Name: optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Эта работа была поддержана Fraunhofer США Центра молекулярной биотехнологии, Ibio, Inc и обороны Агентства перспективных исследовательских проектов (грант # HDTRA1-07-C-0054). Авторы признают, щедрые подарки от доктора. Стэнтон Gelvin биологических наук кафедра, Университет Пердью (Agrobacterium tumefaciens штаммы) и Уэйн Фитцморисом крупномасштабных биологии корпорации (Н. семян excelsiana), а также Дженнифер Николсон из США Nicotiana Collection, Государственного университета Северной Каролины (N. Excelsior семян ). Авторы выражают благодарность Маргарет Shillingford и Кристофер Халл для обеспечения растений и отличную техническую помощь. Авторы также благодарят доктора. Стивен Стритфилд и Наташа Кушнир за помощь в редактировании.

1. Растениеводство Для последующего агроинфильтрации мы оценивали два дикого типа видов Nicotiana (Н. benthamiana и Н. Excelsior) и гибридные (Н. excelsiana) вырос на гидропонике на минеральной ваты в закрытых помещениях. <ol><li> Замочите ROCKWOOL плиты в растворе завод удобрений. </li><li> Сейте семена дикого типа N. benthamiana, Н. Excelsior и Н. excelsiana (гибрид Н. benthamiana × N. Excelsior) на питательные вещества замачивают Rockwool поверхность. </li><li> Выращивать растения из семян в контролируемых условиях (24 ° С и 40-65% относительной влажности) и долго-дневный фотопериода (14 ч света и 10 ч темноты, с освещением 130-150 мкЕ м -2 с -1) для 4-5 недель для N. benthamiana и Н. excelsiana, и 5-6 недель для N. Excelsior. </li></ol> 2. Конструирование векторов для Agroinfiltratион <ol><li> Вставьте ген синтетический репортер (зеленый флуоресцентный белок [GFP]), полнометражные гемагглютинина (HA) от A/California/04/2009 штамма вируса гриппа (HAC1) и модернизирована лихеназы фермента (LicKM) 18 отдельно в вектор Запуск pBID4 18 (ВТМ основе вектор), чтобы получить pBID4-GFP, pBID4-HAC1 и pBID4-LicKM соответственно 18,32,41,47. </li><li> Представьте 10-50 нг pBID4 балансовую GFP или HAC1 в электрокомпетентных клетках А. tumefaciens штамм GV3101 и LicKM в электрокомпетентных клетках А. tumefaciens штаммов GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 и A4 с ген MicroPulser электропоратора. </li><li> Используйте преобразованный Agrobacteria для инфильтрации экспериментов если не указано иное. </li></ol> 3. Вакуумные инфильтрация Agrobacterium в Nicotiana растений <ol><li> Расти А. tumefaciens штаммов в течение ночи (O / N) в LB среде, Yeb медий или AB среде, дополненной 50 мг / л канамицина при 28 ° С при встряхивании при 200-250 оборотов в минуту. </li><li> Развести Agrobacteria в Milli-Q воды до оптической плотности при 600 нм (600) от 0,5 или центрифуга Agrobacterium клеток, выращенных в LB или Yeb или AB в 4000 × г в течение 10 мин при 4 ° С, повторно приостанавливать в индукционной среде (1x MS соли, 10 мМ MES, 200 мкМ ацетосирингона, 2% сахарозы [MMA]) до 600 0,5, и перемешивают при комнатной температуре в течение 1-3 ч, если не указано иное. </li><li> Проникнуть растений в вакуумной камере путем погружения Nicotiana растений воздушные ткани в Agrobacterium суспензии и нанесения 50-400 мбар вакууме в течение 30 или 60 секунд. Применяется Оптимальный инфильтрация обычно на 50-100 мбар в течение 60 секунд. </li><li> После вакуум нарушается, удалить растений из вакуумной камеры, промыть в воде, и расти в течение 5-7 дней при тех же условиях роста, используемых для роста предварительно инфильтрации. </li><li> Чтобы проверить эффективностьхимических веществ, индуцирующих ген вир Agrobacterium, различные концентрации ацетосирингона (0, 100, 200 или 400 мкм) были добавлены к суспендированного в буфере инфильтрации Agrobacteria (1x MS, 10 мМ MES, 2% глюкозы). Для эффекта моносахарида по индукции гена ВИР различным процентным содержанием глюкозы (0, 1, 2 или 4%) были добавлены к Agrobacteria суспендировали в буфере инфильтрации (1x MS, 10 мМ MES, 200 мкМ ацетосирингона). N. benthamiana растения проникли как упоминалось выше в шагах 3.3 и 3.4). </li><li> Agrobacterium лабораторных штаммов GV3101, C58C1 и LBA4404 и штаммов дикого типа A4, AT06, AT10, и At77 несущие вектор pBID4-LicKM разводили в Milli-Q воды в 600 0.5. N. benthamiana растения проникли с каждого конкретного штамма, как указано выше в шагах 3.3 и 3.4. </li></ol> 4. Процедура сотрудничества агроинфильтрации для вирусного глушителей Suppressor <ol><li> МIX Milli-Q воды разбавлено Agrobacterium GV3101 культуры, несущие ген GFP и вирусную глушителей подавитель p19 томатного пушистый трюк вируса (TBSV) 1:1, 2:1, 3:1 и 4:01 отношения. Проникнуть N. benthamiana растения, как описано выше. </li><li> Проникнуть N. benthamiana растения смесью двух Milli-Q водой разбавляют Agrobacterium GV3101 культур: первый несущий плазмиду pBID4-HAC1 и второй несущий один из глушителей супрессоров - р19 из TBSV или p23 вируса Citrus Tristeza, в плазмиде pCassp ( pCassp19) и в PGR бинарную плазмиду под промотора 35S (PGR-P23), соответственно, в соотношении 4:1. </li></ol> 5. Вестерн-блоттинга <ol><li> Соберите образцы случайных листьев от N. benthamiana, Н. Excelsior или N. excelsiana растения на 4-7 руб и распылить в жидком азоте в мелкий порошок. </li><li> Добавить три тома 1x буфера PBS, содержащем 0,5% ТритонX-100 для каждого образца. </li><li> Аккуратно встряхните извлеченные образцы в течение 15 мин при 4 ° С. </li><li> Спин экстракта в течение 5 мин и собирают общего растворимого протеина в чистую пробирку Эппендорфа. </li><li> Развести экстракты к соответствующему разведения (1:50 1:100) в 1x PBS буфере для экстракции, и добавить 5 × буфера для образца (250 мМ Трис-HCl [рН 6,8], 10% SDS, 0,5% бромфенолового синий, 50% глицерина об / об, и 500 мМ DTT) до конечной концентрации 1 ×. </li><li> Образцы кипятят в течение 5 мин. </li><li> Отдельные белки на 10% SDS-PAGE, передавать на Immobilon-P передачи мембраны, и блок с 0,5% I-блока. </li><li> Обнаружение GFP с помощью кроличьей поликлональной анти-GFP антисыворотки на 1:5000 и HAC1 использованием мышиного анти-поли-гистидина моноклональное антитело по 1:1000 в блокирующем растворе в течение 1 часа. </li><li> После маркировки первичного антитела, промывка мембран три раза в течение 10 мин каждый с 1 × PBST-20 и инкубировать с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированной анти-кролик антител на 1:5000 или HRP-конъюгатаD анти-мышиного антитела в 1:10000 в течение 1 ч, за GFP и обнаружения HAC1, соответственно. </li><li> Процесс западных помарки помощью SuperSignal Запад Пико хемилюминесцентные подложку. </li><li> С помощью программного обеспечения для анализа GeneTools интенсивность полосы белка и получить полосу калиброванный количество. </li></ol> Производство белка: (калиброванная величина х разбавление образца) / количество образца загруженной) х 4 = мг / кг. Уравнение: Продуцирование белка (Р), калиброванный количество (С), разбавление образца (D) и количество образца загружалась (S). 6. Zymogram Анализ <ol><li> Сбор pBID4-LicKM-проникли Н. benthamiana образцы случайным тканей. </li><li> Извлечение белков с использованием тех же методов, описанных выше для Вестерн-блоттинга, а затем анализировать на 10% ДСН-ПААГ с 0,1% лихенан включены в гелях. </li><li> После электрофореза гели мыть два раза в течение 10 минут в каждом из промывочного буфера (100 мМ Трис-HCl [рН 8,0] и 0,1% Тритон Х-100), А затем инкубируют в промывочном буфере при 65 ° С в течение 1 часа. </li><li> После инкубации отбросить промывочный буфер и окрашивают гели с 0,5% конго красного в течение 5 мин при комнатной температуре. </li><li> Промыть гелей в Milli-Q воды три раза в течение 10 мин каждый, и добавить 1 М NaCl визуализировать лихеназы деятельность. Очищенный бактериальный белок лихеназы был использован в качестве положительного контроля для активности фермента. </li></ol> 7. GFP изображений <ol><li> Выполнение визуальное обнаружение флуоресценции GFP в целых временно трансформированных растений с помощью ручного длинноволновой УФ-лампы. </li><li> Фотография временно трансформированные растения с цифровой камеры через желтый 8, ES 52 фильтр (время экспозиции, 15 сек). </li><li> Получение изображений с Вестерн-блот анализ с помощью программного обеспечения GeneSnap на GeneGnome и количественного определения результатов с помощью программного обеспечения GeneTools, с калибровочной кривой, основанной на очищенной стандарта GFP. </li><li> Количественно HAC1 белка с использованием калибровочной кривой на основе purifiред HAC стандарт белка из штамма A/Indonesia/05/05 вируса гриппа. </li><li> Рассчитать средние значения от 3-4 повторяет во всех экспериментах. </li></ol>

Нам нечего раскрывать.

В этом исследовании, мы разработали простой протокол агроинфильтрации для рутинной переходного производства белка в отдельных видов Nicotiana использованием штаммов Agrobacterium, несущие вектор запуска. Кроме того, мы определили оптимальные условия для достижения наивысшего рекомбинантный уровень производства белка в нашем переходном системы экспрессии растений. Вакуумная инфильтрация разбавленного А. tumefaciens штамм GV3101, несущие вектор pBID4 запуска в N. benthamiana, Н. excelsiana и Н. эксцельсиор привело к более высоким уровням производства белка-мишени в течение 7 руб по сравнению с другими видами растений, таких как Pisum посевного пропитывают GV3101, несущего вирус мозаики люцерны - или вируса огуречной мозаики на основе векторов, экспрессирующих ген GFP-репортер под промотора 35S 41, или Lactuca сатива, Solanum LycoPersicum и арабидопсис проникли со штаммом C58C1 А. tumefaciens, несущие репортер ген бета-глюкуронидазы 57. Н. benthamiana и Н. excelsiana было легко пропылесосить проникнуть в 50 мбар в течение 30-60 сек, с 90-95%-ной эффективности инфильтрации. Остальные 5-10% площади листа не проникли из-за некоторого плавающего листьев на поверхности суспензии Agrobacterium в течение применением вакуума. Так как вектор запуск имеет способность для движения 18 от клетки к клетке, накопление переходный белка происходит в целых листьев, а также черешках на 7 руб. В 10 точек на дюйм, по оценкам производство GFP был несколько ниже, потому что вектор экспрессии pBID4 способен двигаться от клетки к клетке, но не двигаться системно 18 лет; Поэтому, вновь выращенные листья не содержат вектор и не способствуют производству цели. Кроме того, ухудшение рекомбинантного белка с течением времени май способствовать снижению уровня белка в 10 руб. Наши результаты показали, что проникновение в А. tumefaciens штамм GV3101 опосредованные высокие уровни переходных производства белка в N. benthamiana. Кроме того, целевой белок может быть спроектирован как N-концевые, С-концевые или внутренние слитых в лихеназы (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-глюканазы, который является термостабильный фермент из Clostridium thermocellum и дает термостабильность во многие цели слитый белок 18. Проникновение N. benthamiana с А. tumefaciens штаммов дикого типа (AT6, AT10 и at77) укрывательство интересующий ген вызвал умеренные или тяжелые симптомы: лист керлинг, черешок удлинения, и щипцы. Никаких патологических симптомов не наблюдалось в N. benthamiana проникли с лабораторным штаммом GV3101 укрывательство пустой pBID4 вектор, в то время как некоторые гены вставлены в pBID4 и превращается в лаборатории штаммов GV3101, C58C1 или LBA4404 вызвал умеренные некротические ответы и листхлороз / пожелтение симптомы в проникших регионов листьев. Некротические симптомы, вызванные дикого типа Agrobacterium или разоружены штаммов в пасленовых растений были сообщалось ранее 56,57. Некротический ответ может быть результатом факторов вирулентности секреции системы типа III, бактериальных белков, переданных в растительной клетке системой секреции типа IV, и / или чувствительности к флагеллином 58-60. Мы обнаружили, что переходный процесс производства гетерологичных белков также может вызывать патогенность и реакции гиперчувствительности в проникла листьев растений. Многие исследователи сообщили, что агроинфильтрации различных видов растений с растений двоичных векторов, произведенных до 5-20 раз более высокие уровни переходных продукции белка по сравнению с стабильно трансформированных растений 28,57. Наши данные показывают, что Н. benthamiana проникли с GV3101, несущие pBID4-GFP временно экспрессированного высокие уровни GFP, который похож на выход GFP, описанной дляН. benthamiana проникли с Agrobacteria неся вирусного вектора Pich-GFPSYS (до 80% от общего растворимого белка) 44. Агроинфильтрации с помощью нашего запуска вектор привело к высокой продукции термостабильной LicKM белка, в 50 раз выше, чем наблюдаемое с помощью стандартного бинарного плазмидного 18. Чтобы проверить инфекционность А. tumefaciens и стабильность вектора ракеты, мы проникли один плашмя N. benthamiana каждый час в течение до 8 ч, используя тот же Milli-Q водном растворе культуры GV3101, несущие плазмиду pBID4-GFP. Наши данные показали, что штамм GV3101 эффективно инфекционный, по крайней мере 8 часов и pBID4 (вектор запуск) является очень стабильным в течение 8 ч на протяжении инфильтрации. Глицерин запас GV3101 штамма, ракеты вектор pBID4-HAC1 (банк клеток), который хранится при -80 ° С, как было показано, чтобы быть очень стабильным в течение трех лет без изменений в переходных защпроизводства в проникших растений. Н. benthamiana растения, выращенные в оптимальных условиях и между 35 и 42 дней после посева были оптимальными для вакуумной инфильтрации опосредованного временной экспрессии гена 40. Младшие растения (3-4 недель) не может быть полностью проник из-за листьев, плавающих на поверхности клеточной суспензии и повреждению тканей от механического воздействия применения вакуума. В растениях старше 45 дней, N. benthamiana болтов этап, при оптимальных условиях освещения, используемых, уровень кратковременной экспрессии является низким. Низкомолекулярные соединения вес фенольные (ацетосирингона) и monosaccharaides (глюкозы), как известно, вызывают гены Вир в А. tumefaciens 55,61. Более того, проникновение N. benthamiana с бинарный вектор pCAMBIA (GFP) в присутствии ацетосирингона в концентрации 50-600 мкМ были показаны несколько увеличить переходныйэкспрессии генов 40. Мы изучали влияние различных концентраций ацетосирингона и глюкозы в нашей системе, добавив эти соединения в GV3101 культур, несущих pBID4-GFP в ММА в течение 3 часов, и не обнаружили различий в выражении GFP. Интересно, GV3101 культуры, несущие pBID4-GFP и разбавленные в Milli-Q воды до 600 и от 0,5 проникли без индукции гена Vir выражали то же самое количество GFP, как те проникли с индуцированных культур. А. Ген вир tumefaciens (ы) потенциально может быть вызвано фенольных соединений растений (ацетосирингона и sinapinic кислоты) и растений monosaccharaides (глюкоза и фруктоза), присутствующих в ткани листа. Таким образом, мы предполагаем, что подобные уровни GFP экспрессии в присутствии или в отсутствие экзогенного гена Vir индукторов может быть результатом эффекта цитоплазматических генов вир индукторов, присутствующих во время репликации GFP-экспрессирующих запуска вектора в клетках растений. Н. benthamiana был использован в качестве типового хозяина для переходного продукции белка 49. Тем не менее, относительно низкий выход биомассы Н. benthamiana &#39;ы сдерживает его применение для крупномасштабного производства рекомбинантных белков. Оптимальное хост должен объединить высокий уровень кратковременной экспрессии, легкий роста в теплице, и быть восприимчивыми к Agrobacterium инфильтрации 2. Чтобы выбрать альтернативный хост, мы проникли два разных вида дикого типа Nicotiana (Н. benthamiana и Н. стружку) и гибридный N. excelsiana (Н. benthamiana × N. Excelsior) с А. tumefaciens штамм GV3101, несущих плазмиды pBID4-GFP. Среди этих трех видов, уровень экспрессии GFP был несколько выше, в N. benthamiana. Н. Excelsior растения показал трудности в вакуумной агроинфильтрации из-за их кожистыми листьями, и Н. excelsianaпроизводится примерно в два раза больше биомассы при тех же условиях роста. Переходный производство GFP в 7 руб относительно похожи в N. benthamiana и Н. excelsiana. Таким образом, N. excelsiana может быть более подходящим хозяином для рекомбинантного белка. Переходные производство белка Агробактериальная ограничивается PTGS 26, который может быть преодолена путем совместной экспрессии гена глушителей супрессоры растительного вируса происхождения 62. Переходный производство белка Ранее было показано, чтобы быть повышена в 50 раз в присутствии белка р19 TBSV, который ингибирует PTGS в тканях проникли 34. В нашем исследовании мы оценивали влияние двух вирусных глушителей супрессоров (р19 и р23) отдельно совместно проникли с ракетой-вектора pBID4-HAC1. Совместное инфильтрация этих глушителей супрессоров, казалось, мало влияют на временной экспрессии HAC1, только с небольшим увеличением HAC1Накопление белка (15-25%) в присутствии со-проникли p23 или p19. Чтобы положительно повлиять на производство белка, глушителей супрессоров возможно, должны быть специально отобраны, чтобы быть эффективным для целевых видов растений и вирусного вектора 63. ВТМ геликаза имеет подавитель из РНК глушителей деятельности 64,65. Наши данные подтверждают это наблюдение как со-инфильтрация p23 или p19 с pBID4-HAC1 не привело к увеличению GFP или незначительного увеличения переходного производства HAC1 белка. В заключение, мы изменили и оптимизированы завод и условия роста Agrobacterium и повысила эффективность вакуумной пропитки. Эта технология позволила нам расти и проникнуть сотни килограммов растительного материала в течение нескольких часов. Мы успешно автоматизировала переходный технику выражение завода по производству высокой пропускной вакцины в промышленных масштабах в нынешних надлежащей производственной практики (цГМФ) условия. Для получения дополнительной информации абоавтоматизация и использование растительного переходного белка производственной системы для производства рекомбинантных белков, в том числе кандидатов субъединицы вакцины, в условиях цГМФ ут, читатели могут обратиться к веб-сайта <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Растения в настоящее время признается в качестве безопасной, надежной, масштабируемой и недорогой платформы для производства гетерологичных рекомбинантных биофармацевтических препаратов и промышленных белки 1-3 и имеют важные преимущества перед микробных и животных систем экспрессии клеток 4. Растения способны выразить правильно сложенные белки с пост-трансляционных модификаций, включая собранные мультимерных антител 5-7. Несколько растительного происхождения рекомбинантные фармацевтические белки проходит клинические испытания 8. К ним относятся пациент-специфических рекомбинантных вакцин идиотипа (ScFv) для лечения неходжкинской лимфомы в 9, гемагглютинин основе пандемического и сезонного кандидатов вакцины против гриппа 10,11 (Каммингс и др.., Который был представлен вакцины), анти-Streptococcus поверхностный антиген I / II антитела для лечения кариеса зубов 12 и человеческого инсулина при лечении диабета 13. Кроме того, человеческий выздоровеетmbinant глюкоцереброзидаза для фермента терапии у пациентов с болезнью Гоше был одобрен в Израиле и США и предоставляется в рамках Программы доступа Расширенной за пределами США 14,15. Гетерологичных белков могут быть получены в стабильно трансформированных (трансгенных или транспластомных) или временно трансформированных растений. Переходный производство белка предлагает несколько преимуществ по сравнению с производством в трансгенных растений, в том числе короткого периода времени, чтобы достичь экспрессию и накопление 16, и может быть достигнуто путем введения бактериальных двоичные векторы или рекомбинантный растительные вирусные векторы в растительные ткани 4. Самые передовые переходный система выражение основано на использовании &quot;Launch векторов&quot;, которые сочетают компоненты растительных вирусов и бинарных плазмид, и поставляемых агроинфильтрации 17,18. Агроинфильтрации вектора ракеты на основе вируса мозаики табака (ВТМ) успешно применяется в лабораториимасштабировать для производства вакцинных антигенов против патогенов, таких как вирус папилломы человека 19, Yersinia Pestis 20, вирусы гриппа A 21,22, Bacillus сибирской язвы 23, и вирус оспы 24 в N. benthamiana уходит. Агробактериальная кратковременная экспрессия также перспективным методом одновременного производства нескольких белков 2,25-27. Например, растительные переходные системы экспрессии были использованы для получения опухоль-специфичные рекомбинантных антител, 28,29 гликозилированного рекомбинантного антитела против рецептора эпидермального фактора роста 30, а также моноклональное антитело, специфичное для сибирской язвы протективный антиген 31,32. Со-инфильтрация Nicotiana benthamiana растений с гена-мишени и подавитель результатов молчание генов в повышенной экспрессии белка-мишени 33,34. Агроинфильтрации является распространенным методом для равномерно IntroduCing бактерии, несущие ген интереса в тканях растений 35-37. Вакуумная инфильтрация Agrobacterium для временной экспрессии генов в неповрежденной листьях растений является быстрым, масштабируемой и полезный метод для производства чужеродных белков без необходимости генерировать трансгенные растения 38-41. Во время вакуумной агроинфильтрации, растения перевернул с ног на голову и надземные части погруженным в Agrobacterium подвески. Тогда вакуум применяется вызывая газы эвакуироваться из листьев межклеточных пространствах через устьица. Быстрое повторное нагнетание После выхода из вакуумных приводит к инфузии Agrobacterium суспензии в лист. После вакуумной инфильтрации Agrobacteria, растения культивируют и целевой выражение контролируется. Самые высокие уровни целевой выражения обычно наблюдаются 2-3 дней после инфильтрации (точек на дюйм) с двоичным вектором и 4-7 руб с вектором запуска, после чего уровень экспрессии обычно уменьSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens является наиболее широко используемым средством для доставки гена интереса в растение для производства белка. Агроинфильтрации работает исключительно хорошо в N. benthamiana но относительно слабо и в большинстве других растений, в том числе арабидопсис 46. В этом исследовании, мы разработали простой, эффективный и экономичный способ переходных продукции белка в 5-6 недельной давности N. benthamiana помощью A. tumefaciens инфильтрации. Основным недостатком промышленного масштабирования методики агроинфильтрации является центрифугирование добываемых бактерий и ресуспендирования бактериальных гранул в среде, содержащей 4&#39;-гидрокси-3 &#39;, 5&#39;-диметоксиацетофенон (ацетосирингона), моносахариды, и 2 - (N-морфолино) -этансульфоновой кислоты (MES) буфер для индукции генов Вир. Мы были в состоянии преодолеть эти проблемы за счет оптимизации Agrobacterium </EM&gt; рост AB среды (минимальная среда) с последующим непосредственно разбавления в Milli-Q воды и, контролируя продолжительность и условия инфильтрации. Мы также по сравнению производство белка мишени в дикого типа хост табак видов N. benthamiana и Н. эксцельсиор, а также в гибридных N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Переходный производство белка Agrobacterium-опосредованной у растений является перспективным подходом для получения вакцинными антигенами и терапевтических белков в течение короткого периода времени. Тем не менее, эта технология только начинает применяться к крупномасштабных производственных столько технологических препятствий для расширения в настоящее время преодолены. Здесь мы демонстрируем простое и воспроизводимый метод для производства в промышленных масштабах переходный белка на основе вакуумной инфильтрации Nicotiana растений с Agrobacteria проведения запуска векторов. Оптимизация выращивания Agrobacterium в АБ среды позволяет прямое разбавление бактериальной культуры в Milli-Q воды, что упрощает процесс инфильтрации. Среди трех тестируемых видов Nicotiana, N. excelsiana (Н. benthamiana × N. Excelsior) была выбрана в качестве наиболее перспективного хозяина из-за легкости проникновения, высокий уровень продукции белка-репортера, и около двух-естарый выше производство биомассы в контролируемых условиях окружающей среды. Индукция Agrobacterium укрывательство pBID4-GFP (вируса табачной мозаики на основе) с использованием химических веществ, таких как ацетосирингона и моносахаридов не влияло на уровень производства белка. Проникнув завод под 50 до 100 мбар в течение 30 или 60 секунд в результате около 95% проникновения растительных тканях листа. Проникновение с Agrobacterium лабораторного штамма GV3101 показали высокий производство белка по сравнению с Agrobacteria лабораторных штаммов LBA4404 и C58C1 и дикого типа Agrobacteria напрягает AT6, AT10, at77 и A4. Совместная экспрессия вирусного РНК глушителей супрессоров, p23 или p19, в N. benthamiana привело к более ранней накопления и увеличения производства (15-25%) от белка-мишени (гемагглютинина вируса гриппа).

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Переходные производство белка в Nicotiana растений на основе вакуумной пропитки с Agrobacteria проведения запуска векторов (Табак вирус основе мозаики) является быстрым и экономический подход для получения вакцинных антигенов и терапевтических белков. Мы упростили процедуру и улучшение накопление целевой счет оптимизации условий культивирования бактерий, отбора видов хозяев, и со-внедрения РНК глушителей ограничителей.

Оптимизация и использование<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Опосредованного переходных Белок Производство в<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Производство репликации ретровируса Дефектные от переходных Трансфекция 293T клетки

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Способ получения рекомбинантного белка mCD1d в клетках насекомых.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Вирус-индуцированные генов (VIGS) в Nicotiana benthamiana И томатный

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Агроинфильтрация и PVX Агроинфекция в картофель и Никотиана бентамиана

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium- Посредника незрелых эмбрионов Преобразование непокорных кукурузы инбредных линий с использованием морфогенных генов

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...