Name: optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00
Duration: 23 min 21 s
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Este trabajo fue apoyado por Fraunhofer EE.UU. Centro para la Biotecnología Molecular, Ibio, Inc. y la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (subvención # HDTRA1-07-C-0054). Los autores agradecen los regalos generosos por los Dres. Stanton Gelvin de Ciencias Biológicas Departamento de la Universidad de Purdue (Agrobacterium tumefaciens cepas) y Wayne Fitzmaurice de Gran Escala Biología Corp. (semillas excelsiana N.), así como Jennifer Nicholson Colección de Nicotiana EE.UU., la Universidad Estatal de Carolina del Norte (semillas excelsior N. ). Los autores agradecen a Margaret Shillingford y Christopher casco para proporcionar plantas y su excelente asistencia técnica. Los autores también agradecen a los Dres. Stephen Streatfield y Natasha Kushnir por su asistencia editorial.

1. Planta que crece Para la posterior agroinfiltration evaluamos dos especies de Nicotiana de tipo salvaje (N. benthamiana y N. excelsior) y un híbrido (N. excelsiana) cultivadas hidropónicos en lana de roca en las instalaciones interiores. <ol><li> Remojar la lana de roca en una solución de abono para las plantas. </li><li> Siembre las semillas de tipo salvaje de N. benthamiana, N. excelsior y N. excelsiana (híbrido de N. benthamiana × N. excelsior) en los nutrientes empapada superficie de lana de roca. </li><li> Cultiva plantas de las semillas bajo condiciones controladas (24 ° C y humedad relativa de 40-65%) y un fotoperiodo de día largo (14 horas de luz y 10 horas de oscuridad, con iluminación de 130 a 150 E · m -2 s -1) para 4-5 semanas para N. benthamiana y N. excelsiana, y 5-6 semanas para N. excelsior. </li></ol> 2. Construcción de vectores para Agroinfiltration <ol><li> Inserte un gen indicador sintético (proteína verde fluorescente [GFP]), de larga duración de la hemaglutinina (HA) de la cepa del virus de la influenza A/California/04/2009 (HAC1), y re-ingeniería de la enzima liquenasa (LicKM) 18 por separado en el vector de lanzamiento pBID4 18 (vector basado en TMV) para obtener pBID4-GFP, pBID4-HAC1 y pBID4-LicKM, respectivamente 18,32,41,47. </li><li> Introducir 10-50 ng de pBID4 llevar las buenas prácticas agrarias o HAC1 en células electrocompetentes de A. tumefaciens cepa GV3101 y LicKM en células electrocompetentes de A. Agrobacterium cepas GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, At10, At77 y A4 con el electroporador MicroPulser gen. </li><li> Utilice la agrobacterias transformadas para los experimentos de infiltración a menos que se indique lo contrario. </li></ol> 3. Aspire infiltración de Agrobacterium en plantas de Nicotiana <ol><li> Crecer A. tumefaciens cepas durante la noche (O / N) en medio LB, med YEBio o medio AB suplementado con 50 mg / l de kanamicina a 28 ° C con agitación a 200-250 rpm. </li><li> Diluir agrobacterias en agua Milli-Q para una densidad óptica a 600 nm (600) de células 0.5 o Agrobacterium centrífuga crecido en LB o YEB o AB en 4000 × g durante 10 min a 4 ° C, volver a suspender en medio de inducción (sal 1x MS, MES 10 mM, acetosiringona 200 mM, 2% de sacarosa [MMA]) a A 600 de 0,5, y se agita a temperatura ambiente durante 1-3 hr, salvo que se indique lo contrario. </li><li> Infiltrarse en las plantas en una cámara de vacío sumergiendo tejidos aéreos de la planta Nicotiana en suspensión de Agrobacterium y la aplicación de un vacío 50-400 mbar durante 30 o 60 segundos. La infiltración óptima se aplica rutinariamente en 50-100 mbar durante 60 segundos. </li><li> Una vez que se rompe el vacío, retire las plantas de la cámara de vacío, enjuague en agua, y crecer durante 5-7 días en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el crecimiento pre-infiltración. </li><li> Para probar la eficaciade productos químicos que inducen gen vir de Agrobacterium, diferentes concentraciones de acetosiringona (0, 100, 200 o 400 micras) se añadieron a la agrobacterias se suspendieron en tampón de infiltración (1x MS, MES 10 mM, 2% de glucosa). Para el efecto de monosacárido en la inducción del gen vir, diferentes porcentajes de glucosa (0, 1, 2 o 4%) se añadieron a agrobacterias en suspensión en el tampón de infiltración (1x MS, MES 10 mM, 200 mM de acetosiringona). N. benthamiana plantas se infiltraron como se ha mencionado anteriormente en las etapas 3.3 y 3.4). </li><li> Laboratorio de cepas de Agrobacterium GV3101, C58C1 y LBA4404 y las cepas de tipo salvaje A4, AT06, AT10 y At77 alberga el vector pBID4-LicKM se diluyeron en agua Milli-Q a A 600 de 0,5. N. benthamiana plantas se infiltraron con cada cepa en particular como se mencionó anteriormente en los pasos 3.3 y 3.4. </li></ol> 4. Procedimiento Co-agroinfiltration para el supresor de silenciamiento viral <ol><li> Mix las culturas Milli-Q agua-diluido Agrobacterium GV3101 que portan el gen GFP y el silenciamiento viral p19 supresor de tomate enanismo arbustivo del virus (TBSV) en 1:01, 2:01, 3:01 y 4:01 ratios. Infíltrate N. benthamiana plantas como se describió anteriormente. </li><li> Infíltrate N. benthamiana plantas con una mezcla de dos culturas Agrobacterium GV3101 diluidas en agua Milli-Q: el primero lleva el plásmido pBID4-HAC1 y el segundo que lleva uno de los supresores de silenciamiento - p19 de TBSV o p23 del virus de la tristeza de los cítricos, en el plásmido pCassp ( pCassp19) y en el plásmido binario pGR bajo el promotor 35S (PGR-P23), respectivamente, en la relación 04:01. </li></ol> 5. Análisis Western Blot <ol><li> Recoger muestras de hojas al azar de N. benthamiana, N. excelsior o N. plantas excelsiana en 4-7 ppp y pulverizar en nitrógeno líquido a un polvo fino. </li><li> Añadir tres volúmenes de tampón PBS 1x que contienen 0,5% de TritonX-100 a cada muestra. </li><li> Agite suavemente las muestras extraídas durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Haga girar el extracto durante 5 min y recoger la proteína soluble total en un tubo Eppendorf limpio. </li><li> Diluir los extractos a una dilución apropiada (1:50 1:100) en tampón de extracción 1x PBS, y añadir 5 × tampón de muestra (Tris-HCl 250 [pH 6,8], 10% de SDS, 0,5% azul de bromofenol, 50% de glicerol v / v, y DTT 500 mM) a una final concentración de 1 ×. </li><li> Muestras hervir durante 5 min. </li><li> Proteínas separadas en un 10% SDS-PAGE, transferencia a una membrana de transferencia Immobilon-P, y bloquean con un 0,5% I-bloque. </li><li> Detectar GFP usando anticuerpo policlonal de conejo anti-GFP antisuero a 1:5.000 y HAC1 usando anticuerpo monoclonal de ratón anti-poli-histidina en 1:1.000 en solución de bloqueo durante 1 hora. </li><li> Después de etiquetado anticuerpo primario, lavar las membranas tres veces durante 10 minutos cada uno con 1 × PBST-20 e incubar con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo anti-conejo a 1:5.000 o un conjugado de HRPd anticuerpo anti-ratón en 1:10.000 durante 1 hora, por las buenas prácticas agrarias y la detección HAC1, respectivamente. </li><li> Procesar las transferencias de Western utilizando el sustrato SuperSignal West Pico quimioluminiscente. </li><li> Utilice la GeneTools Software para analizar la intensidad de banda de la proteína y obtener la cantidad calibrada banda. </li></ol> La producción de proteínas: (Calibrado cantidad x de dilución de la muestra) / cantidad de muestra cargada) x 4 = mg / kg. Ecuación: La producción de proteínas (P), la cantidad calibrada (C), la dilución de la muestra (D) y la cantidad de Muestra cargada (S). 6. Ensayo Zimograma <ol><li> N.-LicKM infiltrado-pBID4 Recoger benthamiana muestras de tejido al azar. </li><li> Extracto de proteínas usando los mismos métodos descritos anteriormente para el análisis de transferencia de Western y luego analizar por 10% de SDS-PAGE con 0,1% liquenano incluidos en los geles. </li><li> Después de la electroforesis, los geles de lavar dos veces durante 10 minutos cada uno en tampón de lavado (Tris-HCl 100 [pH 8,0] y 0,1% de Triton X-100) Y luego incubar en tampón de lavado a 65 ° C durante 1 hora. </li><li> Después de la incubación, desechar el tampón de lavado y manchar los geles con 0,5% de Rojo Congo durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague los geles en agua Milli-Q tres veces durante 10 minutos cada uno, y añadir 1 M NaCl para visualizar la actividad liquenasa. La proteína liquenasa bacteriana purificada se utilizó como control positivo para la actividad de la enzima. </li></ol> 7. Imaging GFP <ol><li> Realizar la detección visual de la fluorescencia de GFP en plantas enteras transformadas transitoriamente utilizando una lámpara UV de longitud de onda larga de mano. </li><li> Fotografía transitoriamente transformado plantas con una cámara digital a través de un Amarillo 8, ES 52 filtro (tiempo de exposición, 15 seg). </li><li> Obtener imágenes de Western blot análisis utilizando el software GeneSnap en un GeneGnome y cuantificar los resultados utilizando el software GeneTools, con una curva de calibración basada en el estándar GFP purificada. </li><li> Cuantificar proteína HAC1 utilizando una curva de calibración basada en purified HAC estándar de la proteína de la cepa del virus de la influenza A/Indonesia/05/05. </li><li> Calcule los valores medios 3-4 repeticiones para todos los experimentos. </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

En este estudio, hemos desarrollado un protocolo agroinfiltration simple para la producción de proteína transitoria de rutina en las especies de Nicotiana seleccionados utilizando cepas de Agrobacterium que llevan el vector de lanzamiento. Además, hemos identificado las condiciones óptimas para lograr el nivel más alto de producción de proteína recombinante en nuestro sistema de expresión de la planta transitoria. Infiltración de vacío de la A. tumefaciens GV3101 diluida cepa que alberga los pBID4 vector de lanzamiento en N. benthamiana, N. excelsiana y N. Excelsior resultaron en niveles más altos de producción de proteína diana dentro de 7 dpi en comparación con otras especies de plantas, tales como Pisum sativum infiltrado con GV3101 que albergan el virus del mosaico de la alfalfa - o del mosaico del pepino vectores basados ​​en virus que expresan el gen reportero GFP bajo el promotor 35S 41, o Lactuca sativa, Solanum lycopersicumpersicum y Arabidopsis thaliana infiltrado con la cepa de A. C58C1 tumefaciens que portan el gen reportero de beta-glucuronidasa 57. N. benthamiana y N. excelsiana fuera fácil para aspirar infiltrarse a 50 mbar durante 30-60 segundos, con 90-95% de eficiencia de la infiltración. El 5-10% restante del área de la hoja no se infiltró a causa de algún flotante de hojas en la superficie de la suspensión de Agrobacterium durante la aplicación del vacío. Dado que el vector de lanzamiento tiene capacidad para el movimiento de célula a célula 18, la acumulación de proteína transitoria se produce en hojas enteras, así como los pecíolos a 7 dpi. A 10 dpi, la producción estimada de GFP fue ligeramente inferior debido a que el vector de expresión pBID4 es capaz de pasar de célula a célula, pero no para mover sistémicamente 18; por lo tanto, las hojas recién crecido no contienen el vector y no contribuyen a la producción de la meta. Además, la degradación de la proteína recombinante con el tiempo mAy contribuir a reducir el nivel de proteína en 10 dpi. Nuestros resultados mostraron que la infiltración de la A. altos niveles tumefaciens cepa GV3101 mediadas de la producción de proteína transitoria en N. benthamiana. Por otra parte, la proteína objetivo puede ser diseñado como fusiones N-terminales, C-terminales o internos a liquenasa (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanasa, que es una enzima termoestable a partir de Clostridium thermocellum y confiere termoestabilidad a muchos objetivo la proteína de fusión 18. Infiltración de N. benthamiana con A. tumefaciens cepas de tipo salvaje (AT6, AT10 y at77) que albergan el gen de interés provocado síntomas leves o graves encresparse hoja, pecíolo de elongación, y se encrespan. No se observaron síntomas patológicos en N. benthamiana infiltra con la cepa GV3101 de laboratorio que alberga el vector vacío pBID4, mientras que algunos genes insertados en pBID4 y se transforma en laboratorio cepas GV3101, C58C1 o LBA4404 suscitó reacciones necróticas suaves y hojasclorosis / síntomas de amarillamiento en las regiones infiltrados de hojas. Síntomas necróticos causados ​​por Agrobacterium de tipo salvaje o cepas desarmadas en las plantas solanáceas se ha informado anteriormente 56,57. La respuesta necrótica puede resultar de factores de virulencia del sistema de secreción de tipo III, proteínas bacterianas transferidos a la célula vegetal por el sistema de secreción de tipo IV, y / o sensibilidad a la flagelina 58-60. Hemos encontrado que la producción transitoria de proteínas heterólogas también puede provocar la patogenicidad y una respuesta hipersensible en planta infiltrado hojas. Muchos investigadores informaron que agroinfiltración de diferentes especies de plantas con vectores binarios de plantas producidas hasta 5-20 veces los niveles más altos de producción de proteína transitoria en comparación con plantas transformadas de forma estable 28,57. Nuestros datos muestran que N. benthamiana se infiltró con GV3101 que albergan pBID4-GFP altos niveles expresados ​​transitoriamente de GFP, que es similar a la reportada para el rendimiento de GFPN. benthamiana se infiltró con Agrobacterium que lleva el vector viral Pich-GFPSYS (hasta 80% de proteína soluble total) 44. Agroinfiltration utilizando nuestro vector de lanzamiento resultó en alta producción de la proteína LicKM termoestable, 50 veces mayor que la observada usando un plásmido binario estándar de 18. Para probar la infectividad de A. tumefaciens y la estabilidad del vector de lanzamiento, que se infiltraron en un plano de N. benthamiana cada hora durante un máximo de 8 horas con el mismo cultivo diluido en agua Milli-Q de GV3101 que alberga el plásmido pBID4-GFP. Nuestros datos muestran que la cepa GV3101 es infeccioso eficaz durante al menos 8 horas y pBID4 (el vector de lanzamiento) es muy estable durante el tiempo de 8 horas la infiltración. Glicerol de la cepa GV3101 que alberga el vector de lanzamiento pBID4-HAC1 (banco de células) se almacenan a -80 ° C se ha demostrado para ser muy estable durante tres años sin cambios en prote transitoriaen la producción en plantas infiltradas. Plantas de N. benthamiana cultivadas en condiciones óptimas y entre 35 y 42 días después de la siembra fueron óptimas para vacío infiltración mediada por la expresión génica transitoria 40. Plantas más jóvenes (3-4 semanas de edad) no pueden ser infiltrados por completo a causa de las hojas que flotan en la superficie de la suspensión celular y daño en los tejidos de los efectos mecánicos de la aplicación de vacío. En las plantas de más de 45 días, N. benthamiana atornillar etapa, en las condiciones óptimas de luz utilizados, el nivel de expresión transitoria es baja. Los compuestos de bajo peso molecular fenólicos (acetosiringona) y monosaccharaides (glucosa) se sabe que inducen genes vir en A. tumefaciens 55,61. Por otra parte, la infiltración de N. benthamiana con el vector pCAMBIA binario (GFP) en la presencia de acetosiringona en las concentraciones de 50-600 mM, se mostró a aumentar ligeramente transitoriala expresión del gen 40. Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de acetosiringona y la glucosa en nuestro sistema mediante la adición de estos compuestos a las culturas GV3101 que albergan pBID4-GFP en las MMA durante 3 horas, y se encontraron diferencias en la expresión de GFP. Curiosamente, culturas GV3101 que albergan pBID4-GFP y diluidas en agua Milli-Q para una A 600 de 0,5 y se infiltraron sin la inducción de genes vir expresaron las mismas cantidades de GFP como aquellos infiltrado con los cultivos inducidos. El A. gen vir tumefaciens (s) potencialmente podría ser inducida por los compuestos fenólicos vegetales (acetosiringona y el ácido sinapínico) y monosaccharaides de plantas (glucosa y fructosa) presentes en el tejido de la hoja. Por lo tanto, se especula que niveles similares de expresión de GFP en presencia o ausencia de inductores exógenos de genes vir pueden ser el resultado del efecto de citoplásmicos inductores de genes vir presentes durante la replicación de la puesta en marcha del vector que expresa GFP en las células vegetales. N. benthamiana se ha utilizado como un modelo de acogida para la producción de proteína transitoria 49. Sin embargo, relativamente bajo rendimiento de biomasa de N. benthamiana &#39;s dificulta su aplicación para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. El anfitrión óptima debe combinar un alto nivel de expresión transitoria, fácil crecimiento en un invernadero, y ser susceptible a la infiltración de Agrobacterium 2. Para seleccionar un huésped alternativo, hemos infiltrado en dos especies de tipo salvaje diferentes de Nicotiana (N. benthamiana y N. excelsior) y un híbrido N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) con la A. tumefaciens GV3101 cepa que alberga el plásmido pBID4-GFP. Entre estas tres especies, el nivel de expresión de GFP fue ligeramente superior en N. . N. benthamiana plantas excelsior mostraron dificultad para agroinfiltration vacío debido a sus hojas coriáceas y N. excelsianaproducido aproximadamente dos veces más biomasa en las mismas condiciones de crecimiento. La producción transitoria de GFP a los 7 dpi es relativamente similar en N. benthamiana y N. excelsiana. Por lo tanto, N. excelsiana puede ser un anfitrión más adecuado para la producción de proteína recombinante. La producción de proteína transitoria mediada por Agrobacterium está limitada por PTGS 26, que puede ser superado por la co-expresión de silenciamiento de genes supresores de origen virus de la planta 62. La producción de proteína transitoria ha sido previamente demostrado ser mejorado 50 veces en la presencia de la proteína p19 de TBSV, que inhibe PTGS en tejidos infiltrados 34. En nuestro estudio, se evaluó el efecto de dos supresores de silenciamiento virales (p19 y p23) por separado co-infiltrado con el vector de lanzamiento pBID4-HAC1. La co-infiltración de estos supresores de silenciamiento parecía tener poca influencia sobre la expresión transitoria de HAC1, con sólo un ligero aumento en HAC1la acumulación de proteínas (15-25%) en la presencia de p23 co-infiltrada o p19. Para influir positivamente en la producción de proteínas, pueden necesitar ser seleccionado específicamente para ser eficaz para las especies de plantas específicas y vector vírico 63 supresores de silenciamiento. TMV helicasa tiene un supresor de la actividad de silenciamiento de ARN 64,65. Nuestros datos confirman esta observación como co-infiltración de p23 o p19 con pBID4-HAC1 dio lugar a ningún aumento de GFP o un ligero aumento en la producción de proteínas HAC1 transitoria. En conclusión, se ha modificado y optimizado las condiciones de crecimiento de Agrobacterium y las plantas y la mejora de la eficiencia de infiltración al vacío. Esta tecnología nos permitió crecer y de infiltrarse en cientos de kilogramos de material vegetal en unas pocas horas. Éxito automatizamos la técnica de la expresión transitoria planta para la producción de vacunas de alto rendimiento a escalas industriales bajo las actuales prácticas correctas de fabricación (cGMP) condiciones. Para obtener más información aboautomatización ut y utilización del sistema de la planta transitoria de la producción de proteínas para la producción de proteínas recombinantes, incluyendo candidatos a vacuna subunidad, en condiciones de cGMP, se recomienda acudir a la página web <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Las plantas son ahora reconocidos como una plataforma segura, fiable, escalable y de bajo costo para la producción de productos biofarmacéuticos recombinantes heterólogas y proteínas industriales 1-3 y tienen importantes ventajas sobre los sistemas de expresión de células microbianas y animales 4. Las plantas son capaces de expresar proteínas correctamente plegadas con modificaciones post-traduccionales, incluyendo anticuerpos multiméricos reunidos 5-7. Varias proteínas farmacéuticas recombinantes derivados de las plantas están sufriendo evaluación clínica 8. Estos incluyen las vacunas específicas para cada paciente recombinantes idiotipo (scFv) para el tratamiento del linfoma no Hodgkin 9, pandemia basada en la hemaglutinina y candidatos para vacunas antigripales estacionales 10,11 (Cummings et al., Presentado a la Vacuna), anti-Streptococcus antígeno de superficie que / anticuerpo II para el tratamiento de la caries dental 12, y la insulina humana para el tratamiento de la diabetes 13. Además, Reco humanaglucocerebrosidasa mbinant para la terapia de reemplazo enzimático en pacientes con enfermedad de Gaucher ha sido aprobado en Israel y en los EE.UU. y está previsto en el Programa de Acceso Ampliado fuera de los EE.UU. 14,15. Proteínas heterólogas se pueden producir en transformada de manera estable (transgénica o transplastómica) o plantas transformadas transitoriamente. La producción de proteína transitoria ofrece varias ventajas sobre la producción en plantas transgénicas, incluyendo marco de tiempo corto para conseguir la expresión y acumulación 16, y se puede lograr mediante la introducción de vectores binarios bacterianas o vectores virales de plantas recombinante en tejidos de las plantas 4. El sistema de expresión transitoria más avanzado se basa en el uso de «vectores de lanzamiento &#39;que combinan los componentes de virus de plantas y plásmidos binarios, y se entregan por agroinfiltración 17,18. Agroinfiltration de un vector de lanzamiento basado en mosaico del tabaco (TMV) se ha aplicado con éxito en el laboratorioescala para producir antígenos de vacunas contra patógenos como el virus del papiloma humano 19, Yersinia pestis 20, los virus gripales A 21,22, Bacillus anthracis 23, y el virus de la viruela en 24 N. benthamiana hojas. expresión transitoria mediada por Agrobacterium es también un método prometedor para la producción simultánea de múltiples proteínas 2,25-27. Por ejemplo, los sistemas de expresión transitoria de plantas han sido utilizadas para producir anticuerpos recombinantes específicos de tumor 28,29, un anticuerpo recombinante glicosilada contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico 30, y un anticuerpo monoclonal específico para el ántrax antígeno protector 31,32. Co-infiltración de plantas de Nicotiana benthamiana con un gen diana y un supresor de resultados de silenciamiento de genes en una mayor expresión de la proteína diana 33,34. Agroinfiltration es un método común para introdu uniformementebacterias Cing que albergan un gen de interés en los tejidos vegetales 35-37. Infiltración al vacío de Agrobacterium para la expresión génica transitoria en planta intacta hojas es un método rápido, escalable, y útil para la producción de proteínas extrañas sin la necesidad de generar plantas transgénicas 38-41. Durante agroinfiltration vacío, las plantas se da la vuelta al revés y partes aéreas sumergidas en una suspensión de Agrobacterium. A continuación se aplica el vacío que causa los gases para la evacuación de los espacios intercelulares de la hoja a través de los estomas. Rápida re-presurización siguiente publicación de los resultados de vacío en la infusión de la suspensión de Agrobacterium en la hoja. A raíz de la infiltración de vacío de Agrobacteria, las plantas se cultivan más y expresión objetivo es monitoreado. Los niveles más altos de expresión diana se observan típicamente 2-3 días después de la infiltración (ppp) con un vector binario y 4-7 ppp con un vector de lanzamiento, después de lo cual el nivel de expresión típicamente dismiSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens es el vehículo más ampliamente utilizado para la entrega de un gen de interés en una planta para la producción de proteínas. Agroinfiltration funciona excepcionalmente bien en N. benthamiana pero relativamente poco en la mayoría de otras plantas, incluyendo Arabidopsis thaliana 46. En este estudio, hemos desarrollado un método simple, eficiente y económico para la producción de proteína transitoria en 5-6 semanas de edad N. benthamiana utilizando A. tumefaciens infiltración. El principal inconveniente de escalado industrial de la técnica de la agroinfiltración es la centrifugación de las bacterias cosechadas y la resuspensión del sedimento bacteriano en medio que contenía 4&#39;-hidroxi-3 &#39;, 5&#39;-dimetoxiacetofenona (acetosiringona), monosacáridos, y 2 - (N-morfolino) -etanosulfónico (MES) tampón para la inducción de los genes vir. Hemos sido capaces de superar estos problemas mediante la optimización de la Agrobacterium </em&gt; el crecimiento en medio AB (medio mínimo) seguido por la dilución directamente en agua Milli-Q y mediante el control de la duración y las condiciones de infiltración. También hemos comparado la producción de proteínas diana en el N. de tipo silvestre las especies de acogida tabaco benthamiana y N. Excelsior, así como en N. híbrido excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

La producción de proteína transitoria mediada por Agrobacterium en plantas es un enfoque prometedor para producir antígenos de vacunas y proteínas terapéuticas en un corto período de tiempo. Sin embargo, esta tecnología sólo está empezando a aplicar a la producción a gran escala, muchos obstáculos tecnológicos para aumentar la escala de ahora están siendo superados. Este sentido, demuestran un método simple y reproducible para la producción de proteína transitoria a escala industrial basado en la infiltración de vacío de plantas de Nicotiana con Agrobacteria llevar vectores de lanzamiento. Optimización del cultivo de Agrobacterium en medio AB permite la dilución directa del cultivo bacteriano en agua Milli-Q, lo que simplifica el proceso de infiltración. Entre tres especies estudiadas de Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) fue seleccionado como el anfitrión más prometedor debido a la facilidad de la infiltración, el alto nivel de producción de la proteína reportera, y alrededor de dos fedad mayor producción de biomasa en condiciones ambientales controladas. La inducción de de Agrobacterium que alberga pBID4-GFP (virus del mosaico del tabaco a base) usando productos químicos tales como acetosiringona y monosacárido no tuvo efecto sobre el nivel de producción de proteínas. La infiltración de planta bajo de 50 a 100 mbar durante 30 o 60 segundos dio como resultado aproximadamente 95% de la infiltración de tejidos de las hojas de plantas. La infiltración con GV3101 de Agrobacterium cepa de laboratorio mostró la mayor producción de proteínas en comparación con cepas de laboratorio de Agrobacteria LBA4404 y C58C1 y de tipo salvaje cepas Agrobacteria at6, AT10, at77 y A4. Co-expresión de un ARN viral de silenciamiento supresor, p23 o p19, en N. benthamiana resultado en la acumulación antes y aumento de la producción (15-25%) de proteína diana (hemaglutinina del virus de la gripe).

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

La producción de proteína transitoria en plantas de Nicotiana sobre la base de infiltración al vacío con agrobacterias llevando vectores de lanzamiento (virus del mosaico del tabaco a base) es un enfoque rápido y económico para producir antígenos de vacunas y proteínas terapéuticas. Hemos simplificado el procedimiento mejorado y la acumulación de destino mediante la optimización de las condiciones de cultivo de bacterias, la selección de especies huéspedes, y co-introducción de supresores de silenciamiento de ARN.

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

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Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

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