Name: optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Fraunhofer USA Center for molekylær bioteknologi, IBIO, Inc. og Defense Advanced Research Projects Agency (stipend # HDTRA1-07-C-0054). Forfatterne erkjenner de sjenerøse gaver av legene. Stanton Gelvin of Biological Science Dept., Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammer) og Wayne Fitzmaurice av Large Scale Biology Corp (N. excelsiana frø), samt Jennifer Nicholson på US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior frø ). Forfatterne takker Margaret Shillingford og Christopher Hull for å gi planter og god teknisk assistanse. Forfatterne har også takke legene. Stephen Streatfield og Natasha Kushnir for redaksjonell bistand.

En. Plant Økende For påfølgende agroinfiltration vi evaluert to villtype Nicotiana arter (N. benthamiana og N. excelsior) og en hybrid (N. excelsiana) vokst hydroponically på Rockwool i innendørs anlegg. <ol><li> Sug steinullfibre plater i et anlegg gjødsel-løsning. </li><li> Så frø av villtype N. benthamiana, N. excelsior og N. excelsiana (hybrid av N. benthamiana × N. excelsior) på næringsstoffer gjennomvåt Rockwool overflaten. </li><li> Dyrke planter fra frø under kontrollerte forhold (24 ° C og 40-65% relativ luftfuktighet) og en lang dag daglengde (14 timers lys og 10 timer mørke, med belysning av 130-150 μE m -2 sek -1) for 4-5 uker for N. benthamiana og N. excelsiana, og 5-6 uker for N. excelsior. </li></ol> 2. Bygging av vektorer for Agroinfiltration <ol><li> Sett inn en syntetisk reporter genet (grønt fluorescerende protein [GFP]), full-lengde hemagglutinin (HA) fra A/California/04/2009 stamme av influensavirus (HAC1), og re-konstruert lichenase enzym (LicKM) 18 hver for seg i lanseringen vektor pBID4 18 (TMV-basert vektor) for å få pBID4-GFP, pBID4-HAC1 og pBID4-LicKM henholdsvis 18,32,41,47. </li><li> Introduser 10-50 ng av pBID4 bærer GFP eller HAC1 inn electrocompetent celler av A. tumefaciens belastning GV3101 og LicKM inn electrocompetent celler av A. tumefaciens stammer GV3101, C58C1, GLA4404, At06, AT10, At77 og A4 med genet MicroPulser electroporator. </li><li> Bruk forvandlet Agrobacteria for infiltrasjonsforsøk med mindre annet er angitt. </li></ol> Tre. Støvsug Infiltrasjon av Agrobacterium inn Nicotiana Planter <ol><li> Grow A. tumefaciens påkjenningen over natten (O / N) i LB medium, YEB Medium-eller AB-medium supplert med 50 mg / L kanamycin ved 28 ° C med rysting ved 200 til 250 rpm. </li><li> Fortynn Agrobacteria i Milli-Q vann til en optisk densitet ved 600 nm (A 600) på 0,5 eller sentrifuge Agrobacterium-celler dyrket i LB-eller YEB eller AB ved 4000 x g i 10 min ved 4 ° C, re-suspendere i induksjonsmedium (1x MS salt, 10 mM MES, 200 mM acetosyringone, 2% sukrose [MMA]) å A 600 på 0,5, og omrør ved romtemperatur i 1-3 time, med mindre noe annet er angitt. </li><li> Infiltrere planter i et vakuumkammer ved å senke Nicotiana plante antenne vev i Agrobacterium suspensjon og bruke en 50-400 mbar vakuum for 30 eller 60 sek. Den optimale infiltrering blir rutinemessig anvendt ved 50 til 100 mbar i 60 sek. </li><li> Når vakuumet brytes, fjernes planter fra vakuumkammeret, skylles i vann, og vokse i 5-7 dager under de samme vekstbetingelser som benyttes for å pre-infiltrasjon vekst. </li><li> For å teste effektenav kjemikalier som induserer Agrobacterium vir-genet, forskjellige konsentrasjoner av acetosyringone (0, 100, 200 eller 400 pM) ble tilsatt til Agrobacteria suspendert i infiltrasjons buffer (1x MS, 10 mM MES, 2% glukose). For virkningen av monosakkarid på induksjon av vir-genet, forskjellige prosenter av glukose (0, 1, 2 eller 4%) ble tilsatt til Agrobacteria suspendert i infiltrasjons buffer (1x MS, 10 mM MES, 200 mM acetosyringone). N. benthamiana planter ble infiltrert som nevnt ovenfor i trinn 3.3 og 3.4). </li><li> Agrobacterium laboratoriestammer GV3101, C58C1 og LBA4404 og villtype stammer A4, At06, AT10, og At77 husing den pBID4-LicKM vektor ble fortynnet i Milli-Q vann til A 600 på 0,5 N.. benthamiana planter ble infiltrert med hverandre bestemte belastninger som er nevnt ovenfor i trinn 3.3 og 3.4. </li></ol> 4. Co-agroinfiltration Prosedyre for Viral Slå av lyd lyddemper <ol><li> Mix de Milli-Q vann-utvannet Agrobacterium GV3101 kulturer bærer GFP genet og viral stanse suppressor p19 av Tomato buskete stunt virus (TBSV) på 1:01, 2:01, 3:01 og 4:01 forholdstall. Infiltrere N. benthamiana planter som er beskrevet ovenfor. </li><li> Infiltrere N. benthamiana planter med en blanding av to Milli-Q-vann-fortynnet Agrobacterium GV3101 kulturer: den første bærer pBID4-HAC1 plasmid og den andre bærer en av de Silencing suppressors - p19 av TBSV eller p23 av Citrus Tristeza virus, i pCassp plasmid ( pCassp19) og i PGR binært plasmid under 35S promoter (PgR-P23), henholdsvis i forholdet 4:1. </li></ol> 5. Western Blot analyse <ol><li> Samle tilfeldige blad prøver fra N. benthamiana, N. excelsior eller N. excelsiana anleggene på 4-7 ppt og pulverisere i flytende nitrogen til et fint pulver. </li><li> Legg tre bindene av 1x PBS buffer som inneholder 0,5% TritonX-100 til hver prøve. </li><li> Rist de utpakkede prøvene for 15 min ved 4 ° C. </li><li> Spinn ekstrakt i 5 min, og samle totalt oppløselig protein inn i en ren Eppendorf-rør. </li><li> Fortynn ekstraktene til en passende fortynning (1:50 1:100) i 1 x PBS ekstraksjon buffer, og tilsett 5 x prøvebuffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% bromfenolblått og 50% glycerol v / v, og 500 mM DTT) til en endelig konsentrasjon 1 x. </li><li> Kok prøver for 5 min. </li><li> Separate proteiner ved 10% SDS-PAGE, overføre til Immobilon-P overføring membran, og blokkere med 0,5% I-blokk. </li><li> Detect GFP bruker kanin polyklonale anti-GFP antiserum på 1:5,000 og HAC1 bruker mus anti-poly-histidin monoklonalt antistoff på 1:1.000 i blokkering løsning for en hr. </li><li> Etter primær antistoffmerking, vaskes membranene tre ganger i 10 minutter hver med 1 x PBST-20 og inkuberes med et pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert anti-kanin-antistoff på 1:5,000 eller HRP-konjugatd anti-mus-antistoff til 1:10.000 i 1 time, for GFP og HAC1 påvisning hhv. </li><li> Behandle vestlige blotter bruker SuperSignal West Pico Chemiluminescent underlaget. </li><li> Bruk GeneTools Programvare å analysere bandet intensiteten av protein og få bandet kalibrert kvantitet. </li></ol> Proteinproduksjon: (Kalibrert kvantum x fortynning av prøven) / mengden av prøve ladet) x 4 = mg / kg. Formel: protein produksjon (P), kalibrert mengde (C), fortynning av prøven (D), og mengden av prøve lagt i (S). 6. Zymogram Assay <ol><li> Samle pBID4-LicKM-infiltrert N. benthamiana tilfeldig vevsprøver. </li><li> Ekstraher proteiner ved hjelp av de samme metoder som er beskrevet ovenfor for Western blot-analyse, og deretter analysere med 10% SDS-PAGE med 0,1% lichenan inkludert i gelene. </li><li> Etter elektroforese, vaske gelene to ganger i 10 minutter hver i vaskebuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] og 0,1% Triton X-100), Og deretter inkuberes i vaskebuffer ved 65 ° C i 1 time. </li><li> Etter inkubasjon forkaste vaskebuffer og beis gelene med 0,5% Congo Red i 5 min ved romtemperatur. </li><li> Skyll gels i Milli-Q vann tre ganger i 10 min hver, og tilsett 1 M NaCl å visualisere lichenase aktivitet. Den rensede bakterielle lichenase protein ble anvendt som en positiv kontroll for enzymaktivitet. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Utfør visuell påvisning av GFP fluorescens i hele forbigående forvandlet planter ved hjelp av en håndholdt lang bølgelengde UV lampe. </li><li> Foto forbigående forvandlet planter med et digitalt kamera gjennom en gul 8, ES 52 filter (eksponeringstid, 15 sek). </li><li> Få bilder fra Western blot analyser ved hjelp av GeneSnap programvaren på en GeneGnome og kvantifisere resultatene ved hjelp av GeneTools programvare, med en kalibreringskurve basert på renset GFP standard. </li><li> Kvantifisere HAC1 protein ved hjelp av en kalibreringskurve basert på renseteknologied HAC protein standard fra A/Indonesia/05/05 stamme av influensavirus. </li><li> Beregn middelverdier 3-4 gjentak for alle eksperimenter. </li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

I denne studien har vi utviklet en enkel agroinfiltration protokoll for rutinemessig forbigående protein produksjon i utvalgte Nicotiana arter som bruker Agrobacterium stammer bærer lanseringen vektor. I tillegg har vi identifisert de optimale betingelser for å oppnå høyest rekombinant proteinproduksjonsnivået i vårt transient plante ekspresjonssystem. Vacuum infiltrasjon av fortynnet A. tumefaciens belastning GV3101 husing lanseringen vektor pBID4 i N. benthamiana, N. excelsiana og N. excelsior resulterte i høyere nivåer av mål protein produksjon innen 7 dpi i forhold til andre plantearter, som for eksempel Pisum sativum infiltrert med GV3101 husing Alfalfa mosaikk virus - eller agurk mosaikkvirusbaserte vektorer som uttrykker GFP reporter genet under 35S promoter 41, eller Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum og Arabidopsis thaliana infiltrert med C58C1 stamme av A. tumefaciens som bærer beta-glucuronidase reporter gen 57.. N. benthamiana og N. excelsiana var lett å støvsuge infiltrere på 50 mbar for 30-60 sek, med 90-95% infiltrasjon effektivitet. De resterende 5-10% av bladarealet ble ikke infiltrert på grunn av noen flytende av blader på overflaten av Agrobacterium suspensjonen under anvendelse av vakuum. Siden lanseringen vektor har muligheten for celle-til-celle bevegelse 18, oppstår forbigående akkumulering av proteiner i hele blader samt petioles på 7 dpi. På 10 ppt, beregnet GFP produksjonen var noe lavere fordi pBID4 ekspresjonsvektor er i stand til å bevege seg fra celle til celle, men ikke til å bevege seg systemisk 18; derfor trenger nylig dyrkede bladene ikke inneholder vektoren, og bidrar ikke til fremstilling av målet. I tillegg nedbrytning av det rekombinante protein over tid may bidra til redusert protein nivå på 10 dpi. Våre resultater viste at infiltrasjon av A. tumefaciens belastning GV3101 medierte høye nivåer av forbigående protein produksjon i N. benthamiana. Videre kan målprotein være konstruert som N-terminale, C-terminale eller interne fusjoner til lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanase, som er et termostabilt enzym fra Clostridium thermocellum og confers termostabilitet for mange target protein fusion 18. Infiltrasjon av N. benthamiana med A. tumefaciens villtype stammer (AT6, at10 og at77) skjuler genet av interesse fremkalte milde eller alvorlige symptomer: blad curling, bladstilken tøyelighet, og curling. Ingen patologiske symptomer ble observert i N. benthamiana infiltrert med laboratoriestammen GV3101 husing tom pBID4 vektor, mens noen gener settes inn pBID4 og forvandlet til laboratoriestammer GV3101, C58C1 eller LBA4404 fremkalte mild nekrotiske svar og bladchlorosis / gulning symptomer i infiltrert regioner av blader. Nekrotiske symptomer forårsaket av villtype Agrobacterium eller avvæpnet stammer i solanaceous planter har tidligere 56,57 blitt rapportert. Den nekrotiske responsen kan skyldes virulensfaktorer av Type III sekresjon system, bakterielle proteiner overført til planteceller ved type IV sekresjon system, og / eller følsomhet for flagellin 58-60. Vi har funnet at forbigående produksjon av heterologe proteiner, kan også fremkalle patogenitet og en hypersensitiv respons i infiltrert planteblader. Mange forskere rapporterte at agroinfiltration av ulike plantearter med plante binære vektorer produsert opp til 5-20 ganger høyere nivåer av forbigående proteinproduksjon sammenlignet med stabilt transformerte planter 28,57. Våre data viser at N. benthamiana infiltrert med GV3101 husing pBID4-GFP forbigående uttrykt høye nivåer av GFP, som er lik den GFP rapporterte utbytte forN. benthamiana infiltrert med Agrobacteria bærer Pich-GFPSYS viral vektor (opp til 80% av den totale oppløselige protein) 44. Agroinfiltration bruke vår lansering vektor resulterte i høy produksjon av termostabile protein LicKM, 50 ganger høyere enn det som er observert ved hjelp av en standard binær plasmid 18. For å teste smittsomhet av A. tumefaciens og stabiliteten av lanseringen vektor, infiltrert vi en flat av N. benthamiana hver time for opptil 8 timers bruker samme Milli-Q vann-fortynnet kultur GV3101 huse den pBID4-GFP plasmid. Våre data viste at GV3101 belastningen er effektivt infeksiøs i minst 8 timer og pBID4 (lanseringen vektor) er svært stabil i løpet av åtte timer lange infiltrasjon. Glyserol lager av GV3101 belastning husing lanseringen vektor pBID4-HAC1 (cellen bank) oppbevares ved -80 ° C har vist seg å være svært stabil i tre år uten endringer i transient protei produksjon i infiltrert planter. N. benthamiana planter dyrket under optimale forhold og mellom 35 og 42 dager etter såing var optimal for vakuum infiltrasjon-mediert forbigående genuttrykk 40. Yngre planter (3-4 uker gamle) kan ikke bli infiltrert i sin helhet på grunn av blader som flyter på cellesuspensjon overflate og vevsskade fra de mekaniske virkninger av å anvende et vakuum. I planter som er eldre enn 45 dager, N. benthamiana bolting scenen, under optimale lysforhold som brukes, er nivået på gående uttrykk lav. Lav molekylvekt fenoliske forbindelser (acetosyringone) og monosaccharaides (glukose) er kjent for å indusere vir gener i A. tumefaciens 55,61. Videre, infiltrasjon av N. benthamiana med den binære vektoren pCAMBIA (GFP) i nærvær av acetosyringone ved konsentrasjoner på 50 til 600 uM ble vist å gradvis øke transientgenuttrykk 40. Vi studerte effekten av ulike konsentrasjoner av acetosyringone og glukose i vårt system ved å legge disse forbindelsene til GV3101 kulturer skjuler pBID4-GFP i MMA i 3 timer, og fant ingen forskjell i GFP uttrykk. Interessant, GV3101 kulturer skjuler pBID4-GFP og utvannet i Milli-Q vann til en A 600 på 0,5 og infiltrerte uten vir genet induksjon uttrykt de samme mengder av GFP som de infiltrert med induserte kulturer. Den A. tumefaciens vir-genet (e) kan potensielt bli indusert av plante fenoliske forbindelser (acetosyringone og sinapinic syre) og plante monosaccharaides (glukose og fruktose) til stede i blad vev. Derfor spekulere vi at tilsvarende nivåer av GFP ekspresjon i nærvær eller fravær av eksogene genet vir indusere kan være et resultat av virkningen av cytoplasmatiske vir genet induktorer stede under replikasjonen av GFP-uttrykkende vektor lanserings i planteceller. N. benthamiana har blitt benyttet som en modell-vert for transient proteinproduksjon 49.. Imidlertid hindrer N. benthamiana er relativt lavt utbytte av biomasse dens anvendelse for stor-skala produksjon av rekombinante proteiner. Den optimale vert bør kombinere en høy grad av transient ekspresjon, lett vekst i et drivhus, og være utsatt for Agrobacterium infiltrasjon 2.. For å velge en alternativ vert, vi infiltrert to forskjellige villtype arter av Nicotiana (N. benthamiana og N. excelsior) og en hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) med A. tumefaciens belastning GV3101 husing den pBID4-GFP plasmid. Blant disse tre artene, nivået av GFP uttrykk var noe høyere i N. benthamiana. N. Excelsior planter viste problemer med vakuum agroinfiltration grunn av sine læraktige blader, og N. excelsianaproduserte omtrent to ganger mer biomasse under samme vekstbetingelser. Den forbigående produksjon av GFP på 7 dpi er relativt like i N. benthamiana og N. excelsiana. Derfor, N. excelsiana kan være en mer passende vert for rekombinant proteinproduksjon. Agrobacterium-mediert forbigående protein produksjonen er begrenset av PTGs 26, som kan overvinnes ved co-uttrykk av genet stanse undertrykkere av plante virus opprinnelse 62 år. Transient proteinproduksjon er tidligere vist å være forbedret 50 ganger i nærvær av p19 proteinet i TBSV, som hemmer PTGs i infiltrert vev 34. I vår studie, vurderte vi effekten av to virus Silencing dempere (P19 og P23) separat co-infiltrert med lanseringen vektor pBID4-HAC1. Den co-infiltrasjon av disse støydempere dempere syntes å ha liten innflytelse på forbigående uttrykk for HAC1, med bare en svak økning i HAC1akkumulering av proteiner (15-25%) i nærvær av co-infiltrerte p23 eller p19. Å positivt påvirke proteinproduksjon, kan støydempere dempere må være spesielt utvalgt for å være effektive for de målrettede plantearter og viral vektor 63. TMV heli har en suppressor av RNA stanse aktiviteten 64,65. Våre data bekrefter denne observasjonen som co-infiltrasjon av p23 eller p19 med pBID4-HAC1 medførte ingen økning i GFP eller en svak økning i den forbigående HAC1 proteinproduksjon. Som konklusjon, har vi modifiserte og optimaliserte anleggs Agrobacterium vekstbetingelser og forbedret effektiviteten av vakuum infiltrasjon. Denne teknologien gjort oss i stand til å vokse og infiltrere hundrevis av kilo plantemateriale i noen timer. Vi vellykket automatisert anlegget gående uttrykk teknikk for høy gjennomstrømming vaksineproduksjon ved industrivekt under dagens Good Manufacturing Practices (cGMP) vilkår. For mer informasjon about automatisering og utnyttelse av anlegget transient proteinproduksjonssystem for produksjon av rekombinante proteiner, inkludert subenhet vaksinekandidater, under cGMP betingelser, blir lesere referert til nettsiden <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Planter er nå anerkjent som en sikker, pålitelig, skalerbar og rimelig plattform for å produsere heterologe rekombinante Biopharmaceuticals og industri proteiner 1-3 og har viktige fordeler fremfor mikrobielle og dyrecelle ekspresjonssystemer fire. Planter er i stand til å uttrykke riktig foldet proteiner med posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert sammensatte multimere antistoffer 5-7. Flere plante-avledet rekombinante farmasøytiske proteiner er under klinisk evaluering åtte. Disse inkluderer pasientspesifikke rekombinante idiotypiske vaksiner (scFv) for behandling av non-Hodgkins lymfom 9, hemagglutinin-baserte pandemi-og sesonginfluensavaksinekandidater 10,11 (Cummings et al., Sendt til vaksine), anti-Streptococcus overflateantigen jeg / II-antistoff for behandling av dental caries 12, og human insulin for behandling av diabetes 13. Videre menneskelig Recombinant glucocerebrosidase for enzymerstatningsterapi hos pasienter med Gauchers sykdom har blitt godkjent i Israel og USA, og er gitt under det utvidete tilgangsprogrammet utenfor USA 14,15. Heterologe proteiner kan produseres i stabilt transformerte (transgen eller transplastomic) eller transient transformerte planter. Transient protein produksjon tilbyr flere fordeler i forhold til produksjonen av transgene planter, herunder kort tidsrom for å oppnå ekspresjon og akkumulering 16, og kan oppnås ved å innføre bakterielle binære vektorer eller rekombinant plante-virale vektorer inn i plantevev 4. Den mest avanserte gående uttrykk system er basert på bruk av &#39;lansering vektorer&#39; som kombinerer komponenter av plante virus og binære plasmider, og er levert av agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration av en lansering vektor basert på tobakk mosaikk virus (TMV) har blitt brukt på labskala for å produsere vaksineantigener mot patogener slik som human papilloma virus 19, Yersinia pestis 20, influensa A-virus 21,22, Bacillus anthracis 23, og koppevirus 24 i N. benthamiana blader. Agrobacterium-mediert gående uttrykk er også en lovende metode for samtidig produksjon av flere proteiner 2,25-27. For eksempel har anlegg transiente ekspresjonssystemer blitt brukt til å produsere tumor-spesifikke rekombinante antistoffer 28,29, et glykosylert rekombinant antistoff mot epidermal vekstfaktor-reseptor-30, og et monoklonalt antistoff som er spesifikt for anthrax beskyttende antigen 31,32. Co-infiltrasjon av Nicotiana benthamiana planter med et mål gen og en suppressor av genet stanse resulterer i forbedret målprotein uttrykk 33,34. Agroinfiltration er en vanlig metode for jevnt innførtdistanse bakterier som inneholder et gen av interesse inn i plantevev 35-37. Vacuum infiltrasjon av Agrobacterium for forbigående genuttrykk i intakt plante blader er en rask, skalerbar, og nyttig metode for produksjon av fremmede proteiner uten å måtte generere transgene planter 38-41. Under vakuum agroinfiltration, er planter snudd opp ned og antenne deler nedsenket i Agrobacterium suspensjon. Vakuum brukes deretter forårsaker gasser å evakuere fra blad mellomrom mellom gjennom stomata. Rapid gjentrykksetting etter frigjøring av vakuum resulterer i tilførsel av Agrobacterium suspensjonen inn i bladet. Etter vakuum infiltrasjon av Agrobacteria, er plantene dyrkes videre og målet uttrykk overvåkes. De høyeste nivåene av målet uttrykk er vanligvis observert 2-3 dager etter infiltrasjon (dpi) med en binær vektor og 4-7 dpi med en lansering vektor, hvoretter uttrykket nivået vanligvis avtarSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens er den mest brukte kjøretøy for å levere et gen av interesse til en plante for proteinproduksjon. Agroinfiltration fungerer usedvanlig godt i N. benthamiana men relativt dårlig i de fleste andre planter, blant annet Arabidopsis thaliana 46. I denne studien, har vi utviklet en enkel, effektiv og økonomisk metode for forbigående proteinproduksjon i 5-6 uker gamle N. benthamiana hjelp A. tumefaciens infiltrasjon. Den store ulempen med industriell skalering av agroinfiltration teknikk er sentrifugering av høstet bakterier og resuspensjon av den bakterielle pellet i et medium inneholdende 4&#39;-hydroksy-3 &#39;, 5&#39;-dimetoksyacetofenon (acetosyringone), monosakkarider, og 2 - (N-morfolino) -etansulfonsyre (MES) buffer for induksjon av de vir gener. Vi har vært i stand til å overvinne disse problemene ved å optimalisere Agrobacterium </em&gt; vekst AB medium (minimal medium), fulgt av direkte fortynning i Milli-Q-vann, og ved å kontrollere infiltrasjonen varighet og betingelser. Vi har også, sammenlignet målprotein produksjon i villtype tobakk vertsarter N. benthamiana og N. excelsior, samt i hybrid N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Agrobacterium-formidlet transient proteinproduksjon i planter er en lovende metode for å produsere vaksineantigener og terapeutiske proteiner i løpet av en kort tidsperiode. Imidlertid er denne teknologien bare så vidt begynt å bli brukt til storskala produksjon så mange teknologiske hindringer for å skalere opp nå blir overvunnet. Her viser vi en enkel og reproduserbar metode for industriell skala forbigående proteinproduksjon basert på vakuum infiltrasjon av Nicotiana planter med Agrobacteria bærer lanseringen vektorer. Optimalisering av Agrobacterium dyrking i AB medium tillater direkte fortynning av bakteriekultur i Milli-Q vann, forenkle infiltrasjon prosessen. Blant tre testede arter av Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) ble valgt som den mest lovende vert på grunn av den enkle infiltrasjon, høyt nivå av reporter proteinproduksjon, og om to-fold høyere biomasseproduksjon under kontrollerte miljøforhold. Induksjon av Agrobacterium husing pBID4-GFP (Tobakk mosaikk virus-baserte) bruker kjemikalier som acetosyringone og monosakkarid hadde ingen effekt på protein produksjonsnivå. Infiltrere anlegg under 50 til 100 mbar til 30 eller 60 sek resulterte i omtrent 95% infiltrasjon av plante blad vev. Infiltrasjon med Agrobacterium laboratoriestammen GV3101 viste det høyeste proteinproduksjon i forhold til Agrobacteria laboratoriestammer LBA4404 og C58C1 og villtype Agrobacteria stammer AT6, at10, at77 og A4. Co-uttrykk for en viral RNA stanse demper, p23 eller p19, i N. benthamiana resulterte i tidligere akkumulering og økt produksjon (15-25%) av målprotein (influensavirus hemaglutinin).

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient proteinproduksjon i Nicotiana anlegg basert på vakuum-infiltrering med Agrobacteria bærer utskytnings vektorer (tobakk mosaikkvirusbasert) er en rask og økonomisk metode for å produsere vaksineantigener og terapeutiske proteiner. Vi forenklet prosedyre og forbedret mål akkumulering ved å optimalisere forholdene for bakterier dyrking, valg av vertsarter, og co-introdusere RNA silencing dempere.

Optimalisering og utnyttelse av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediert Transient Protein Produksjonen i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrasjon og PVX Agroinfection i Potet og Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging analysen i Nicotiana benthamiana blader for Transiently bestemme Protein-protein samhandling Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediert Immature Embryo Transformasjon av Recalcitrant Maize Innavlede linjer ved hjelp av morfonisk gener

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...