Name: optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Fraunhofer USA Centrum voor Moleculaire Biotechnologie, iBio, Inc en de Defense Advanced Research Projects Agency (subsidie ​​# HDTRA1-07-C-0054). De auteurs erkennen de gulle giften door Drs. Stanton Gelvin of Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammen) en Wayne Fitzmaurice van Large Scale Biologie Corp (N. excelsiana zaden), evenals Jennifer Nicholson van de Amerikaanse Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior zaden ). De auteurs danken Margaret Shillingford en Christopher Hull voor het leveren van planten en uitstekende technische bijstand. De auteurs danken ook Drs. Stephen Streatfield en Natasha Kushnir voor redactionele ondersteuning.

1. Plant Growing Voor de daaropvolgende agroinfiltration evalueerden we twee wild-type Nicotiana soorten (N. benthamiana en N. excelsior) en een hybride (N. excelsiana) hydrocultuur geteeld op steenwol in indoor faciliteiten. <ol><li> Geniet steenwol in een plantenvoeding oplossing. </li><li> Zaaien van wild-type N. benthamiana, N. excelsior en N. excelsiana (hybride van N. benthamiana × N. excelsior) op de voedingsstoffen doorweekt steenwol oppervlak. </li><li> Kweek planten van de zaden onder gecontroleerde omstandigheden (24 ° C en 40-65% relatieve vochtigheid) en een lange-dag lichtperiode (14 uur licht en 10 uur donker met verlichting van 130-150 uE m -2 s -1) voor 4-5 weken voor N. benthamiana en N. excelsiana, en 5-6 weken voor N. excelsior. </li></ol> 2. Constructie van vectoren voor Agroinfiltration <ol><li> Plaats een synthetisch reporter gen (green fluorescent protein [GFP]), full-length hemagglutinine (HA) van de A/California/04/2009 stam van het griepvirus (HAC1), en opnieuw ontworpen lichenase enzym (LicKM) 18 afzonderlijk in de lancering vector pBID4 18 (TMV-gebaseerde vector) naar pBID4-GFP, pBID4-HAC1 en pBID4-LicKM respectievelijk 18,32,41,47 verkrijgen. </li><li> Introduceer 10-50 ng pBID4 dragen GFP of HAC1 in elektrocompetente cellen van A. tumefaciens stam GV3101 en LicKM in elektrocompetente cellen van A. tumefaciens stammen GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 en A4 met het gen MicroPulser electroporator. </li><li> Gebruik de getransformeerde Agrobacteria voor infiltratie experimenten, tenzij anders vermeld. </li></ol> 3. Vacuüminfiltratie van Agrobacterium in Nicotiana Planten <ol><li> Grow A. tumefaciens stammen overnachting (O / N) in LB-medium, YEB medium of AB medium aangevuld met 50 mg / l kanamycine bij 28 ° C onder schudden bij 200-250 tpm. </li><li> Verdun Agrobacteria in Milli-Q water tot een optische dichtheid bij 600 nm (600 A) van 0,5 of centrifuge Agrobacterium cellen gekweekt in LB of YEB of AB bij 4000 × g gedurende 10 min bij 4 ° C, resuspendeer in inductiemedium (1x MS zout, 10 mM MES, 200 pM acetosyringoon, 2% sucrose [MMA]) A 600 0,5, en roer bij kamertemperatuur gedurende 1-3 hr, tenzij anders vermeld. </li><li> Infiltreren planten in een vacuümkamer door onderdompeling Nicotiana centrale lucht weefsels in Agrobacterium suspensie en toepassen van een 50-400 mbar vacuüm gedurende 30 of 60 seconden. De optimale infiltratie wordt routinematig toegepast bij 50-100 mbar gedurende 60 sec. </li><li> Zodra het vacuum verbroken kunt u planten uit de vacuümkamer, spoel met water en groeien gedurende 5-7 dagen onder dezelfde groeiomstandigheden voor pre-infiltratie groei. </li><li> Om de werkzaamheid te testenchemische inducerende Agrobacterium vir genen, verschillende concentraties van acetosyringoon (0, 100, 200 of 400 uM) toegevoegd aan de Agrobacteria gesuspendeerd in infiltratie buffer (1x MS, 10 mM MES, 2% glucose). Voor het effect van monosaccharide op inductie van vir gen verschillende percentages van glucose (0, 1, 2 of 4%) werden toegevoegd aan Agrobacteria gesuspendeerd in de infiltratie buffer (1x MS, 10 mM MES, 200 pM acetosyringoon). N. benthamiana planten werden geïnfiltreerd zoals vermeld in stappen 3.3 en 3.4). </li><li> Agrobacterium laboratorium stammen GV3101, C58C1 en LBA4404 en wild-type stammen A4, AT06, AT10, en At77 herbergen de pBID4-LicKM vector werden verdund in Milli-Q water tot A 600 van 0.5. N. benthamiana planten werden geïnfiltreerd met elke bepaalde stam zoals vermeld in stappen 3.3 en 3.4. </li></ol> 4. Co-agroinfiltration Procedure voor de Viral silencing Suppressor <ol><li> Mix het Milli-Q-water verdund Agrobacterium GV3101 culturen die het GFP-gen en de virale zwijgen suppressor p19 van Tomato borstelige stunt virus (TBSV) op 01:01, 02:01, 03:01 en 04:01 ratio. Infiltreren N. benthamiana planten zoals hierboven beschreven. </li><li> Infiltreren N. benthamiana planten met een mengsel van twee Milli-Q-water verdund Agrobacterium GV3101 culturen: de eerste die de pBID4-HAC1 plasmide en de tweede met slechts een van de silencing onderdrukkers - p19 van TBSV of p23 van Citrus tristeza virus, in de pCassp plasmide ( pCassp19) en de PGR binaire plasmide onder de 35S-promoter (PGR-P23), respectievelijk, in een verhouding 04:01. </li></ol> 5. Western Blot analyse <ol><li> Verzamel willekeurig blad monsters van N. benthamiana, N. excelsior of N. excelsiana planten op 4-7 dpi en verpulveren in vloeibare stikstof tot een fijn poeder. </li><li> Voeg drie delen van 1x PBS buffer met 0,5% TritonX-100 aan elk monster. </li><li> Schud de geëxtraheerde monsters gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Draai het extract gedurende 5 minuten en verzamel totaal oplosbaar eiwit in een schone Eppendorf buis. </li><li> Verdun de extracten een geschikte verdunning (1:50 1:100) in 1x PBS extractiebuffer en voeg 5 x sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% broomfenolblauw, 50% glycerol v / v en 500 mM DTT) tot een uiteindelijke concentratie van 1 ×. </li><li> Kook monsters gedurende 5 minuten. </li><li> Afzonderlijke eiwitten door 10% SDS-PAGE, overdracht op Immobilon-P transfermembraan en blokkeren met 0,5% I-blok. </li><li> Detecteren GFP met konijnen polyklonaal anti-GFP-antiserum bij 1:5000 en HAC1 met muizen anti-poly-histidine monoklonaal antilichaam bij 1:1000 in blokkerende oplossing gedurende 1 uur. </li><li> Na primaire antilichaam labeling, was de membranen driemaal gedurende 10 min elk 1 x 20-PBST en geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd anti-konijn antilichaam bij 1:5000 of een HRP-conjugaatd anti-muis antilichaam bij 1:10.000 1 uur voor GFP en HAC1 detectie respectievelijk. </li><li> Verwerk Western blots met behulp van de SuperSignal West Pico chemiluminescentiesubstraat. </li><li> Gebruik de GeneTools Software om band intensiteit van het eiwit te analyseren en het verkrijgen van de band gekalibreerde hoeveelheid. </li></ol> Eiwitproductie: (Calibrated hoeveelheid x verdunning van monster) / hoeveelheid monster geladen) x = 4 mg / kg. Vergelijking: Eiwit productie (P), gekalibreerd hoeveelheid (C), verdunning van het monster (D) en de hoeveelheid monster geladen (S). 6. Zymogram Assay <ol><li> Verzamel pBID4-LicKM-geïnfiltreerd N. benthamiana willekeurige weefselmonsters. </li><li> Extraheer eiwitten met dezelfde werkwijzen die hierboven beschreven voor Western blot-analyse en vervolgens analyseren met 10% SDS-PAGE met 0,1% lichenan in de gels. </li><li> Na elektroforese was de gel tweemaal gedurende 10 min elk in wasbuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] en 0,1% Triton X-100) En vervolgens geïncubeerd in wasbuffer bij 65 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Na incubatie gooi de wasbuffer en vlekken op de gels met 0,5% Congo Red gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Spoel de gels in Milli-Q water drie keer voor 10 minuten elk, en voeg 1 M NaCl tot lichenase activiteit te visualiseren. De gezuiverde bacteriële lichenase eiwit werd gebruikt als een positieve controle voor enzymactiviteit. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Voer een visuele detectie van GFP-fluorescentie geheel transiënt getransformeerde planten met een handbediende lange-golflengte UV-lamp. </li><li> Foto transient getransformeerde planten met een digitale camera door middel van een gele 8, ES 52 filter (belichtingstijd, 15 sec). </li><li> Verkrijgen beelden van Western blot analyses met behulp van de GeneSnap software op een GeneGnome en kwantificeren van de resultaten met behulp van de GeneTools software, met een kalibratiecurve gebaseerd op gezuiverde GFP standaard. </li><li> Kwantificeren HAC1 eiwit met behulp van een ijklijn op basis van zuiveringed HAC eiwit norm uit de A/Indonesia/05/05 stam van het griepvirus. </li><li> Bereken de gemiddelde waarden 3-4 repliceert voor alle experimenten. </li></ol>

We hebben niets te onthullen.

In deze studie hebben we een eenvoudige agroinfiltration protocol voor alleen tijdelijke eiwitproductie in bepaalde soorten Nicotiana middels Agrobacterium stammen die de lancering vector ontwikkeld. Bovendien hebben wij de optimale omstandigheden die de hoogste recombinante eiwitproductie niveau onze transiënte fabriek expressiesysteem bereiken. Vacuüm infiltratie van de verdunde A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de lancering vector pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana en N. excelsior resulteerde in hogere niveaus van target eiwitproductie binnen 7 dpi vergelijking met andere plantensoorten, zoals Pisum sativum geïnfiltreerd met GV3101 herbergen Alfalfa mosaic virus - of komkommer mozaïek-virus gebaseerde vectoren die de GFP reporter gen onder de 35S-promotor 41, of Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum en Arabidopsis thaliana geïnfiltreerd met de C58C1 stam van A. tumefaciens die de beta-glucuronidase reportergen 57. N. benthamiana en N. excelsiana waren gemakkelijk te stofzuigen infiltreren bij 50 mbar gedurende 30-60 sec, met 90-95% infiltratie efficiëntie. De resterende 5-10% bladoppervlak niet geïnfiltreerd vanwege een drijvende bladeren op het oppervlak van de Agrobacterium-suspensie tijdens het aanbrengen van het vacuüm. Sinds de introductie vector heeft de mogelijkheid voor cel-tot-cel beweging 18, voorbijgaande proteïne ophoping in hele bladeren en bladstelen 7 dpi. Bij 10 dpi, de geschatte GFP productie iets lager omdat pBID4 expressievector kan bewegen van cel naar cel, maar niet systemisch 18 bewegen; daarom, pas gegroeide bladeren niet de vector bevatten en niet bijdragen tot de productie van het doel. Bovendien degradatie van het recombinante eiwit tijd may dragen bij aan lagere niveau eiwit op 10 dpi. Onze resultaten toonden dat infiltratie van A. tumefaciens stam GV3101 gemedieerde hoge niveaus van voorbijgaande eiwitproductie in N. benthamiana. Verder kan doeleiwit worden gemanipuleerd als N-eindstandige, C-eindstandige of interne fusies aan lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, een thermostabiel enzym van Clostridium thermocellum en verleent thermostabiliteit vele doelwit eiwitfusie 18. Infiltratie van N. benthamiana met A. tumefaciens wild-type stammen (at6, AT10 en at77) herbergt het gen van interesse opgewekt milde of ernstige symptomen: blad curling, bladsteel rek, en curling. Geen pathologische symptomen waargenomen bij N. benthamiana geïnfiltreerd met het laboratorium stam GV3101 herbergen leeg pBID4 vector, terwijl sommige genen ingebracht in pBID4 en omgetoverd tot laboratorium stammen GV3101, C58C1 of LBA4404 uitgelokt milde necrotische reacties en bladchlorose / vergeling symptomen bij geïnfiltreerd regio&#39;s van bladeren. Necrotische symptomen veroorzaakt door wild-type Agrobacterium of ontwapend stammen in nachtschadeachtigen planten zijn eerder 56,57 gerapporteerd. De necrotische reactie kan resulteren uit virulentiefactoren van type III secretie systeem, bacteriële eiwitten overgebracht naar de plantencel door het Type IV secretie systeem, en / of gevoeligheid voor flagelline 58-60. Wij hebben gevonden dat transiënte productie van heterologe eiwitten ook kunnen opwekken pathogeniteit en een overgevoelige reactie in geïnfiltreerde bladeren. Veel onderzoekers rapporteerden dat agroinfiltration van verschillende plantensoorten met plant binaire vectoren geproduceerd tot 5-20 maal hogere niveaus van voorbijgaande eiwitproductie ten opzichte van stabiel getransformeerde planten 28,57. Onze gegevens tonen aan dat N. benthamiana geïnfiltreerd met GV3101 herbergen pBID4-GFP transiënt tot expressie hoge niveaus van GFP, die vergelijkbaar is met de GFP opbrengst gerapporteerdN. benthamiana geïnfiltreerd met Agrobacterium die de Pich-GFPSYS virale vector (tot 80% van de totale oplosbare eiwit) 44. Agroinfiltration gebruik van onze lancering vector resulteerde in hoge productie van de thermostabiele eiwit LicKM, 50-maal hoger dan deze waargenomen met behulp van een standaard binair plasmide 18. Om de besmettelijkheid van A. testen tumefaciens en de stabiliteit van de lancering vector, we geïnfiltreerd een flat van N. benthamiana elk uur voor maximaal 8 uur met dezelfde Milli-Q-water verdund cultuur van GV3101 herbergen de pBID4-GFP plasmide. Onze gegevens laten zien dat de GV3101 stam efficiënt is besmettelijk gedurende minstens 8 uur en pBID4 (de lancering vector) is zeer stabiel tijdens de 8 uur durende infiltratie. Glycerol voorraad van GV3101 stam die de lancering vector pBID4-HAC1 (cel bank) bewaard bij -80 ° C is aangetoond dat het zeer stabiel te zijn gedurende drie jaar zonder veranderingen in voorbijgaande protevan de productie in geïnfiltreerd planten. N. benthamiana planten onder optimale condities en tussen 35 en 42 dagen na het zaaien gegroeid waren optimaal voor vacuüm-infiltratie gemedieerde transiënte genexpressie 40. Jongere planten (3-4 weken oud) niet volledig worden geïnfiltreerd door bladeren drijvend op de celsuspensie oppervlak en weefselschade door de mechanische werking van een vacuüm. In planten die ouder zijn dan 45 dagen, N. benthamiana builen podium, onder de optimale lichtomstandigheden gebruikt, het niveau van de tijdelijke expressie is laag. Laag molecuulgewicht fenolische verbindingen (acetosyringoon) en monosaccharaides (glucose) daar vir genen induceren in A. tumefaciens 55,61. Bovendien infiltratie van N. benthamiana met de binaire vector pCAMBIA (gfp) in aanwezigheid van acetosyringoon bij concentraties van 50-600 pM werden licht toenemen voorbijgaandegenexpressie 40. We onderzochten het effect van verschillende concentraties van acetosyringoon en glucose in het systeem door het toevoegen van deze verbindingen GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP MMA 3 uur en vond geen verschil in GFP-expressie. Interessant, GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP en verdund in Milli-Q water tot een A 600 van 0,5 en geïnfiltreerd zonder de vir geninductie uitgedrukt dezelfde hoeveelheden GFP als die geïnfiltreerd met geïnduceerde culturen. De A. tumefaciens vir gen (en) zou kunnen worden geïnduceerd door plantfenolsamenstellingen (acetosyringoon en sinapinezuur) en plantaardige monosaccharaides (glucose en fructose) aanwezig in bladweefsel. Derhalve speculeren wij dat soortgelijke niveaus van GFP-expressie in de aanwezigheid of afwezigheid van exogeen vir gen inductoren gevolg van het effect van cytoplasmatische vir gen inductoren aanwezig tijdens replicatie van de GFP expressie vector introductie in plantencellen zijn. N benthamiana is gebruikt als model gastheer voor voorbijgaande eiwitproductie 49. Echter, N. benthamiana &#39;s relatief laag biomassaopbrengst belemmert de toepassing ervan voor de grootschalige productie van recombinante eiwitten. De optimale gastheer moet een hoge mate van kortstondige expressie, gemakkelijke groei in een kas combineren, zijn gevoelig voor Agrobacterium infiltratie 2. Om een alternatieve gastheer selecteren, we geïnfiltreerd twee verschillende wild-type soort Nicotiana (N. benthamiana en N. excelsior) en een hybride N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) met de A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de pBID4-GFP plasmide. Tussen deze drie soorten, het niveau van GFP-expressie iets hoger N. benthamiana. N. excelsior planten moeite met vacuüm agroinfiltration toonden door hun leerachtige bladeren, en N. excelsianaproduceerde ongeveer twee keer meer biomassa onder dezelfde groeiomstandigheden. De voorbijgaande productie van GFP op 7 dpi is relatief vergelijkbaar in N. benthamiana en N. excelsiana. Daarom N. excelsiana kan een meer geschikte gastheer voor recombinant eiwitproductie zijn. Agrobacterium gemedieerde tijdelijke eiwitproductie wordt beperkt door PTGS 26, die kan worden ondervangen door co-expressie van gene silencing suppressors van plantenvirus oorsprong 62. Voorbijgaande eiwitproductie werd aangetoond worden verbeterd 50-voudig in aanwezigheid van het p19 eiwit van TBSV, die PTGS in geïnfiltreerde weefsels 34 remt. In onze studie, onderzochten we het effect van twee virale silencing onderdrukkers (p19 en p23) afzonderlijk co-geïnfiltreerd met de lancering vector pBID4-HAC1. De co-infiltratie van deze zwijgen suppressors leek weinig invloed op transiënte expressie van HAC1 hebben, met slechts een lichte stijging HAC1eiwit accumulatie (15-25%) in de aanwezigheid van co-geïnfiltreerde p23 of p19. Een positieve invloed hebben eiwitproductie, kan het nodig zijn tot zwijgen onderdrukkers specifiek worden geselecteerd effectief voor de gerichte plantensoorten en virale vector 63 te zijn. TMV helicase heeft een onderdrukker van RNA-silencing activiteit 64,65. Onze gegevens bevestigen deze waarneming als co-infiltratie van p23 of p19 met pBID4-HAC1 resulteerde in een toename van GFP of een lichte stijging van de voorbijgaande HAC1 eiwitproductie. Concluderend hebben we aangepast en geoptimaliseerd vaste Agrobacterium groei omstandigheden en verbeterde de efficiëntie van vacuüm infiltratie. Deze technologie ons in staat om te groeien en te infiltreren honderden kilo plantaardig materiaal in een paar uur. Wij hebben met succes geautomatiseerde de plant tijdelijke expressie techniek voor high-throughput vaccin productie op industriële schaal onder de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) omstandigheden. Voor meer informatie about automatisering en het gebruik van de plantaardige voorbijgaande eiwitproductie voor de productie van recombinante eiwitten, waaronder subunit vaccin kandidaten, onder cGMP condities, wordt de lezer verwezen naar de website <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Planten worden nu erkend als een veilige, betrouwbare, schaalbare en goedkoop platform voor de productie van heterologe recombinante biofarmaceutische en industriële eiwitten 1-3 en hebben belangrijke voordelen ten opzichte van microbiële en dierlijke celexpressiesystemen 4. Planten zijn in staat om correct gevouwen eiwitten tot expressie met post-translationele modificaties, inclusief gemonteerde multimere antilichamen 5-7. Verschillende plantaardige recombinante farmaceutische eiwitten ondergaan klinische evaluatie 8. Deze omvatten patiëntspecifieke recombinante idiotype vaccins (scFv) voor de behandeling van non-Hodgkin lymfoom 9, hemagglutinine-gebaseerde pandemie en seizoensgebonden influenzavaccin gegadigden 10,11 (Cummings et al.. Aan Vaccine ingediend), anti-Streptococcus oppervlakteantigeen I / II antilichaam voor de behandeling van tandcariës 12 en humane insuline voor de behandeling van diabetes 13. Bovendien menselijk recombinant glucocerebrosidase voor enzym-substitutietherapie bij patiënten met de ziekte van Gaucher is in Israël en de VS goedgekeurd en wordt geleverd onder de Expanded Access Program buiten de VS 14,15. Heterologe eiwitten kunnen worden geproduceerd in stabiel getransformeerde (transgeen of transplastomic) of tijdelijk getransformeerde planten. Voorbijgaande eiwitproductie biedt verschillende voordelen ten opzichte productie in transgene planten, waaronder de korte termijn expressie en accumulatie 16 bereiken, en kan worden bereikt door bacteriële binaire vectoren of recombinante planten virale vectoren in plantenweefsels 4. De meest geavanceerde transiënt expressiesysteem is gebaseerd op het gebruik van &quot;launch vectoren&quot; die bestanddelen van plantenvirussen en binaire plasmiden combineren, door agroinfiltration 17,18 geleverd. Agroinfiltration van een lancering vector op basis van tabak mozaïek virus (TMV) is met succes in het lab toegepastschalen naar vaccin antigenen produceren tegen pathogenen zoals het humaan papillomavirus 19, Yersinia pestis 20, influenzavirussen A 21,22, Bacillus anthracis 23 en pokkenvirus 24 in N. benthamiana bladeren. Agrobacterium gemedieerde tijdelijke expressie is een veelbelovende werkwijze voor de gelijktijdige productie van verschillende eiwitten 2,25-27. Zo zijn plantaardige tijdelijke expressiesystemen gebruikt om tumor-specifieke recombinante antilichamen 28,29, een geglycosyleerd recombinant antilichaam tegen de epidermale groeifactor receptor 30 en een monoklonaal antilichaam specifiek voor miltvuur beschermende antigeen 31,32 produceren. Co-infiltratie van Nicotiana benthamiana planten met een target-gen en een suppressor van gene silencing resulteert in verbeterde doeleiwitexpressie 33,34. Agroinfiltration is een gemeenschappelijke methode voor het uniform introducing bacteriën drager zijn van een gen van belang in plantaardige weefsels 35-37. Vacuüm infiltratie van Agrobacterium voor transiënte genexpressie in intacte bladeren is een snelle, schaalbare en bruikbare werkwijze voor productie van heterologe eiwitten zonder dat transgene planten 38-41 genereren. Tijdens vacuüm agroinfiltration, zijn planten ondersteboven weggeknipt en bovengrondse delen ondergedompeld in Agrobacterium schorsing. Dan vacuüm wordt toegepast waardoor gassen te evacueren van blad intercellulaire ruimten via huidmondjes. Snelle re-onder druk na release van het vacuüm resultaten in de infusie van de Agrobacterium schorsing in het blad. Na vacuüm infiltratie van Agrobacteria, zijn planten verder gekweekt en doel expressie wordt bewaakt. De hoogste doelwitexpressiecassette worden typisch waargenomen 2-3 dagen na infiltratie (dpi) met een binaire vector en 4-7 dpi met een lancering vector, waarna het expressieniveau meestal decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens is het meest gebruikte middel voor het afleveren van een gen van belang in een plant voor eiwitproductie. Agroinfiltration werkt uitzonderlijk goed in N. benthamiana maar relatief slecht in de meeste andere planten, zoals Arabidopsis thaliana 46. In deze studie hebben we een eenvoudige, efficiënte en economische methode voor transiënte eiwitproductie in 5-6 weken oude N. benthamiana behulp A. tumefaciens infiltratie. Het grote nadeel van industriële schaal van de agroinfiltration techniek centrifugatie geoogst bacteriën en resuspensie van de bacteriële pellet in medium dat 4&#39;-hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-dimethoxyacetofenon (acetosyringoon), monosacchariden, en 2 - (N-morfolino) -ethaansulfonzuur (MES) buffer voor de inductie van de vir-genen. We zijn in staat om deze problemen te overwinnen door het optimaliseren van de Agrobacterium geweest </em&gt; groei in AB medium (minimaal medium), gevolgd door direct verdunnen in Milli-Q water en door het beheersen van de infiltratie duur en de omstandigheden. We hebben vergeleken doeleiwit productie in de wildtype tabak gastheersoort N. benthamiana en N. houtwol, evenals in hybride N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Agrobacterium-gemedieerde tijdelijke eiwitproductie in planten is een veelbelovend om vaccinantigenen en therapeutische eiwitten binnen een korte tijd. Echter, is deze technologie nog maar net beginnen te worden toegepast op grote schaal te produceren zo veel technologische belemmeringen voor opschaling worden nu overwonnen. Hier tonen we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het op industriële schaal voorbijgaande eiwitproductie op basis van vacuüm infiltratie van Nicotiana planten met Agrobacteriën dragen lancering vectoren. Optimalisatie van Agrobacterium teelt in AB medium maakt een directe verwatering van de bacteriecultuur in Milli-Q water, de vereenvoudiging van de infiltratie-proces. Onder de drie geteste soorten van Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. houtwol) werd gekozen als de meest veelbelovende gastheer vanwege het gemak van infiltratie, hoge reporter eiwitproductie en twee-foude hogere biomassaproductie onder gecontroleerde omstandigheden. Inductie van Agrobacterium pBID4-GFP (tabak mozaïek virus gebaseerde) met chemicaliën zoals acetosyringoon en monosaccharide had geen effect op het eiwit productieniveau. Infiltreren plant onder 50 tot 100 mbar gedurende 30 of 60 seconden resulteerde in ongeveer 95% infiltratie van plant blad weefsels. Infiltratie met Agrobacterium laboratoriumstam GV3101 toonde de hoogste eiwitproductie in vergelijking met Agrobacteria laboratoriumstammen LBA4404 en C58C1 en wild-type Agrobacteria stammen AT6, AT10, at77 en A4. Co-expressie van een viraal RNA silencing suppressor p23 of p19, in N. benthamiana resulteerde in eerdere accumulatie en verhoogde productie (15-25%) doelwiteiwit (influenzavirus hemagglutinine).

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Een methode voor de productie van recombinante eiwitten mCD1d in insectencellen.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-gemedieerde virus-geïnduceerde gen silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Gemedeerde onrijpe embryotransformatie van recalcitrante maïsinteeltlijnen met behulp van morfogene genen

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...