Name: optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fraunhofer USA Center for Molekylær Bioteknologi, Ibio, Inc. og Defense Advanced Research Projects Agency (tilskud # HDTRA1-07-C-0054). Forfatterne erkender de generøse gaver af Drs. Stanton Gelvin of Biological Science afd., Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammer) og Wayne Fitzmaurice af Large Scale Biology Corp (N. excelsiana frø) samt Jennifer Nicholson of US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. Excelsior frø ). Forfatterne takker Margaret Shillingford og Christopher Hull for at levere planter og fremragende teknisk assistance. Forfatterne takker også Drs. Stephen Streatfield og Natasha Kushnir til redaktionel assistance.

1.. Planteavl Til efterfølgende agroinfiltration vi evalueret to vildtype Nicotiana arter (N. benthamiana og N. Excelsior) og en hybrid (N. excelsiana) dyrket hydroponically på rockwool i indendørs faciliteter. <ol><li> Soak rockwool plader i en plante gødning løsning. </li><li> Soen frø af vildtype N. benthamiana, N. excelsior og N. excelsiana (hybrid af N. benthamiana × N. excelsior) på de næringsstoffer gennemblødt rockwool overflade. </li><li> Dyrke planter fra frø under kontrollerede betingelser (24 ° C og 40-65% relativ fugtighed) og en lang dag fotoperiode (14 timers lys og 10 timers mørke, med belysning af 130-150 uE m -2 sek -1) 4-5 uger for N. benthamiana og N. excelsiana og 5-6 uger for N. excelsior. </li></ol> 2.. Konstruktion af vektorer for Agroinfiltration <ol><li> Indsæt en syntetisk reporter gen (grønt fluorescerende protein [GFP]), fuld længde hæmagglutinin (HA) fra A/California/04/2009 stamme af influenza virus (HAC1), og omlagte lichenase enzym (LicKM) 18 separat i lanceringen vektor pBID4 18 (TMV-baserede vektor) for at opnå pBID4-GFP, pBID4-HAC1 og pBID4-LicKM hhv 18,32,41,47. </li><li> Indførelse 10-50 ng pBID4 bærer GFP eller HAC1 i elektrokompetente celler af A. tumefaciens stamme GV3101 og LicKM i elektrokompetente celler af A. tumefaciens stammer GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 og A4 med genet MicroPulser elektroporator. </li><li> Brug transformerede Agrobakterier for infiltration eksperimenter, medmindre andet er angivet. </li></ol> 3.. Støvsug Infiltration af Agrobacterium i Nicotiana Planter <ol><li> Grow A. tumefaciens stammer natten over (O / N) i LB-medium, YEB withium eller AB-medium suppleret med 50 mg / L kanamycin ved 28 ° C med omrystning ved 200-250 rpm. </li><li> Fortynd Agrobakterier i Milli-Q-vand til en optisk densitet ved 600 nm (A600) på 0,5 eller centrifugeres Agrobacterium-celler dyrket i LB eller YEB eller AB ved 4.000 × g i 10 min ved 4 ° C, re-suspendere induktion medium (1x MS salt, 10 mM MES, 200 uM acetosyringon, 2% saccharose [MMA]) til A600 på 0,5, og der omrøres ved stuetemperatur i 1-3 time, med mindre andet er angivet. </li><li> Infiltrere planter i et vakuumkammer ved at nedsænke Nicotiana plante luften væv i Agrobacterium suspension og at anvende en 50-400 mbar vakuum i 30 eller 60 sek. Den optimale infiltration anvendes rutinemæssigt ved 50-100 mbar i 60 sek. </li><li> Når vakuummet er brudt, fjernes planterne fra vakuumkammer, skylles i vand, og vokse i 5-7 dage under de samme vækstbetingelser, der anvendes til præ-infiltration vækst. </li><li> For at teste effektivitetenkemikalier inducerer Agrobacterium vir-genet, forskellige koncentrationer af acetosyringon (0, 100, 200 eller 400 pM) blev tilsat til Agrobacteria suspenderet i infiltration buffer (1x MS, 10 mM MES, 2% glucose). For effekten af monosaccharid på induktion af vir-genet forskellige procentdele af glukose (0, 1, 2 eller 4%) blev tilsat til Agrobacteria suspenderet i infiltration buffer (1x MS, 10 mM MES, 200 uM acetosyringon). N. benthamiana planter blev infiltreret som nævnt ovenfor i trin 3.3 og 3.4). </li><li> Agrobacterium laboratoriestammer GV3101, C58C1 og LBA4404 og vildtypestammer A4, AT06, AT10 og At77 huser pBID4-LicKM vektor blev fortyndet i Milli-Q-vand til A 600 på 0,5. N. benthamiana planter blev infiltreret med hver enkelt stamme som nævnt ovenfor i trin 3.3 og 3.4. </li></ol> 4.. Co-agroinfiltration Procedure for Viral Silencing lyddæmper <ol><li> MIX, de Milli-Q vand fortyndet Agrobacterium GV3101 kulturer bærer GFP-genet og den virale undertrykkelse suppressor p19 tomat busket stunt virus (TBSV) ved 1:1, 2:1, 3:01 og 4:01 nøgletal. Infiltrere N. benthamiana planter som beskrevet ovenfor. </li><li> Infiltrere N. benthamiana planter med en blanding af to Milli-Q vand fortyndet Agrobacterium GV3101 kulturer: den første bærer pBID4-HAC1 plasmid, og den anden bærer en af undertrykkelse undertrykkere - P19 af TBSV eller p23 Citrus tristeza virus, i pCassp plasmid ( pCassp19) og i PGR binære plasmid under 35S promotoren (PGR-P23), henholdsvis i forholdet 4:1. </li></ol> 5.. Western Blot analyse <ol><li> Saml tilfældige bladprøver fra N. benthamiana, N. excelsior eller N. excelsiana planter på 4-7 dpi og pulverisere i flydende nitrogen til et fint pulver. </li><li> Tilsæt tre volumener 1x PBS-buffer indeholdende 0,5% TritonX-100 til hver prøve. </li><li> Ryst forsigtigt de udtrukne prøver i 15 min ved 4 ° C. </li><li> Spin ekstraktet i 5 minutter og indsamle totalt opløseligt protein i et rent Eppendorf-rør. </li><li> Fortyndes ekstrakterne til en passende fortynding (1:50 1:100) i 1x PBS ekstraktionsbuffer, og der tilsættes 5 × prøvepuffer (250 mM Tris-HCI [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% bromphenolblåt, 50% glycerol v / v, og 500 mM DTT) til en endelig 1 × koncentration. </li><li> Kog prøver i 5 min. </li><li> Separate proteiner ved 10% SDS-PAGE, overførsel til Immobilon-P overføringsmembran, og blokere med 0,5% I-blokken. </li><li> Detect GFP under anvendelse af kanin polyklonalt anti-GFP-antiserum på 1:5000 og HAC1 anvendelse af muse-anti-polyhistidin-monoklonalt antistof på 1:1000 i blokerende opløsning i 1 time. </li><li> Efter den primære antistof mærkning vaske membranerne tre gange i 10 minutter hver med 1 × PBST-20 og inkuberes med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret anti-kanin-antistof på 1:5000 eller et HRP-konjugatd anti-muse-antistof ved 1:10.000 i 1 time for GFP og HAC1 detektion hhv. </li><li> Proces Western blots under anvendelse af SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrat. </li><li> Brug GeneTools Software til at analysere båndintensitet af proteinet og få båndet kalibreret mængde. </li></ol> Protein produktion: (kalibreret mængde x fortynding af prøven) / prøvemængde lastet) x 4 = mg / kg. Ligning: Protein produktion (P), Kalibreret mængde (C), fortynding af prøven (D) og prøvemængde indlæst (S). 6.. Zymogram Assay <ol><li> Saml pBID4-LicKM-infiltreret N. benthamiana tilfældig vævsprøver. </li><li> Uddrag proteiner under anvendelse af de samme metoder som beskrevet ovenfor for Western blot-analyse, og derefter analysere ved 10% SDS-PAGE med 0,1% lichenan inkluderet i gelerne. </li><li> Efter elektroforese vaskes gelerne to gange i 10 min i vaskepuffer (100 mM Tris-HCI [pH 8,0], og 0,1% Triton X-100), Og derefter inkuberes i vaskebuffer ved 65 ° C i 1 time. </li><li> Efter inkubation kassere vaskepufferen og plette gelerne med 0,5% Congo Red i 5 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Skyl gelerne i Milli-Q-vand tre gange i 10 minutter hver, og der tilsættes 1 M NaCI for at visualisere lichenase aktivitet. Det oprensede bakterielle lichenase-protein blev anvendt som en positiv kontrol for enzymaktivitet. </li></ol> 7.. GFP Imaging <ol><li> Udfør visuel detektering af GFP-fluorescens i hele transient transformerede planter ved hjælp af en håndholdt langbølget UV-lampe. </li><li> Foto forbigående transformerede planter med et digitalt kamera ved hjælp af en gul 8, ES 52 filter (eksponeringstid, 15 sek). </li><li> Få billeder fra Western blot-analyser ved hjælp af GeneSnap software på en GeneGnome og kvantificere resultaterne ved hjælp af GeneTools software, med en kalibreringskurve baseret på renset GFP standard. </li><li> Kvantificere HAC1-protein ved hjælp af en kalibreringskurve baseret på rensninged HAC protein standard fra A/Indonesia/05/05 stamme af influenzavirus. </li><li> Beregn middelværdier 3-4 replikater for alle forsøg. </li></ol>

Vi har intet at afsløre.

I denne undersøgelse har vi udviklet en simpel agroinfiltration protokol til rutinemæssig forbigående protein produktion i udvalgte Nicotiana art efter Agrobacterium stammer, der bærer lanceringen vektor. Desuden har vi identificeret de optimale betingelser for at opnå den højeste produktion af rekombinant protein-niveau i vores forbigående plante ekspressionssystem. Vacuum infiltration af den fortyndede A. tumefaciens stamme GV3101 huser lanceringen vektor pBID4 i N. benthamiana, N. excelsiana og N. træuld resulterede i højere niveauer af målprotein produktion indenfor 7 dpi sammenlignet med andre plantearter, såsom Pisum sativum infiltreret med GV3101 huser Alfalfa mosaikvirus - eller Cucumber mosaic virus-baserede vektorer, der udtrykker GFP-reportergenet under 35S-promotoren 41 eller Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum og Arabidopsis thaliana infiltreret med C58C1 stamme af A. tumefaciens bærer beta-glucuronidase-reportergenet 57. N. benthamiana og N. excelsiana var let at støvsuge infiltrere på 50 mbar for 30-60 sek, med 90-95% infiltration effektivitet. De resterende 5-10% af bladareal blev ikke infiltreret på grund af nogle flydende blade på overfladen af Agrobacterium suspension under påføring af vakuum. Siden lanceringen vektor har evnen til celle-til-celle-bevægelse 18 forekommer transient protein akkumulering i hele blade samt stilke ved 7 dpi. Ved 10 dpi, den anslåede GFP produktion var lidt lavere, fordi pBID4 ekspressionsvektoren er i stand til at bevæge sig fra celle til celle, men ikke at flytte systemisk 18; derfor behøver nyligt dyrkede blade ikke indeholde vektoren og ikke bidrager til produktionen af ​​målet. Desuden nedbrydning af det rekombinante protein med tiden may bidrage til reduceret proteinindhold på 10 dpi. Vores resultater viste, at infiltration af A. tumefaciens stamme GV3101 medierede høje niveauer af forbigående proteinproduktion i N. benthamiana. Endvidere kan målproteinet manipuleret som N-terminale, C-terminale eller interne fusioner til Lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, der er et termostabilt enzym fra Clostridium thermocellum og giver termostabilitet til mange mål proteinfusion 18. Infiltration af N. benthamiana med A. tumefaciens vildtypestammer (AT6, AT10 og at77) huser genet af interesse fremkaldte milde eller svære symptomer: blad curling, petiole forlængelse, og curling. Ingen patologiske symptomer blev observeret i N. benthamiana infiltreret med laboratoriet stamme GV3101 huser tom pBID4 vektor, mens nogle gener indsat i pBID4 og omdannet til laboratoriestammer GV3101, C58C1 eller LBA4404 fremkaldte mild nekrotiske svar og bladeklorose / gulfarvning symptomer i infiltrerede regioner af blade. Nekrotiske symptomer forårsaget af vildtype-Agrobacterium eller frakoblet stammer i natskyggefamilien planter er blevet rapporteret tidligere 56,57. Nekrotisk respons kunne medføre virulensfaktorer type III secerneringssystem, bakterielle proteiner overføres til plantecellen ved type IV secerneringssystem, og / eller følsomhed over for flagellin 58-60. Vi har fundet, at forbigående produktion af heterologe proteiner kan også fremkalde patogenicitet og en allergisk reaktion i infiltreret bladene. Mange forskere rapporterede, at agroinfiltration af forskellige plantearter med plante binære vektorer produceret op til 5-20 gange højere niveauer af forbigående protein produktion i forhold til stabilt transformerede planter 28,57. Vores data viser, at N. benthamiana infiltreret med GV3101 huser pBID4-GFP transient udtrykte høje niveauer af GFP, hvilket svarer til GFP udbytte rapporteret forN. benthamiana infiltreret med Agrobacteria bærer Pich-GFPSYS viral vektor (op til 80% af det totale opløselige protein) 44.. Agroinfiltration hjælp af vores lancering vektor resulterede i høj produktion af termostabile protein LicKM, 50-fold højere end den observeret ved anvendelse af en standard binært plasmid 18. For at teste smitsomheden af A. tumefaciens og stabiliteten af lanceringen vektor, vi infiltrerede en flad af N. benthamiana hver time i op til 8 timer ved hjælp af den samme Milli-Q-vand-fortyndet kultur GV3101 huser pBID4-GFP plasmid. Vores data viste, at GV3101 stammen effektivt er smitsomt mindst 8 timer og pBID4 (lanceringen vektor) er meget stabil i 8 timer lange infiltration. Glycerol bestand af GV3101 stamme, der huser lanceringen vektor pBID4-HAC1 (celle bank), opbevaret ved -80 ° C har vist sig at være meget stabil i tre år uden ændringer i forbigående protei produktionen i infiltrerede planter. N. benthamiana planter dyrket under optimale betingelser, og mellem 35 og 42 dage efter såning var optimal for vakuum infiltration-medieret transient genekspression 40. Yngre planter (3-4 uger gamle) ikke kan infiltreret udelukkende på grund af blade flyder på cellesuspensionen overflade og vævsskade fra de mekaniske virkninger af anvendelse af et vakuum. I planter ældre end 45 dage, N. benthamiana boltning tidspunkt under optimale lysforhold anvendes, niveauet af transient ekspression er lav. Lavmolekylære phenolforbindelser (acetosyringon) og monosaccharaides (glukose) er kendt for at inducere vir gener i A. tumefaciens 55,61. Desuden infiltration af N. benthamiana med den binære vektor pCAMBIA (GFP) i overværelse af acetosyringon på koncentrationerne af 50-600 uM blev vist at stige en smule forbigåendegenekspression 40. Vi undersøgte effekten af ​​forskellige koncentrationer af acetosyringon og glukose i vores system ved at tilføje disse forbindelser til GV3101 kulturer huser pBID4-GFP i MMA i 3 timer, og fandt ingen forskel i GFP udtryk. Interessant, GV3101 kulturer huser pBID4-GFP og udvandet i Milli-Q vand til en A 600 på 0,5 og infiltreret uden vir geninduktion udtrykte de samme mængder af GFP som dem infiltreret med inducerede kulturer. A. tumefaciens vir gen (er) kunne potentielt være fremkaldt af plante phenolforbindelser (acetosyringon og sinapininsyre) og plante monosaccharaides (glukose og fruktose) til stede i bladvæv. Derfor har vi spekulere, at tilsvarende niveauer af GFP-ekspression i nærvær eller fravær af exogene vir gen fremmere kan være et resultat af virkningen af cytoplasmatiske vir gen inducere stede under replikation af GFP-udtrykkende lancering vektoren i planteceller. N. benthamiana har været anvendt som en model vært for forbigående proteinproduktion 49. Men N. benthamiana &#39;s relativt lave biomasseudbytte hindrer sin ansøgning om storstilet produktion af rekombinante proteiner. Den optimale vært bør kombinere et højt transient ekspression, let vækst i et drivhus, og være modtagelige for Agrobacterium infiltration 2. Hvis du vil vælge en alternativ vært, vi infiltrerede to forskellige vildtype-arter af Nicotiana (N. benthamiana og N. excelsior) og en hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) med A. tumefaciens stamme GV3101 huser pBID4-GFP plasmid. Blandt disse tre arter, omfanget af GFP-ekspression var lidt højere i N. benthamiana. N. Excelsior planter viste svært ved vakuum agroinfiltration grund af deres læderagtige blade, og N. excelsianaproduceret cirka to gange mere biomasse under de samme vækstbetingelser. Den forbigående produktion af GFP ved 7 dpi er forholdsvis ens i N. benthamiana og N. excelsiana. Derfor N. excelsiana kan være en mere egnet vært til produktion af rekombinante proteiner. Agrobacterium-medieret forbigående proteinproduktion er begrænset af PTGS 26, som kan overvindes ved co-ekspression af gen silencing suppressorer af plantevirus-oprindelse 62. Forbigående proteinproduktion er tidligere blevet vist at blive forbedret 50 gange i nærvær af p19 proteinet af TBSV, som hæmmer PTGS i infiltreret væv 34. I vores undersøgelse har vi vurderet effekten af ​​to virale lyddæmpende undertrykkere (P19 og P23) separat co-infiltreret med lanceringen vektor pBID4-HAC1. Den co-infiltration af disse lyddæmpningssystemer undertrykkere syntes at have ringe indflydelse på transient ekspression af HAC1, med kun en svag stigning i HAC1protein akkumulation (15-25%) i tilstedeværelse af co-infiltreret p23 eller p19. Til positivt at påvirke protein-produktion, kan være nødvendigt at være specielt udvalgt til at være effektive for de målrettede plantearter og viral vektor 63. lyddæmpningssystemer undertrykkere. TMV helicase har en suppressor af RNA silencing aktivitet 64,65. Vores data bekræfter denne observation som co-infiltration af p23 eller p19 med pBID4-HAC1 resulterede ikke i nogen stigning i GFP eller en svag stigning i den forbigående HAC1 proteinproduktion. Afslutningsvis har vi ændret og optimeret anlæg og Agrobacterium vækstbetingelser og forbedret effektiviteten af vakuum infiltration. Denne teknologi muligt for os at vokse og infiltrere hundrede kilo plantemateriale i et par timer. Vi har med held automatiseret planten forbigående udtryk teknik til produktion af høj-throughput vaccine mod industrielle skalaer under de nuværende Good Manufacturing Practice (cGMP) betingelser. For mere information ABOut automation og udnyttelse af anlægget forbigående proteinproduktion system til produktion af rekombinante proteiner, herunder underenhed vaccinekandidater under cGMP betingelser, er læserne henvises til hjemmesiden <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Planter er nu anerkendt som en sikker, pålidelig, skalerbar og billig platform til produktion af heterologe rekombinante biofarmaceutiske og industrielle proteiner 1-3 og har vigtige fordele i forhold mikrobielle og animalske celleekspressionssystemer 4. Planter er i stand til at udtrykke korrekt foldede proteiner med post-translationelle modifikationer, herunder samlet multimeriske antistoffer 5-7. Adskillige plantebaserede rekombinante farmaceutiske proteiner undergår klinisk evaluering 8. Disse omfatter patient-specifikke rekombinante idiotype vacciner (scFv) til behandling af non-Hodgkins lymfom 9, hemagglutinin-baserede pandemi og sæsonbestemte influenza vaccine kandidater 10,11 (Cummings et al., Der blev forelagt Vaccine), anti-Streptococcus overflade antigen I / II-antistof til behandling af caries 12 og humant insulin til behandling af diabetes 13. Derudover er menneskelig Recombinant glucocerebrosidase for enzymsubstitutionsterapi patienter med Gauchers sygdom er blevet godkendt i Israel og USA, og gives under programmet for forlænget adgang uden for USA 14,15. Heterologe proteiner kan produceres i stabilt transformeret (transgen eller transplastomic) eller transient transformerede planter. Forbigående protein produktion giver flere fordele i forhold til produktionen i transgene planter, herunder kort tidshorisont for at opnå ekspression og akkumulering 16, og kan opnås ved at indføre bakterielle binære vektorer eller rekombinante plante virale vektorer i plantevæv 4. Den mest avancerede transient ekspression systemet er baseret på brugen af &#39;launch vektorer&#39;, der kombinerer elementer af plante virus og binære plasmider, og er leveret af agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration for lancering vektor baseret på tobak (TMV) er blevet anvendt med succes på labskaleres til at producere vaccine antigener mod patogener såsom humant papillomvirus 19, Yersinia pestis 20, influenzavira A 21,22, Bacillus anthracis 23 og koppevirus 24 i N. benthamiana blade. Agrobacterium-medieret transient ekspression er også en lovende metode til samtidig produktion af multiple proteiner 2,25-27. For eksempel har plante Transiente ekspressionssystemer er blevet anvendt til at producere tumor-specifikke rekombinante antistoffer 28,29, et glycosyleret rekombinant antistof mod epidermal vækstfaktorreceptor 30, og et monoklonalt antistof specifikt for miltbrand beskyttende antigen 31,32. Co-infiltration af Nicotiana benthamiana planter med et mål-gen og en undertrykker af gendæmpning resulterer i forøget target protein udtryk 33,34. Agroinfiltration er en fælles metode til ensartet introdusiering bakterier huser et gen af interesse i plantevæv 35-37. Vacuum infiltration af Agrobacterium til transient genekspression i intakt plante blade er en hurtig, skalerbar og brugbar metode til produktion af fremmede proteiner uden behov for at generere transgene planter 38-41. Under vakuum agroinfiltration, er planter vendt på hovedet og overjordiske dele nedsænket i Agrobacterium suspension. Derefter vakuum påføres forårsager gasser til at evakuere fra blad intercellulære rum gennem stomata. Hurtig re-tryksætning efter frigivelse af vakuum resulterer i infusion af Agrobacterium suspension i bladet. Efter vakuum infiltration af Agrobacteria, er planter dyrkes yderligere og mål udtryk overvåges. De højeste niveauer af mål udtryk er typisk observeret 2-3 dage efter infiltration (dpi) med en binær vektor og 4-7 dpi med en lancering vektor, hvorefter udtrykket niveau typisk decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens er den mest udbredte middel til at levere et gen af interesse i en plante til proteinproduktion. Agroinfiltration fungerer usædvanligt godt i N. benthamiana men relativt dårligt i de fleste andre planter, herunder Arabidopsis thaliana 46.. I denne undersøgelse har vi udviklet en enkel, effektiv og økonomisk metode til forbigående protein produktion i 5-6 uger gamle N. benthamiana hjælp A. tumefaciens infiltration. Den største ulempe ved industriel skalering af agroinfiltration teknik er centrifugering af høstede bakterier og resuspendering af den bakterielle pellet i medium indeholdende 4&#39;-hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-dimethoxyacetophenon (acetosyringon) monosaccharider, og 2 - (N-morpholino) -ethansulfonsyre (MES) puffer til induktion af vir-gener. Vi har været i stand til at overvinde disse problemer ved at optimere Agrobacterium </em&gt; vækst i AB medium (minimal medium) efterfulgt af direkte fortynding i Milli-Q vand og ved at styre infiltration varighed og betingelser. Vi har også sammenlignet målprotein produktion i vildtype-tobak værtsarter N. benthamiana og N. træuld, samt hybrid N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Agrobacterium-medieret forbigående proteinproduktion i planter er en lovende metode til at producere vaccineantigener og terapeutiske proteiner inden for en kort periode. Imidlertid er denne teknologi kun lige begyndt at blive anvendt på storstilet produktion så mange teknologiske hindringer for at skalere op, er nu ved at blive overvundet. Her vil vi vise en enkel og reproducerbar metode til industriel skala forbigående protein produktion baseret på vakuum infiltration af Nicotiana planter med Agrobacteria transporterer lanceringen vektorer. Optimering af Agrobacterium dyrkning i AB medium giver mulighed for direkte fortynding af bakteriekulturen i Milli-Q vand, forenkle infiltration processen. Blandt tre testede arter af Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) blev valgt som den mest lovende vært på grund af den lethed, infiltration, højt niveau af reporter protein produktion, og omkring to-fgammel højere biomasseproduktion under kontrollerede miljøforhold. Induktion af Agrobacterium huser pBID4-GFP (tobakmosaikvirus-baseret) brug af kemikalier såsom acetosyringon og monosaccharid havde ingen effekt på produktionsniveauet protein. Infiltrerende anlæg under 50 til 100 mbar i 30 eller 60 sekunder resulterede i omkring 95% infiltration af plante bladvæv. Infiltration med Agrobacterium laboratoriestamme GV3101 viste den højeste proteinproduktion sammenlignet med Agrobacteria laboratoriestammer LBA4404 og C58C1 og vildtype-Agrobacterium-stammer AT6, at10, at77 og A4. Co-ekspression af et viralt RNA silencing suppressor, p23 eller p19, i N. benthamiana resulteret i tidligere ophobning og øget produktion (15-25%) af target protein (influenzavirus hemagglutinin).

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Forbigående protein produktion i Nicotiana anlæg baseret på vakuum infiltration med Agrobacteria transporterer lanceringen vektorer (tobakmosaikvirus-baseret) er en hurtig og økonomisk tilgang til at producere vaccineantigener og terapeutiske proteiner. Vi forenklet procedure og forbedret target ophobning ved at optimere betingelserne for dyrkning bakterier, vælge værtsart og co-indføre RNA silencing undertrykkere.

Optimering og udnyttelse af<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medieret Forbigående Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration og PVX Agroinfection i kartoffel og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase komplementering Imaging Assay i Nicotiana benthamiana blade for forbigående bestemmelse af Protein-protein interaktion Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Medieret Umodne Embryo Transformation af genstridige majs indavlede linjer Ved hjælp af morfoenske gener

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...