universidade de Stanford) para gentilmente nos fornecer a glicose FRET plasmídeo e Dr. Uwe Ludewig (Universidade Hohenheim) por gentilmente fornecer a glutamina FRET construir no pUTKan planta vetor de expressão. AB é financiado pelo programa Studentships Prioritárias BBSRC alvejado. Ambos CK e KP são suportados por RCUK Bolsas em Processamento de Biofármacos. CK também agradece a Lonza Biologics pelo apoio financeiro. O Centro de Biologia Sintética e Inovação é generosamente apoiado pelo EPSRC.

1. Celular Linha Revival e Manutenção <ol><li> Reviver as células CHO em 9 ml de meio CD-CHO suplementado com 8 mM de L-glutamina e 10 ml / L de suplemento de 100x hipoxantina / timidina (meio de crescimento completo). </li><li> Centrifugar a 100 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em 10 ml de meio de crescimento completo fresco. </li><li> Retirar uma amostra de 1 ml e determinar a concentração de células viáveis ​​por microscopia de luz, utilizando o método de exclusão do corante azul tr...

<ol>
	<li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose,+lactate,+glutamate,+and+glutamine.">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li><li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection.">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li><li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein.">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li><li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system.">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels&#8212;the+Holy+Grail+in+muTAS.">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels&#8212;the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li><li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells.">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li><li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors.">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li><li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips.">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors.">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li><li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors.">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li><li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors.">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures.">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li><li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture.">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+binding+proteins:+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering.">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li></ol>

Os FIBS activar in vivo e in situ, a quantificação de moléculas-chave, neste caso nutrientes limitantes do crescimento, eliminando incertezas decorrentes de têmpera e métodos de extracção. Os resultados sugerem que existe uma boa correlação entre o sinal FIBS e as concentrações intracelulares na gama de 1-5 mM de glicose e 0,3-2 mM de glutamina. No lote CHO cultura de células, estas concentrações são encontradas nas fases de declínio exponencial, estacionárias, e no início. As fases exponencia...

Monitoramento metabolito tem diversas aplicações em bioprocessing, incluindo o desenvolvimento de processos, mídia e design de alimentação e engenharia metabólica. Vários métodos estão disponíveis para as medições de concentração através da utilização de um enzimática, química 2, ou ensaios de ligação 3. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres da concentração intracelular de metabolitos essenciais à base de proteínas. Em ensaios de ultra-baixo volume, a fluorescência é uma ferramenta conveniente como miniaturização realmente melhora a taxa de 4,5 sinal-ruído e sensores à base de proteínas podem ser geneticamente codificados sentido de que não há reagentes exógenos são necessários para análise de metabolitos. Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) biossensores consistem de duas proteínas fluorescentes ligadas por um domínio de ligação ao ligando. FRET é uma transferência não radiativa de energia a partir de um doador de foto-animado para um receptor molécula fluorescente loca<html> ed em estreita proximidade (&lt;100). Clivagem ligando ou ligação provoca uma alteração conformacional no sensor, o qual, por sua vez, induz uma mudança na proximidade dos fluoróforos, conduzindo a uma alteração na eficiência de TERF medido pela alteração no espectro de emissão. Sensores biológicos FRET integrados (FIBS) são constitutivamente produzido dentro da linha de células e as suas características espectrais são alteradas com base na concentração de metabolito no interior da célula. FIBS têm tempos de resposta rápidos, tornando-os ideais para a tomada de medidas para os modelos dinâmicos 6. Aplicações anteriores incluem o monitoramento único 7-9 e múltiplas 10 metabólitos e fornecendo dados sobre a distribuição espaço-temporal 11. FIBS podem ser criados de duas configurações: Apo-Max, onde a ligação do ligando perturba a proximidade dos fluoróforos reduzindo a transferência de energia e de Apo-Min, onde a ligação do ligando traz os dois fluoróforos em contacto mais próximo (Figura 1). _content &quot;&gt; Neste trabalho, um protocolo para a construção são apresentados de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares que expressam constitutivamente um FIBS para um metabolito de glucose ou glutamina. está estabelecido um método para a calibração do sensor in vivo, para permitir futura quantitativa medições de concentração de metabolito intracelular, tal como apresentado na Figura 2. Baseado nisto, a concentração intracelular de glucose ou glutamina pode ser determinada em fed-batch culturas de células CHO, em que os dois nutrientes foram adicionados em concentrações elevadas no processo. Os resultados demonstram que a utilização do sinal de fluorescência a partir das FIBS e da curva de calibração previamente construído, com precisão de previsão da concentração intracelular é possível, tal como foi confirmado por um ensaio enzimático independente. Este método oferece vantagens substanciais em relação às tecnologias analíticas correntes, porque ele não é invasivo, de baixo custo e rápida, dando um sinal em tempo real dos FIBS que podem ser monitored em toda a cultura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="936">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">CHO-S Cells</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;">11619-012</td>
			<td style="width:459px;">Cell line will vary depending on the goals of the study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">pCDNA4/TO vector&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">TransIT-PRO Transfection Reagent</td>
			<td style="width:120px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:120px;">MIR 5700</td>
			<td style="width:459px;">Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Zeocin</td>
			<td style="width:120px;">Invivogen</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">CD-CHO medium</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10743-011</td>
			<td style="width:459px;">Cell growth medium is dependent upon the cells under study</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">100X HT Supplement</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">11067-030</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">25030032</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">InfinitePRO 200 plate reader</td>
			<td style="width:120px;">Tecan</td>
			<td style="width:120px;">FLx800TBI</td>
			<td style="width:459px;">Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="190" rowspan="6" style="height:190px;width:239px;">Filters for plate reader</td>
			<td rowspan="6" style="width:120px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:120px;">30000463</td>
			<td rowspan="6" style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(520NM BW 10NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(430NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022787</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">(465NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Maxiprep Plasmid Purification Kit</td>
			<td style="width:120px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">12163</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">A22189</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">EnzyChrom&#160; Glutamine Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">BioAssay systems</td>
			<td style="width:120px;">EOAC-100</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Improved Neubauer haemocytometer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">MNK-420-010N</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Nuaire</td>
			<td style="width:120px;">NU-5510E</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibs-enabled noninvasive metabolic profiling

Na era da biologia computacional, novos sistemas experimentais de alto rendimento são necessárias para preencher e refinar os modelos para que possam ser validadas para fins preditivos. Idealmente esses sistemas seria baixo volume, o que impede análises de amostragem e destrutivas, quando os dados do curso do tempo devem ser obtidos. O que é necessário é uma ferramenta de monitoramento em situ que pode relatar as informações necessárias em tempo real e de forma não invasiva. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres de concentrações intracelulares baseados em proteína. Uma classe especial de in vivo biossensores que tem encontrado aplicações em metabolito quantificação baseia-se na transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre duas proteínas fluorescentes ligadas por um domínio de ligação ao ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) são constitutivamente produzido dentro da linha celular, eles têm tempos de resposta rápidos e sua cha espectralcas mudar de acordo com a concentração de metabolito no interior da célula. Neste papel, o método para a construção de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares que expressam constitutivamente um FIBS para glicose e glutamina e calibrar os FIBS in vivo em cultura de células em lotes a fim de permitir futura quantificação da concentração intracelular do metabolito é descrito. Os dados de batelada alimentada CHO culturas celulares demonstra que os FIBS foi capaz, em cada caso, para detectar a alteração resultante na concentração intracelular. Usando o sinal de fluorescência a partir das FIBS e a curva de calibração construída anteriormente, a concentração intracelular foi determinada com precisão, como confirmado por um ensaio enzimático independente.

Uma visão geral da metodologia é apresentada na Figura 2. No trabalho aqui apresentado, as células CHO foram transfectadas com o vector de linhas de células estáveis ​​foram seleccionadas FIBS e a uma pressão de antibiótico de 400 ug / ml de zeocina. Por conseguinte, foram criadas duas linhas de células estáveis ​​que expressam constitutivamente separados os sensores de glicose e glutamina. Figura 1 representa as configurações dos dois biossensores utilizados neste es...

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FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

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