Name: optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Fraunhofer מרכז ארה&quot;ב למולקולרית וביוטכנולוגיה, iBio, Inc וביטחון מחקר מתקדם פרויקטים סוכנות (# מענק HDTRA1-07-C-0054). המחברים מודים מתנות הנדיבות על ידי בני הזוג. סטנטון Gelvin של מדע ביולוגי חוג, אוניברסיטת פרדו (Agrobacterium tumefaciens זנים) וויין פיצמוריס לביולוגיה קורפ בקנה מידה גדולה (זרעי excelsiana נ &#39;), כמו גם ג&#39;ניפר ניקולסון של ארה&quot;ב Nicotiana אוסף, צפון קרוליינה סטייט (זרעי נסורת נ ). המחברים מודים מרגרט Shillingford וכריסטופר האל על מתן צמחים וסיוע טכני מעולה. המחברים מודים גם בני הזוג. סטיבן Streatfield ונטשה קושניר למערכת סיוע.

1. צמח גידול לagroinfiltration לאחר מכן הערכנו שני מיני Nicotiana wild-type (נ benthamiana ונ &#39;אקסלסיור) והיברידי (excelsiana נ) גדל hydroponically על צמר סלעים במתקנים מקורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים לוחות צמר סלעים בתמיסת דשן צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרוע זרעים של נ &#39;wild-type benthamiana, נ &#39; נסורת ונ &#39; excelsiana (היברידי של נ benthamiana × נ הנסורת) על החומרים המזינים ספוג משטח צמר סלעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל צמחים מהזרעים בתנאים מבוקרים (24 מעלות צלזיוס ו40-65% לחות יחסית) וphotoperiod ארוכות היום (14 אור משאבי האנוש ו10 חשוכות שעות, עם תאורה של 130-150 מ &#39;μE -2 שניות -1) עבור 4-5 שבועות לנ benthamiana ונ &#39; excelsiana, ו5-6 שבועות לנ נסורת. </li></ol> 2. בנייה של וקטורים עבור Agroinfiltratיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס גן כתב סינטטי (חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]), hemagglutinin באורך מלא (HA) מזן A/California/04/2009 של נגיף שפעת (HAC1), ואנזים lichenase מחדש מהונדס (LicKM) 18 בנפרד לתוך וקטור השקת pBID4 18 (וקטור מבוסס TMV) כדי להשיג pBID4-GFP, pBID4-HAC1 וpBID4-LicKM, בהתאמה 18,32,41,47. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג 10-50 ng של pBID4 ביצוע GFP או HAC1 לתוך תאי electrocompetent של א &#39; tumefaciens GV3101 המתח וLicKM לתוך תאי electrocompetent של א &#39; tumefaciens זני GV3101, C58C1, GLA4404, At06, at10, At77 וA4 עם electroporator MicroPulser הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Agrobacteria הפך לניסויי הסתננות אלא אם צוין אחרת. </li></ol> 3. אבק ההסתננות של Agrobacterium לצמחי Nicotiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול א tumefaciens זני לילה (O / N) במדיום LB, הרפואה ייבium או בינוני AB בתוספת 50 מ&quot;ג / ליטר של Kanamycin ב28 ° C עם הרועד בסל&quot;ד 200-250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Agrobacteria במים מילי-Q לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (600) של 0.5 או Agrobacterium צנטריפוגה תאים שגודלה בLB או ייב או AB ב4,000 × גרם ל10 דקות ב 4 ° C, מחדש להשעות במדיום אינדוקציה (מלח 1x MS, MES 10 מ&quot;מ, 200 acetosyringone מיקרומטר, סוכרוז 2% [MMA]) ל600 של 0.5, ומערבבים בטמפרטורת חדר למשך 1-3 שעות, אלא אם צוין אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור צמחים בתא ואקום על ידי השריית רקמות אוויריות צמח Nicotiana בהשעית Agrobacterium והחלת ואקום 50-400 mbar ל30 או 60 שניות. החדירה האופטימלית מיושמת באופן שיגרתי ב50-100 mbar ל60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוואקום שבור, להסיר צמחים מתא הוואקום, לשטוף במים, ולגדול במשך 5-7 ימים באותם תנאי גידול המשמשים לגידול טרום הסתננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את היעילותשל כימיקלים גרימת גן vir Agrobacterium, ריכוזים שונים של acetosyringone (0, 100, 200 או 400 מיקרומטר) נוספו לAgrobacteria המושעה במאגר הסתננות (1x MS, MES 10 מ&quot;מ, גלוקוז 2%). להשפעת monosaccharide באינדוקציה של גני vir, באחוזים השונים של גלוקוז (0, 1, 2 או 4%) נוספו לAgrobacteria מושעה במאגר ההסתננות (1x MS, MES 10 מ&quot;מ, 200 acetosyringone מיקרומטר). נ צמחי benthamiana הסתננו כאמור לעיל בצעדים 3.3 ו3.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעבדה Agrobacterium זני GV3101, C58C1 וLBA4404 וזנים פראי מסוג A4, At06, at10, וAt77 מחסה וקטור pBID4-LicKM היו מדוללת במים מילי-Q ל600 של 0.5. נ צמחי benthamiana הסתננו עם כל זן מסוים כאמור לעיל בצעדים 3.3 ו3.4. </li></ol> 4. נוהל שיתוף agroinfiltration למדכאי השתקת ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mix התרבויות מילי-Q-מדולל במי Agrobacterium GV3101 נושאות את גן ה-GFP ו p19 המדכא ההשתקה הנגיפי של וירוס פעלולים סבוכים עגבניות (TBSV) בשעה 1:1, 2:1, 3:01 ו04:01 יחסים. לחדור נ צמחי benthamiana כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור נ צמחי benthamiana בתערובת של שתי תרבויות בדילול מים מילי-Q Agrobacterium GV3101: הראשון נושא את הפלסמיד pBID4-HAC1 והשני נושא את אחד ממדכאי ההשתקה - P19 של TBSV או p23 של וירוס טריסטזה הדר, בפלסמיד pCassp ( pCassp19) ובפלסמיד בינארי PGR תחת אמרגן 35S (PGR-P23), בהתאמה, ב04:01 היחס. </li></ol> 5. מערב ניתוח הכתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות עלים אקראיות מנ benthamiana, נ נסורת או נ צמחי excelsiana ב4-7 dpi ולכתוש בחנקן נוזלי לאבקה דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שלושה כרכים של חיץ PBS 1x מכילים 0.5% טריטוןX-100 מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את הדגימות שחולצו ל15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התמצית במשך 5 דקות ולאסוף חלבון מסיס בסך הכל לתוך צינור Eppendorf נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תמציות לדילול מתאים (1:50 1:100) במאגר חילוץ 1x PBS, ולהוסיף 5 × חיץ מדגם (250 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 6.8], 10% SDS, bromophenol 0.5% הכחולים, גליצרול 50% V / V, ו500 מ&quot;מ DTT) לריכוז 1 × סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מרתיחים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים נפרדים על ידי 10% SDS-PAGE, להעביר על גבי קרום העברת Immobilon-P, ולחסום עם 0.5% I-בלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ה-GFP באמצעות נסיוב אנטי-GFP ארנב polyclonal ב1:5,000 וHAC1 באמצעות נוגדן חד שבטי נגד פולי היסטידין עכבר ב1:1,000 בחסימת פתרון במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תיוג נוגדן ראשוני, לשטוף את הקרומים שלוש פעמים 10 דקות כל אחד עם 1 × 20-PBST ודגירה עם חזרת peroxidase (HRP) מצומדות נוגדנים נגד ארנב ב1:5,000 או HRP-המצומדנוגדן ד אנטי עכבר ב1:10,000 עבור שעה 1, עבור ה-GFP וזיהוי HAC1, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד כתמים מערביים באמצעות מצע SuperSignal מערב פיקו Chemiluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת GeneTools לנתח עוצמת להקה של החלבון ולקבל את הכמות מכוילת הלהקה. </li></ol> ייצור חלבון: (דילול מכויל כמות x של מדגם) / כמות המדגם הטעון) x 4 = מ&quot;ג / קילוגרם. משוואה: ייצור חלבון (P), כמות מכוילת (C), דילול של המדגם (ד &#39;) וכמות לדוגמא טעונה (S). 6. Zymogram Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נ לאסוף pBID4-הסתנן-LicKM דגימות רקמה אקראית benthamiana. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ חלבונים משתמשים באותן השיטות שתוארו לעיל לניתוח כתם מערבי ולאחר מכן לנתח ידי 10% SDS-PAGE עם lichenan 0.1% נכלל בג&#39;לים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אלקטרופורזה, לשטוף את הג&#39;לים פעמיים 10 דקות כל אחד בלשטוף חיץ (100 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 8.0] ו0.1% טריטון X-100) ולאחר מכן לדגור בחיץ לשטוף ב65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לבטל את החיץ לשטוף ולהכתים את ג&#39;לי עם 0.5% אדומים קונגו למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את ג&#39;לי במים מילי-Q שלוש פעמים 10 דקות כל אחד, ולהוסיף 1 M NaCl לדמיין פעילות lichenase. חלבון lichenase חיידקים המטוהרים שימש כביקורת חיובית לפעילות אנזים. </li></ol> 7. הדמיה GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע זיהוי ויזואלי של הקרינה ה-GFP בצמחים הפכו transiently כל שימוש במנורת UV באורך גל ארוך החזיק ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום transiently הפך צמחים עם מצלמה דיגיטלית דרך צהוב 8, ES 52 מסנן (זמן חשיפה, 15 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות מכתם מערבי מנתח באמצעות תוכנת GeneSnap על GeneGnome ולכמת את התוצאות באמצעות תוכנת GeneTools, עם עקומת כיול המבוססת על תקן ה-GFP מטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת חלבון HAC1 באמצעות עקומת כיול המבוסס על purifiסטנדרטי חלבון ed HAC מזן A/Indonesia/05/05 של נגיף שפעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ערכים ממוצעים 3-4 משכפל לכל הניסויים. </li></ol>

יש לנו מה למסור.

במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול agroinfiltration פשוט לייצור חלבון חולף שיגרתי במינים Nicotiana נבחרו באמצעות זני Agrobacterium נושאים את וקטור השיגור. בנוסף, יש לנו זיהינו את התנאים האופטימליים כדי להשיג את רמת ייצור חלבון הגבוהה ביותר רקומביננטי במערכת הביטוי שלנו חולפת צמח. חדירת אבק של א &#39;בדילול tumefaciens GV3101 זן מחסה pBID4 וקטור ההשקה לנ benthamiana, נ &#39; excelsiana ונ &#39;הנסורת הביאו לרמות גבוהות יותר של ייצור חלבון המטרה תוך 7 dpi בהשוואה למינים צמחים אחרים, כגון Pisum sativum הסתנן עם GV3101 מחסה וירוס פסיפס אספסת - או פסיפס מלפפון וקטורים מבוסס וירוס המבטאים את הגן המדווח GFP תחת אמרגן 35S סאטיבה 41, או lactuca, Solanum lycothaliana persicum וארבידופסיס הסתנן עם זן C58C1 של א &#39; tumefaciens נושא את גן הכתב בטא glucuronidase 57. נ benthamiana ונ &#39; excelsiana היו קל לואקום לחדור ב50 mbar עבור 30-60 שניות, עם 90-95% יעילות הסתננות. 5-10% הנותרים של אזור עלה לא הסתננו בגלל כמה צף של עלים על פני השטח של ההשעיה Agrobacterium במהלך היישום של הוואקום. מאז יש לו את וקטור השקת יכולת לתנועת תא אל התא 18, הצטברות חלבון חולפת מתרחשת בעלים שלמים, כמו גם פטוטרות ב7 dpi. ב10 dpi, ייצור ה-GFP המוערך היה נמוך במקצת בגלל וקטור ביטוי pBID4 הוא מסוגל לעבור מתא לתא, אך לא לעבור מערכתי 18; לכן, עלים גדלו חדש אינם מכילים את הווקטור ואינו תורמים לייצור של היעד. בנוסף, מ &#39;לאורך זמן פירוקו של חלבון רקומביננטיאיי לתרום לרמת חלבון מופחתת ב10 dpi. התוצאות שלנו הראו כי חדירה של א &#39; רמות גבוהות GV3101 מתח tumefaciens תיווך של ייצור חלבון החולף בנ benthamiana. יתר על כן, חלבון המטרה יכול להיות מהונדס כהתכת N-מסוף, טרמינל C-או פנימית לlichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, שהוא אנזים חום מthermocellum Clostridium ומקנה thermostability רבים יעד היתוך חלבון 18. הסתננות של נ &#39; benthamiana עם א &#39; tumefaciens wild-type זנים (at6, at10 וat77) מחסה הגן של עניין שהושרו על תסמינים מתונים או חמורים: סלסול עלים, התארכות פטוטרת, ומסתלסל. אין תסמינים פתולוגיים נצפו בנ benthamiana הסתנן עם GV3101 זן המעבדה מחסה וקטור pBID4 ריק, בעוד כמה גנים מוכנסים לתוך pBID4 והפכו למעבדת זני GV3101, C58C1 או LBA4404 עורר תגובות נמקים קלות ועלהירקון / מצהיבים סימפטומים באזורי שחדר של עלים. סימפטומים הנגרמים על ידי נימקי Agrobacterium wild-type או זני מנשקו בצמחי הסולניים כבר דיווחו בעבר 56,57. תגובת נמקים יכולה לנבוע מגורמים ארסי של מערכת הפרשת סוג III, חלבוני חיידקים מועברים לתא הצמח על ידי מערכת הפרשת סוג ד &#39;, ו / או רגישות לflagellin 58-60. מצאנו כי ייצור חולף של חלבוני Heterologous עשוי גם לעורר פתוגניות ותגובת רגישות יתר בצמח חדר עוזבת. חוקרים רבים דיווחו agroinfiltration זה של מיני צמחים שונים עם וקטורים בינאריים מפעל מיוצרים עד לרמות גבוהות יותר 5-20 זמנים של ייצור חלבון חולף בהשוואה לצמחים הפכו ביציבות 28,57. הנתונים שלנו מראה שנ &#39; benthamiana הסתנן עם GV3101 מחסה רמות גבוהות של ה-GFP, שהיא דומה לתשואת ה-GFP דיווחה להביעו transiently pBID4-GFPנ benthamiana הסתנן עם Agrobacteria נושא את וקטור Pich-GFPSYS הנגיפי (עד 80% מחלבון מסיס בסך הכל) 44. Agroinfiltration באמצעות וקטור ההשקה שלנו הביא לייצור גבוה של חלבון LicKM החום, 50 לקפל גבוה יותר מזה שנצפה באמצעות פלסמיד בינארי סטנדרטי 18. כדי לבדוק את ההדבקה של א &#39; tumefaciens והיציבות של וקטור ההשקה, אנחנו הסתננו שטוחים אחד נ benthamiana כל שעה עד 8 ​​שעות שימוש באותה התרבות בדילול מים מילי-Q של GV3101 מחסה פלסמיד pBID4-GFP. הנתונים שלנו הראו כי מתח GV3101 הוא יעילות התולעת לפחות 8 שעות וpBID4 (וקטור ההשקה) הוא מאוד יציב במהלך החדירה ארוכת שעות 8. מניית גליצרול של מתח GV3101 מחסה וקטור השקת pBID4-HAC1 (בנק תא) מאוחסן ב -80 C ° הוכח להיות מאוד יציב במשך שלוש שנים ללא שינויים בהגנה של מחזור חולףבייצור במפעלים שחדר. צמחי נ benthamiana גדלו בתנאים אופטימליים ובין 35 42 הודעה ימי זריעה היו אופטימליים לביטוי ואקום בתיווך החדירה חולף גן 40. צמחים צעירים יותר (3-4 שבועות) לא יכולים להיות שחדר כולו בגלל עלים צפים על פני ההשעיה תא ונזק לרקמות מפני ההשפעות מכאניות של החלת ואקום. בצמחים מבוגרים יותר מ45 ימים, נ &#39; benthamiana הנעילה במה, בתנאי האור האופטימלי בשימוש, ברמה של ביטוי החולף היא נמוכה. תרכובות פנוליות נמוכה מולקולריות משקל (acetosyringone) וmonosaccharaides (גלוקוז) ידועים כדי לגרום לגני vir בא tumefaciens 55,61. יתר על כן, חדירה של נ &#39; benthamiana עם pCAMBIA ינארי הווקטור (GFP) בנוכחות acetosyringone בריכוזים של 50-600 מיקרומטר הוצג כדי להגדיל מעט חולף<html> ביטוי גנים 40. אנחנו בחנו את ההשפעה של ריכוזים שונים של acetosyringone וגלוקוז במערכת שלנו על ידי הוספת תרכובות אלה לתרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP בMMA למשך 3 שעות, ולא מצאנו הבדל בביטוי של GFP. מעניין, תרבויות GV3101 מחסה pBID4-GFP ומדולל במים מילי-Q ל600 של 0.5 והסתננו ללא האינדוקציה גן vir הביעו אותן כמויות של ה-GFP כמו אלה הסתננו עם תרבויות מושרה. א גן tumefaciens vir (ים) שעלול להיגרם על ידי תרכובות פנוליות צמח (acetosyringone וחומצת sinapinic) וmonosaccharaides צמח (גלוקוז ופרוקטוז) הנמצא ברקמת עלה. לכן, אנו משערים כי רמות דומות של ביטוי ה-GFP בנוכחותו או היעדריו של מעוררי גן vir אקסוגני עשויות להיות תוצאה של השפעת מעוררי גן vir cytoplasmic הנוכחים במהלך השכפול של וקטור ההשקה-GFP-לבטא בתאי צמח. = &quot;Jove_content&quot;&gt; נ Wild-type benthamiana שמש כמארח מודל לייצור חלבון חולף 49. עם זאת, תשואה ביומסה נמוכה יחסית נ &#39;של benthamiana מעכבת את בקשתה לייצור בקנה מידה גדולה של חלבונים רקומביננטיים. המארח האופטימלי צריך לשלב רמה גבוהה של ביטוי חולף, צמיחה קלה בחממה, ולהיות רגיש לAgrobacterium חדירה 2. כדי לבחור מארח חלופי, אנו הסתננו שני מינים בטבע מהסוג שונים של Nicotiana (נ benthamiana ונ &#39;אקסלסיור) ונ&#39; היברידי excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) עם א &#39; tumefaciens GV3101 זן מחסה פלסמיד pBID4-GFP. בין שלושת המינים הללו, רמת הביטוי של GFP הייתה מעט גבוהה יותר בנ benthamiana. נ צמחי נסורת הראו קושי בagroinfiltration ואקום בשל העלים העור שלהם, ונ &#39; excelsianaמיוצר כשני לקפל יותר ביומסה באותם תנאי גידול. הייצור הארעי של ה-GFP ב7 dpi הוא יחסית דומה בנ benthamiana ונ &#39; excelsiana. לכן, נ &#39; excelsiana עשוי להיות מארח מתאים יותר לייצור חלבון רקומביננטי. ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium מוגבל על ידי 26 PTGS, שניתן להתגבר על ידי שיתוף ביטוי של השתקת גני מדכאי ממוצא וירוס צמח 62. ייצור חלבון חולף כבר הראה בעבר להיות משופר פי 50 בנוכחותו של חלבון p19 של TBSV, אשר מעכב PTGS ברקמות הסתננו 34. במחקר שלנו, העריך את ההשפעה של שני מדכאי נגיפיים השתקה (p19 ו p23) בנפרד שיתוף הסתננו עם וקטור השקת pBID4-HAC1. שיתוף ההסתננות של מדכאי השתקה אלה נראית שיש השפעה מועטת על ביטוי חולף של HAC1, עם עלייה קלה בלבד בHAC1הצטברות חלבון (15-25%) בנוכחות של p23 או p19 שיתוף הסתנן. כדי להשפיע על ייצור חלבון באופן חיובי, מדכאי השתקה ייתכן שיהיו הצורך שנבחרו במיוחד כדי להיות יעיל עבור מיני צמחים הממוקדים ווקטור ויראלי 63. יש helicase TMV מדכאי פעילות השתקת RNA 64,65. הנתונים שלנו לאשר תצפית זו כמו שיתוף ההסתננות של p23 או p19 עם pBID4-HAC1 לא גרמה לעלייה בGFP או עלייה קלה בייצור חלבון HAC1 החולף. לסיכום, יש לנו שונה ומותאם צמח ותנאי גידול Agrobacterium ושיפרו את היעילות של חדירת אבק. טכנולוגיה זו אפשרה לנו לגדול ולחדור מאות קילוגרמים של חומר צמחי בכמה שעות. אנחנו אוטומטיים בהצלחה טכניקת הביטוי חולפת המפעל לייצור חיסון תפוקה גבוהה בקני מידה תעשייתיות בשיטות ייצור טוב הנוכחיות תנאים (cGMP). לקבלת מידע נוסף אבוהאוטומציה ut וניצול של מערכת הצמח חולפת חלבון הייצור לייצור חלבונים רקומביננטיים, כולל מועמדי חיסון למקטע, תחת תנאי cGMP, קוראים מופנים לאתר <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/.</a>

צמחי החברה מוכרים כפלטפורמה בטוחה, אמינה, ניתן להרחבה וזולה לייצור תרופות הביולוגיים רקומביננטי Heterologous וחלבונים תעשייתיים 1-3 ויש לי יתרונות חשובים על פני מערכות ביטוי תא של חיידקים ובעלי חי 4. צמחים מסוגלים לבטא חלבונים מקופלים בצורה נכונה עם שלאחר translational שינויים, כולל נוגדנים Multimeric התאספו 5-7. חלבונים רקומביננטיים תרופות צמחיות כמה עוברים הערכה קלינית 8. אלה כוללים חיסוני מטופל ספציפי רקומביננטי אזוטיפ (scFv) לטיפול בלימפומה שאינה הודג&#39;קין 9, מגיפה מבוססת hemagglutinin ומועמדים חיסון שפעת עונתיים 10,11 (קאמינגס et al., שהוגש לחיסון), אני אנטיגן פני השטח נגד סטרפטוקוקוס / נוגדן השני לטיפול בעששת 12, והאינסולין אנושי לטיפול בסוכרת 13. יתר על כן, reco אדםglucocerebrosidase mbinant לטיפול בתחליפי אנזים בחולים עם מחלת גושה כבר אושר בישראל ובארצות הברית, והוא ניתן במסגרת תכנית הגישה המורחבת מחוץ לארה&quot;ב 14,15. ניתן לייצר חלבוני Heterologous בהפכו ביציבות (מהונדס או transplastomic) או צמחים הפכו transiently. ייצור חלבון חולף מציע מספר יתרונות על פני ייצור בצמחים הטרנסגניים, כוללים פרק זמן קצר כדי להשיג ביטוי והצטברות 16, ויכול להיות מושגת על ידי החדרת וקטורים בינאריים חיידקים או וקטורים ויראליים צמח רקומביננטי לתוך רקמות צמח 4. מערכת הביטוי חולפת המתקדמת ביותר מבוססת על השימוש ב&#39;וקטורי השקה &#39;המשלבים רכיבים של וירוסי צמחים ופלסמידים בינארי, ומועברים על ידי agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration של וקטור השקה המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) יושם בהצלחה במעבדהאת קנה המידה כדי לייצר אנטיגנים חיסון נגד פתוגנים כגון וירוס הפפילומה אנושי 19, Yersinia pestis 20, שפעת וירוסים, anthracis Bacillus 21,22 23, ונגיף אבעבועות שחורות 24 בנ benthamiana עוזב. ביטוי חולף בתיווך Agrobacterium הוא גם שיטה מבטיחה לייצור בו זמני של חלבונים רבים 2,25-27. לדוגמא, מערכות ביטוי חולפות צמח היו בשימוש כדי לייצר נוגדני גידול ספציפי רקומביננטי 28,29, נוגדן מסוכר רקומביננטי כנגד הקולטן לגורם גדילה באפידרמיס 30, ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים לאנטיגן מגן האנתרקס 31,32. שיתוף חדירה של צמחי benthamiana Nicotiana עם גן מטרה ומדכא של תוצאות להשתקת גנים בביטוי חלבון המטרה משופרת 33,34. Agroinfiltration היא שיטה נפוצה לintrodu אחידחיידקי cing מחסה גן של עניין למפעל רקמות 35-37. חדירת אבק של Agrobacterium לביטוי גנים חולף בצמח שלם משאיר היא שיטה מהירה, ניתן להרחבה, ושימושית לייצור של חלבונים זרים ללא הצורך לייצר צמחים מהונדסים 38-41. במהלך agroinfiltration ואקום, צמחים התהפך במהופך וחלקי אוויר שקוע בהשעית Agrobacterium. אז ואקום מיושם גורם גזים לפינוי מחללים אינטר עלה דרך הפיוניות. השחרור מחדש על לחץ הבא מהיר של תוצאות הוואקום בעירוי של ההשעיה Agrobacterium לעלה. בעקבות חדירת אבק של Agrobacteria, צמחי מעובדות נוספות וביטוי היעד הוא תחת פיקוח. הרמות הגבוהות ביותר של ביטוי היעד הם נצפו בדרך כלל 2-3 ימים שלאחר חדירה (dpi) עם וקטור בינארי ו4-7 dpi עם וקטור השקה, לאחר שרמת הביטוי בדרך כלל decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens הוא הרכב הנפוץ ביותר להעברת גן של עניין למפעל לייצור חלבון. Agroinfiltration עובד מצוין בנ benthamiana אבל יחסית גרוע ברוב הצמחים אחרים, כולל thaliana ארבידופסיס 46. במחקר זה, פיתחנו שיטה פשוטה, יעילה וחסכונית לייצור חלבון חולף בנ &#39;בן השבוע 5-6 benthamiana באמצעות א tumefaciens הסתננות. החסרון העיקרי של קנה מידה תעשייתית של טכניקת agroinfiltration הוא צנטריפוגה של חיידקים וresuspension של גלולה החיידקים במצע המכילה 4&#39;-hydroxy-3 שנקטפו &quot;, 5&#39;-dimethoxyacetophenone (acetosyringone), מונוסכרידים, ו 2 - (N-morpholino) -Ethanesulfonic חומצה (MES) חיץ לאינדוקציה של גנים vir. אנחנו כבר מסוגלים להתגבר על בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של Agrobacterium </em&gt; צמיחה במדיום AB (מדיום מינימאלי) ואחריו ישירות דילול במים מילי-Q ועל ידי שליטה על משך החדירה ותנאים. יש לנו גם בהשוואה ייצור חלבון המטרה בנ &#39;מיני מארח טבק wild-type benthamiana ונ &#39; נסורת, כמו גם בנ ההיברידי excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

ייצור חלבון חולף בתיווך Agrobacterium בצמחים הוא גישה מבטיחה לייצר אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים בתוך תקופה קצרה של זמן. עם זאת, טכנולוגיה זו היא רק מתחילה להיות מיושמת על מכשולים טכנולוגיים רבים ייצור בקנה מידה גדולה בהיקף של עד הם עתה להתגבר עליו. הנה, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה ולשעתק לייצור חלבון חולף בקנה מידה תעשייתית המבוססים על חדירת אבק של צמחי Nicotiana עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה. אופטימיזציה של טיפוח Agrobacterium במדיום AB מאפשרת דילול ישיר של תרבות החיידקים במים מילי-Q, לפשט את תהליך החדירה. בין שלושה מינים שנבדקו של Nicotiana, נ &#39; excelsiana (נ benthamiana × נ הנסורת) נבחר כמארח המבטיח ביותר בשל הקלות של חדירה, רמה גבוהה של ייצור חלבון כתב, ועל שני-fייצור ישן גבוה יותר ביומסה בתנאים סביבתיים מבוקרים. אינדוקציה של Agrobacterium מחסה pBID4-GFP (מבוסס נגיף פסיפס טבק) שימוש בכימיקלים כגון acetosyringone וmonosaccharide לא הייתה השפעה על רמת ייצור החלבון. צמח שחדר מתחת 50-100 mbar ל30 או 60 שניות הביא לחדירת% על 95 של רקמות עלים צמח. הסתננות עם GV3101 זן המעבדה Agrobacterium הראתה ייצור החלבון הגבוה ביותר בהשוואה לזני Agrobacteria מעבדה LBA4404 וC58C1 ופראי מהסוג Agrobacteria זני at6, at10, at77 וA4. שיתוף ביטוי של השתקת RNA נגיפי מדכא, p23 או p19, בנ benthamiana הביא להצטברות מוקדם יותר וייצור מוגבר (15-25%) חלבון המטרה (hemagglutinin וירוס שפעת) של.

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...