Name: fibs-enabled noninvasive metabolic profiling
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling at JoVE.com

Мы благодарим профессора Вольфа Фроммер (Институт Карнеги по науке, Стэнфордский университет) за любезно предоставленные нам с глюкозой FRET плазмиды и д-р Уве Людвиг (Хоэнхайм университет) за любезно поставляет глютамин FRET построить в растительном вектор экспрессии pUTKan. А.Б. финансируется BBSRC Целевая программа Приоритетные Studentships. Оба CK и КП поддерживаются RCUK стипендий в Biopharmaceuticals обработки. CK также хотела бы поблагодарить Lonza Biologics за их финансовую поддержку. Центр по синтетической биологии и инноваций щедро поддерживается EPSRC.

1. Сотовый Возрождение линия и обслуживание <ol><li> Оживление клеток СНО в 9 мл CD-СНО среде с добавлением 8 мм L-глутамина и 10 мл / л 100x гипоксантин / тимидина дополнения (полной среды роста). </li><li> Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин. </li><li> Ресуспендируют клеток в 10 мл свежей полной среды роста....

<ol>
	<li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose,+lactate,+glutamate,+and+glutamine.">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li><li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection.">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li><li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein.">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li><li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system.">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li><li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels&#8212;the+Holy+Grail+in+muTAS.">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels&#8212;the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li><li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells.">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li><li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors.">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li><li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H(+)-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips.">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors.">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li><li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors.">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li><li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors.">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels.">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering.">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li><li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures.">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li><li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture.">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+binding+proteins:+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering.">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li></ol>

В ФИБС включить в естественных условиях и на месте количественного ключевых молекул, в данном случае ограничивающим рост питательных веществ, удаление неопределенности, вытекающие из закалки и добыча методы. Полученные данные свидетельствуют, что существует хорошая коррел?...

Мониторинг метаболитов имеет различные применения в биотехнологической, в том числе развития процесса, СМИ и дизайна корма, и метаболической инженерии. Имеются различные методы для измерения концентрации с использованием ферментативных 1, химического 2 или 3 анализах связывания. Интересный вариант является использование люминесцентные, на основе белков в естественных биологических датчиков, как репортеры внутриклеточной концентрации ключевых метаболитов. В ультра-низких анализов объема, флуоресценция является удобным инструментом как миниатюризация действительно улучшает отношение 4,5 сигнал-шум и датчики на основе белков могут быть генетически закодированы смысл, что никакие внешние реагенты не являются необходимыми для анализа метаболитов. Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) биосенсоры состоят из двух флуоресцентных белков, соединенных связывающего домена лиганда. FRET является безызлучательный передача энергии от фотовозбужденной донора к нахо молекулы флуоресцентного акцепторной<html> ред в непосредственной близости (&lt;100). Лиганд расщепление или связывание вызывает конформационное изменение в датчике, который, в свою очередь, вызывает изменение в непосредственной близости от флуорофоров, что приводит к изменению эффективности FRET, измеренной по изменению спектра излучения. FRET интегрированные биологические датчики (ФИБС) конститутивно производимые в клеточной линии и их спектральные характеристики меняться в зависимости от концентрации метаболита в клетке. ФИБС имеют быстрое время отклика делает их идеальными для проведения измерений для динамических моделей 6. Предыдущие применения включают мониторинг одиночные 7-9 и несколько 10 метаболитов и предоставление данных о пространственно-временного распределения 11. ФИБС могут быть созданы в двух конфигурациях: Апо-Max, где обязательным лиганд нарушает близость флуорофорами понижающей передачи энергии и APO-Мин, где обязательным лиганд приносит два флуорофоры в более тесный контакт (рис. 1). _content &quot;&gt; В этой работе, протокол представлен для построения яичника китайского хомячка (СНО) клеточные линии, которые конститутивно выражают ФИБС для метаболита, глюкоза или глутамина. Методология устанавливается для калибровки датчика в естественных условиях, с тем чтобы в будущем количественные измерения внутриклеточной концентрации метаболитов, как представлено на рисунке 2. Исходя из этого, внутриклеточная концентрация глюкозы или глутамина может быть определена в подпиткой СНО клеточных культурах, к которым были добавлены два питательных веществ в высоких концентрациях в процессе. Результаты демонстрируют, что с помощью флуоресцентного сигнала от FIBS и ранее построенной градуировочной кривой, точно предсказание внутриклеточной концентрации можно, как это было подтверждено независимым ферментативного анализа. Этот метод дает значительные преимущества по сравнению с текущим аналитических технологий, поскольку он является неинвазивным и недорогой и быстро, давая в реальном времени сигнал FIBS, которые могут быть ПНотслеживаться по всей культуре.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="936">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">CHO-S Cells</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;">11619-012</td>
			<td style="width:459px;">Cell line will vary depending on the goals of the study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">pCDNA4/TO vector&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Life Tecnologies</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">TransIT-PRO Transfection Reagent</td>
			<td style="width:120px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:120px;">MIR 5700</td>
			<td style="width:459px;">Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Zeocin</td>
			<td style="width:120px;">Invivogen</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">CD-CHO medium</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">10743-011</td>
			<td style="width:459px;">Cell growth medium is dependent upon the cells under study</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">100X HT Supplement</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">11067-030</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">25030032</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">InfinitePRO 200 plate reader</td>
			<td style="width:120px;">Tecan</td>
			<td style="width:120px;">FLx800TBI</td>
			<td style="width:459px;">Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="190" rowspan="6" style="height:190px;width:239px;">Filters for plate reader</td>
			<td rowspan="6" style="width:120px;">Tecan</td>
			<td align="right" style="width:120px;">30000463</td>
			<td rowspan="6" style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(520NM BW 10NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022786</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:120px;">(430NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="right" height="21" style="height:21px;width:120px;">30022787</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">(465NM BW 35NM)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Maxiprep Plasmid Purification Kit</td>
			<td style="width:120px;">Qiagen</td>
			<td style="width:120px;">12163</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:120px;">A22189</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">EnzyChrom&#160; Glutamine Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">BioAssay systems</td>
			<td style="width:120px;">EOAC-100</td>
			<td style="width:459px;">Any suitable kit can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:239px;">Improved Neubauer haemocytometer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">MNK-420-010N</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:239px;">Incubator&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Nuaire</td>
			<td style="width:120px;">NU-5510E</td>
			<td style="width:459px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibs-enabled noninvasive metabolic profiling

В эпоху вычислительной биологии, новых высокой пропускной экспериментальные системы необходимы для того, чтобы заполнить и уточнения модели, чтобы они могли быть подтверждено для целей прогнозирования. В идеале такие системы будет низкий объем, что исключает отбора проб и разрушительные анализы, когда данные время курс должны быть получены. Что необходимо, так это в мониторинг Ситу инструмент, который может сообщить необходимую информацию в режиме реального времени и неинвазивного. Интересный вариант является использование люминесцентные, на основе белков в естественных биологических датчиков, как репортеры внутриклеточной концентрации. Один конкретный класс естественных условиях биосенсоров в том, что нашла свое применение в метаболита количественного основана на Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) между двумя флуоресцентных белков, соединенных связывающего домена лиганда. FRET интегрированных биологических сенсоров (FIBS) конститутивно производимые в клеточной линии, они имеют быстрое время отклика и их спектральную чаracteristics меняться в зависимости от концентрации метаболита в клетке. В данной работе метод построения яичника китайского хомячка (СНО) клеточные линии, которые конститутивно выражают ФИБС для глюкозы и глутамина и калибровки ФИБС в естественных условиях в культуре пакетном клеток, с тем чтобы в будущем количественную оценку внутриклеточной концентрации метаболита описывается. Данные из подпиткой СНО клеточных культур показывает, что FIBS смог в каждом случае, чтобы обнаружить изменения в результате внутриклеточной концентрации. Использование флуоресцентного сигнала от FIBS и ранее построенной градуировочной кривой, внутриклеточная концентрация была точно определена как подтверждена независимым ферментативного анализа.

Обзор методологии представлена ​​на рисунке 2. В работе, представленной в данном документе, клетки СНО, трансфицированных вектором FIBS и стабильных клеточных линий были выбраны при давлении антибиотиками 400 мкг / мл зеоцина. Два отдельных стабильные клеточные линии конституит...

Watch this Scientific Journal Video about FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling at JoVE.com

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

Описание того, как для калибровки Ферстер резонансный перенос энергии интегрированных биологических сенсоров (FIBS) для на месте метаболического профилирования представлена. В FIBS может быть использован для измерения внутриклеточные уровни метаболитов неинвазивно, помогающих в развитии метаболических моделей и высокопроизводительного скрининга условий биотехнологических.

ФИБС поддержкой неинвазивной метаболического профилирования

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

В месте сжатие Загрузка и корреляционного неинвазивной визуализации кости-периодонтальной связки зуба волокнистых совместных

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Количественное и размер-профилирование внеклеточной везикул с использованием перестраиваемый Резистивный Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Легкая и точная механотерапии профилирование на Micropost массивов

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Метаболизм Glycoengineering, сиаловые кислоты, с помощью N-ацил-изменение Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Метаболические поддержке подакцизным, живые ткани мозга во время приобретения микроскопии магнитного резонанса

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry: Мощный, неинвазивная подход к расследованию клеточной энергии метаболизма

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Наносенсоры обнаружить протеазы активность In Vivo для неинвазивной диагностики

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Человек 3D Экстраклеточная матрица-Адипоцит Культура Модель для изучения Матрица-Клеточная метаболический перекрестный разговор

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...