Name: optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Fraunhofer USA Centrum för Molekylär Bioteknik, Ibio, Inc. och Defense Advanced Research Projects Agency (bidrag # HDTRA1-07-C-0054). Författarna erkänner de generösa gåvor av Dr. Stanton Gelvin of Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammar) och Wayne Fitzmaurice av Large Scale Biology Corp (N. excelsiana frön), liksom Jennifer Nicholson of US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior frön ). Författarna tackar Margaret Shillingford och Christopher Hull för att ge växter och utmärkt tekniskt stöd. Författarna tackar också Dr. Stephen Streatfield och Natasha Kushnir för redaktionell hjälp.

1. Växtodling För efterföljande agroinfiltration vi utvärderade två vildtyp Nicotiana arter (N. benthamiana och N. excelsior) och en hybrid (N. excelsiana) vuxit hydroponically på stenull i inomhusanläggningar. <ol><li> Blöt Rockwool plattor i en växtgödningslösning. </li><li> Så fröer av vildtyp N. benthamiana, N. excelsior och N. excelsiana (hybrid av N. benthamiana × N. excelsior) på de näringsämnen blöt rockwool yta. </li><li> Odla växter från fröna under kontrollerade betingelser (24 ° C och 40-65% relativ fuktighet) och en lång-dagars fotoperiod (14 h ljus och 10 h mörker, med belysning av 130-150 μE m -2 s -1) och 4-5 veckor för N. benthamiana och N. excelsiana, och 5-6 veckor för N. excelsior. </li></ol> 2. Konstruktion av vektorer för Agroinfiltration <ol><li> Sätt i en syntetisk reporter gen (grönt fluorescerande protein [GFP]), hellång hemagglutinin (HA) från A/California/04/2009 stam av influensavirus (HAC1), och omskapas likenas enzym (LicKM) 18 separat i lanseringen vektorn pBID4 18 (TMV-baserad vektor) för att erhålla pBID4-GFP, pBID4-HAC1 och pBID4-LicKM respektive 18,32,41,47. </li><li> Häll 10 till 50 ng av pBID4 bär GFP eller HAC1 in i elektrokompetenta celler av A. tumefaciens stam GV3101 och LicKM in i elektrokompetenta celler av A. tumefaciens stammar GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 och A4 med genen MicroPulser elektroporator. </li><li> Använd den transforme Agrobacteria för infiltrationsförsök, om inte annat anges. </li></ol> 3. Dammsug Infiltration av Agrobacterium i Nicotiana Växter <ol><li> Grow A. tumefaciens-stammar över natten (O / N) i LB-medium, YEB Medium eller AB-medium kompletterat med 50 mg / L av kanamycin vid 28 ° C med skakning vid 200-250 rpm. </li><li> Späd Agrobacteria i Milli-Q-vatten till en optisk densitet vid 600 nm (A 600) på 0,5 eller centrifug Agrobacterium-celler odlas i LB eller YEB eller AB på 4000 × g under 10 min vid 4 ° C, re-suspendera i induktionsmedium (1x MS salt, 10 mM MES, 200 pM acetosyringon, 2% sukros [MMA]) till A 600 av 0,5, och rör om vid rumstemperatur under 1-3 hr, om inget annat anges. </li><li> Infiltrera växter i en vakuumkammare, genom att sänka ned Nicotiana växt flygbilder vävnader i Agrobacterium-suspension och att applicera en 50 till 400 mbar vakuum under 30 eller 60 sek. Den optimala infiltration rutinmässigt tillämpas vid 50-100 mbar för 60 sek. </li><li> När vakuum är bruten, ta bort växter från vakuumkammaren, skölj i vatten, och växa i 5-7 dagar under samma odlingsbetingelser som används för pre-infiltration tillväxt. </li><li> För att testa effektivitetenav kemikalier som inducerar Agrobacterium vir-genen, olika koncentrationer av acetosyringon (0, 100, 200 eller 400 | im) sattes till Agrobacteria suspenderades i infiltrering buffert (1x MS, 10 mM MES, 2% glukos). För effekten av monosackarid om induktion av vir-genen, olika procentsatser av glukos (0, 1, 2 eller 4%) tillsattes till Agrobacteria suspenderades i infiltrationen buffert (1x MS, 10 mM MES, 200 pM acetosyringon). N. benthamiana växter infiltrerade som nämnts ovan i steg 3.3 och 3.4). </li><li> Agrobacterium laboratoriestammar GV3101, C58C1 och LBA4404 och vildtyp stammarna A4, AT06, AT10, och At77 härbärgerar pBID4-LicKM vektor späddes i Milli-Q-vatten till en 600 av 0,5. N. benthamiana växter infiltrerades med varje särskild stam som nämnts ovan i steg 3.3 och 3.4. </li></ol> 4. Co-agroinfiltration Förfarande för Viral Ljuddämpning Suppressor <ol><li> Mix de Milli-Q-vatten-utspädda Agrobacterium GV3101 kulturer bär GFP-genen och den virala ljuddämpning suppressor p19 av Tomato buskig stunt virus (TBSV) på 1:01, 2:01, 3:01 och 4:01 nyckeltal. Infiltrera N. benthamiana växter som beskrivits ovan. </li><li> Infiltrera N. benthamiana växter med en blandning av två Milli-Q-vatten-utspädda Agrobacterium GV3101 kulturer: den första bär pBID4-HAC1 plasmiden och den andra bär en av de tysta dämpare - P19 av TBSV eller p23 av Citrus tristeza virus, i pCassp plasmiden ( pCassp19) och i PGR binär plasmid under 35S-promotorn (PGR-P23), respektive, i förhållandet 04:01. </li></ol> 5. Western blot-analys <ol><li> Samla slumpbladprover från N. benthamiana, N. excelsior eller N. excelsiana växter på 4-7 dpi och pulverisera i flytande kväve till ett fint pulver. </li><li> Lägg tre volymer 1x PBS-buffert innehållande 0,5% TritonX-100 till varje prov. </li><li> Skaka försiktigt de extraherade proverna under 15 minuter vid 4 ° C. </li><li> Centrifugera extraktet i 5 min och samla totalt lösligt protein till ett rent Eppendorf-rör. </li><li> Späd extrakten till en lämplig utspädning (1:50 1:100) i 1 x PBS extraktionsbuffert, och tillsätt 5 x provbuffert (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% bromfenolblått, 50% glycerol v / v, och 500 mM DTT) till en slutlig 1 × koncentration. </li><li> Koka proverna i 5 minuter. </li><li> Separata proteiner genom 10% SDS-PAGE, överföring till Immobilon-P-överföringsmembran, och blocket med 0,5% I-block. </li><li> Detect GFP med användning av kanin polyklonalt anti-GFP-antiserum vid 1:5000 och HAC1 användning av mus anti-poly-histidin-monoklonal antikropp vid 1:1000 i blockeringslösning under 1 timme. </li><li> Efter märkning primära antikroppen, tvätta membranen tre gånger under 10 min vardera med 1 × PBST-20 och inkuberas med en pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad anti-kanin-antikropp vid 1:5000 eller HRP-konjugatd-anti-mus-antikropp vid 1:10.000 under 1 h, för GFP och HAC1 detektion, respektive. </li><li> Process Western blotting med hjälp av Supersignal West Pico Chemiluminescent substrat. </li><li> Använd GeneTools Programvara för att analysera bandintensitet av proteinet och ingen band kalibrerad mängd. </li></ol> Proteinproduktion: (kalibrerad mängd x utspädning av provet) / mängd prov laddad) x 4 = mg / kg. Ekvation: Proteinproduktion (P), kalibrerad mängd (C), spädning av provet (D) och mängden prov laddades (S). 6. Zymogram analys <ol><li> Samla pBID4-LicKM-infiltrerat N. benthamiana random vävnadsprover. </li><li> Extrahera proteiner med användning av samma metoder som beskrivits ovan för Western blot-analys och sedan analysera genom 10% SDS-PAGE med 0,1% lichenan ingår i gelerna. </li><li> Efter elektrofores tvättas gelén två gånger under 10 minuter vardera i tvättbuffert (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] och 0,1% Triton X-100) Och därefter inkubera i tvättbuffert vid 65 ° C under 1 timme. </li><li> Efter inkubation, kassera tvättbuffert och färga gelerna med 0,5% kongorött under 5 min vid rumstemperatur. </li><li> Skölj geler i Milli-Q-vatten tre gånger under 10 minuter vardera, och tillsätt 1 M NaCl för att visualisera likenas aktivitet. Den renade bakteriella likenas proteinet användes som en positiv kontroll för enzymaktivitet. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Utför visuell upptäckt av GFP fluorescens i hela transient transformerade växter med hjälp av en handhållen långvågig UV-lampa. </li><li> Fotografera transient omvandlas anläggningar med en digitalkamera med en gul 8, ES 52 filter (exponeringstid, 15 sek). </li><li> Få bilder från Western blot analyser använder GeneSnap programvaran på en GeneGnome och kvantifiera resultaten med hjälp av GeneTools programvara, med en kalibreringskurva baserad på renat GFP standard. </li><li> Kvantifiera HAC1 protein med användning av en kalibreringskurva baserad på reninged HAC proteinstandard från A/Indonesia/05/05 stam av influensavirus. </li><li> Beräkna medelvärden 3-4 replikat för alla experiment. </li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

I denna studie har vi utvecklat en enkel agroinfiltration protokoll för rutin transient proteinproduktionen i vissa Nicotiana art med användande av Agrobacterium-stammar som bär lanseringen vektor. Dessutom har vi identifierat de optimala förutsättningar för att uppnå högsta rekombinanta proteinproduktionsnivån i vår övergående växtexpressionssystem. Vakuum infiltration av den utspädda A. tumefaciens stam GV3101 hyser lanseringen vektor pBID4 i N. benthamiana, N. excelsiana och N. excelsior resulterade i högre nivåer av mål-proteinproduktion inom 7 dpi jämfört med andra växtarter, såsom Pisum sativum infiltreras med GV3101 hysande alfalfamosaikvirus - eller gurkmosaikvirus baserade vektorer som uttrycker GFP-reportergenen under 35S-promotorn 41 eller Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum och Arabidopsis thaliana infiltreras med C58C1 stam av A. tumefaciens som bär beta-glukuronidas reporter gen 57. N. benthamiana och N. excelsiana var lätta att dammsuga infiltrera på 50 mbar för 30-60 sek, med 90-95% infiltration effektivitet. De återstående 5-10% av bladytan var inte infiltreras på grund av någon flyt av blad på ytan av det Agrobacterium-suspension under applicering av vakuum. Sedan lanseringen vektorn har förmåga för cell-till-cellrörelse 18, uppstår övergående protein ackumulering i hela blad samt bladskaft vid 7 dpi. Vid 10 dpi, den beräknade GFP produktionen var något lägre på grund av att pBID4 expressionsvektor kan röra sig från cell till cell, men inte röra system 18; Därför behöver nya odlade blad innehåller inte vektorn och inte bidrar till produktionen av målet. Dessutom nedbrytning av det rekombinanta proteinet med tiden may bidra till minskad proteinnivå på 10 dpi. Våra resultat visade att infiltrering av A. tumefaciens-stammen GV3101 förmedlade höga nivåer av övergående proteinproduktion i N. benthamiana. Vidare kan målproteinet vara konstruerad som N-terminala, C-terminala eller interna fusioner till likenas (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanas, som är ett värmestabilt enzym från Clostridium thermocellum och ger värmestabilitet till många mål proteinfusion 18. Infiltration av N. benthamiana med A. tumefaciens vildtyp stammar (AT6, AT10 och at77) hyser genen av intresse framkallade milda eller allvarliga symtom: blad curling, bladskaft töjning, och curling. Inga patologiska symptom observerades i N. benthamiana infiltrerade med laboratoriestammen GV3101 hyser tom pBID4 vektor, medan vissa gener in i pBID4 och omvandlas till laboratoriestammar GV3101, C58C1 eller LBA4404 framkallade milda nekrotiska svar och lövkloros / gulnande symptom i infiltrerade regioner av löv. Nekrotiska symptom orsakade av vildtyp Agrobacterium eller avväpnade stammar i Solanaceae växter har tidigare 56,57 rapporterats. Den nekrotiska svar skulle kunna resultera från virulensfaktorer från typ III-sekretionssystemet, bakteriella proteiner som överförs till växtcellen genom typ IV sekretionssystemet, och / eller känslighet för flagellin 58-60. Vi har funnit att övergående produktion av heterologa proteiner också kan framkalla patogenicitet och en överkänslig reaktion på infiltrerade blad. Många forskare rapporterade att agroinfiltration av olika växtarter med växt binära vektorer produceras upp till 5-20 gånger högre nivåer av övergående proteinproduktion jämfört med stabilt transformerade växter 28,57. Våra data visar att N. benthamiana infiltrerade med GV3101 hysande pBID4-GFP uttrycktes transient höga nivåer av GFP, vilket liknar GFP utbyte rapporteras förN. benthamiana infiltrerade med Agrobacteria bär Pich-GFPSYS virusvektor (upp till 80% av den totala lösligt protein) 44. Agroinfiltration använda vår lansering vektorn gav hög produktion av det termostabila proteinet LicKM, 50-faldigt högre än den som observerades med användning av en vanlig binär plasmid 18. För att testa smittsamhet av A. tumefaciens och stabiliteten i lanseringen vektor, infiltrerade vi en platta av N. benthamiana varje timme i upp till 8 h med användning av samma Milli-Q-vatten-utspädda kultur av GV3101 härbärgerar den pBID4-GFP plasmid. Våra data visade att GV3101 stammen effektivt smitt i minst 8 timmar och pBID4 (lanseringen vektor) är mycket stabil under 8 timmar långa infiltration. Glycerol lager av GV3101 stam härbärge lanseringen vektorn pBID4-HAC1 (cellbank) förvaras vid -80 ° C har visat sig vara mycket stabil i tre år utan förändringar i övergående protei produktion i infiltrerade växter. N. benthamiana växter som odlas under optimala förhållanden och mellan 35 och 42 dagar efter sådd var optimala för vakuuminfiltrering-medierad transient genuttryck 40. Yngre växter (3-4 veckor) kan inte infiltreras i sin helhet på grund av löv som flyter på cellsuspensionsytan och vävnadsskada från de mekaniska effekterna av att tillämpa ett vakuum. I anläggningar som är äldre än 45 dagar, N. benthamiana bultning skede under optimala ljusförhållanden som används, är den nivå av övergående uttryck låg. Lågmolekylära fenolföreningar (acetosyringone) och monosaccharaides (glukos) är kända för att inducera vir-gener i A. tumefaciens 55,61. Dessutom infiltration av N. benthamiana med den binära vektorn pCAMBIA (GFP) i närvaro av acetosyringon vid koncentrationer av 50-600 | iM visade sig öka något övergåendegenuttryck 40. Vi studerade effekten av olika koncentrationer av acetosyringon och glukos i vårt system genom att lägga till dessa föreningar till GV3101 kulturer hyser pBID4-GFP i MMA i 3 timmar, och fann ingen skillnad i GFP uttryck. Intressant GV3101 kulturer hyser pBID4-GFP och efter utspädning i Milli-Q-vatten till en A 600 på 0,5 och infiltrerade utan vir geninduktion uttryckte samma mängder av GFP som de infiltrerade med inducerade kulturer. Den A. tumefaciens vir-genen (s) skulle kunna induceras av växtfenolföreningar (acetosyringone och sinapinsyra) och växt monosaccharaides (glukos och fruktos) som finns i bladvävnad. Därför kan vi spekulera i att liknande nivåer av GFP-uttryck i närvaro eller frånvaro av exogena vir-genprodukter inducerare kan vara ett resultat av verkan av cytoplasmatiska vir-genprodukter inducerare närvarande under replikation av GFP-uttryckande lanseringen vektorn i växtceller. N. benthamiana har använts som en modell värd för transient proteinproduktion 49. Men N. benthamiana s relativt låga avkastning biomassa hindrar sin ansökan om storskalig produktion av rekombinanta proteiner. Den optimala värden bör kombinera en hög nivå av övergående uttryck, lätt tillväxt i ett växthus, och vara mottagliga för Agrobacterium infiltration 2. För att välja en alternativ värd, vi infiltrerade två olika vildtyp arter av Nicotiana (N. benthamiana och N. excelsior) och en hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) med A. tumefaciens stam GV3101 härbärgerar pBID4-GFP plasmid. Bland dessa tre arter, nivån av GFP uttryck var något högre i N. benthamiana. N. excelsior växter visade svårighet vakuum agroinfiltration grund av sina läderartade blad, och N. excelsianaproduceras cirka två gånger mer biomassa på samma villkor tillväxt. Den övergående produktionen av GFP vid 7 dpi är relativt lika i N. benthamiana och N. excelsiana. Därför, N. excelsiana kan vara en mer lämplig värd för rekombinant proteinproduktion. Agrobacterium-medierad transient proteinproduktion är begränsad av PTGS 26, som kan övervinnas genom samexpression av geners suppressorer av växtvirus ursprung 62. Transient proteinproduktion har tidigare visats att ökas 50-faldigt i närvaro av p19-protein av TBSV, som hämmar PTGS i infiltrerade vävnader 34. I vår studie, bedömde vi effekten av två virustyst dämpning (P19 och P23) separat co-infiltrerade med lanseringen vektorn pBID4-HAC1. Samtidig infiltration av dessa tysta dämpare verkade ha lite inflytande på gående uttryck av HAC1, med endast en liten ökning i HAC1proteinackumulering (15-25%) i närvaro av co-infiltrerade p23 eller p19. För att positivt påverka proteinproduktion, kan tysta dämpare måste vara särskilt utvalda för att vara effektivt för de berörda växtarter och virusvektor 63. TMV helikas har en suppressor av RNA som tystar aktivitet 64,65. Våra data bekräftar denna observation som co-infiltration av p23 eller p19 med pBID4-HAC1 gav ingen ökning av GFP eller en liten ökning av övergående HAC1 proteinproduktion. Sammanfattningsvis har vi modifierat och optimerad anläggning och Agrobacterium tillväxtförhållanden och effektiviserat vakuum infiltration. Denna teknik det möjligt för oss att växa och infiltrera hundratals kilo växtmaterial inom några timmar. Vi framgångsrikt automatiserat anläggningen gående uttryck teknik för hög genomströmning vaccinproduktionen vid industriella skalor enligt nuvarande Good Manufacturing Practices (cGMP) villkor. För mer information aboUT automation och användning av anläggningen övergående proteinproduktionssystem för produktion av rekombinanta proteiner, inklusive subenhet vaccinkandidater, under cGMP förhållanden, är läsarna hänvisas till webbplatsen <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Växter är nu erkänd som en säker, pålitlig, skalbar och billig plattform för att producera heterologa rekombinanta proteinläkemedel och industri proteiner 1-3 och har viktiga fördelar jämfört med mikrobiella och animaliska cellexpressionssystem 4. Växter kan uttrycka korrekt veckade proteiner med post-translationella modifieringar, inklusive sammansatta multimera antikroppar 5-7. Flera vegetabiliska rekombinanta farmaceutiska proteiner genomgår klinisk utvärdering 8. Dessa inkluderar patientspecifika rekombinanta idiotypa vacciner (scFv) för behandling av non-Hodgkins lymfom 9, hemagglutinin baserad pandemi och vaccin mot säsongsinfluensa kandidater 10,11 (Cummings et al., In till vaccin), anti-Streptococcus ytantigen I / II-antikropp för behandling av tandkaries 12 och humant insulin för behandling av diabetes 13. Vidare humant recombinant glukocerebrosidas för enzymersättningsterapi hos patienter med Gauchers sjukdom har godkänts i Israel och USA och finns under Expanded Access Program utanför USA 14,15. Heterologa proteiner kan produceras i stabilt transformerade (transgen eller transplastomic) eller transient transformerade växter. Transient proteinproduktion erbjuder flera fördelar jämfört med produktion i transgena växter, inklusive kort tidsram för att uppnå uttryck och ackumulering 16, och kan uppnås genom att införa bakteriella binära vektorer eller rekombinanta växt virala vektorer i växtvävnader 4. Den mest avancerade övergående expressionssystem är baserat på användningen av &quot;uppskjutnings vektorer &#39;som kombinerar komponenterna av växtvirus och binära plasmider, och levereras av agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration av en lanserings vektor baserad på tobaksmosaikvirus (TMV) har med framgång tillämpats på labskala för att framställa vaccinantigener mot patogener som humant papillomvirus 19, Yersinia pestis 20, influensavirus A 21,22, Bacillus anthracis 23, och smittkoppsvirus 24 i N. benthamiana leaves. Agrobacterium-medierad transient expression är också en lovande metod för samtidig produktion av flera proteiner 2,25-27. Till exempel har växt övergående expressionssystem använts för att producera tumörspecifika rekombinanta antikroppar 28,29, ett glykosylerat rekombinant antikropp mot epidermal tillväxtfaktorreceptor 30, och en monoklonal antikropp specifik för mjältbrand skyddande antigen 31,32. Co-infiltration av Nicotiana benthamiana växter med en målgen och en suppressor av genen som tystar ger förbättrad målprotein uttryck 33,34. Agroinfiltration är en vanlig metod för att likformigt introsiering bakterier som hyser en gen av intresse i växtvävnader 35-37. Vakuum infiltration av Agrobacterium för transient genuttryck i intakta växtblad är en snabb, skalbar och användbar metod för produktion av främmande proteiner utan behov att alstra transgena växter 38-41. Under vakuum agroinfiltration, är växter vänt upp och ned och antenn delar nedsänkta i Agrobacterium upphängning. Då vakuum appliceras orsakar gaser att evakuera från bladintercellulära utrymmen genom klyvöppningar. Snabb återtrycksättning efter utsläpp av vakuumresulterar i infusion av Agrobacterium-suspension in i bladet. Efter vakuum infiltration av Agrobacteria, är växter ytterligare odlas och mål uttryck övervakas. De högsta nivåerna av mål-uttrycket är vanligtvis observeras 2-3 dagar efter infiltration (dpi) med en binär vektor och 4-7 dpi med en lansering vektor, varefter uttrycket nivån vanligtvis decreaSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens är den mest använda fordon för att leverera en gen av intresse i en växt för proteinproduktion. Agroinfiltration fungerar utomordentligt bra i N. benthamiana men relativt dåligt i de flesta andra växter, inklusive Arabidopsis thaliana 46. I denna studie har vi utvecklat en enkel, effektiv och ekonomisk metod för transient proteinproduktion i 5-6 veckor gamla N. benthamiana använder A. tumefaciens infiltration. Den största nackdelen med industriell skalning av agroinfiltration tekniken är centrifugering av skördade bakterier och återsuspension av den bakteriella pelleten i medium innehållande 4&#39;-hydroxi-3 &#39;, 5&#39;-dimetoxiacetofenon (acetosyringon), monosackarider, och 2 - (N-morfolino) -etansulfonsyra (MES) buffert för induktion av vir-gener. Vi har kunnat lösa dessa problem genom att optimera Agrobacterium </em&gt; tillväxt i AB-medium (minimalt medium), följt av direkt utspädning i Milli-Q-vatten och genom styrning av infiltrationen varaktighet och förhållanden. Vi har också jämfört målprotein produktionen i vildtyp tobak värdarter N. benthamiana och N. excelsior, samt i hybrid N. excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Agrobacterium-medierad transient proteinproduktion i växter är en lovande metod för att framställa vaccin-antigener och terapeutiska proteiner inom en kort tidsperiod. Dock är denna teknik bara börjat tillämpas på storskalig produktion så många tekniska hinder för att skala upp är nu övervinnas. Här visar vi en enkel och reproducerbar metod för industriell skala transient proteinproduktion baserad på vakuum infiltration av Nicotiana växter med Agrobacteria bär lanserings vektorer. Optimering av Agrobacterium-odlingen i AB-medium möjliggör direkt utspädning av bakteriekulturen i Milli-Q-vatten, vilket förenklar infiltrationsprocessen. Bland tre testade arter av Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) valdes som den mest lovande värd på grund av den lätthet med infiltration, hög reporter proteinproduktion, och cirka två-fgamla högre biomassaproduktion under kontrollerade miljöförhållanden. Induktion av Agrobacterium hysande pBID4-GFP (tobaksmosaikvirus-baserade) med användning av kemikalier såsom acetosyringon och monosackarid hade ingen effekt på proteinets produktionsnivå. Infiltrera växt i 50 till 100 mbar till 30 eller 60 sekunder resulterade i cirka 95% infiltration av växtbladvävnad. Infiltration med Agrobacterium laboratoriestammen GV3101 visade den högsta proteinproduktionen jämfört med Agrobacteria laboratoriestammar LBA4404 och C58C1 och vildtyp Agrobacteria stammar AT6, AT10, at77 och A4. Co-uttryck av en virus-RNA som tystar suppressor, p23 eller p19, i N. benthamiana ledde tidigare ackumulation och ökad produktion (15-25%) av målprotein (influensavirushemagglutinin).

Watch this Scientific Journal Video about Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana at JoVE.com

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient proteinproduktion i Nicotiana anläggningar baserade på vakuum infiltration med Agrobacteria bär lanserings vektorer (tobak viruset baserat) är en snabb och ekonomisk metod för att framställa vaccinantigener och terapeutiska proteiner. Vi förenklat förfarandet och förbättrat mål anhopning genom att optimera betingelser bakterieodling, välja värdart, och co-införa RNA tysta suppressorer.

Optimering och Utnyttjande av<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Medierad Transient Protein Produktion i<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Produktion av replikationskompetenta Defekta Retrovirus av övergående transfektion av 293T celler

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

En metod för produktion av rekombinanta mCD1d Protein i insektsceller.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-inducerad geners uttryck (VIGS) i Nicotiana benthamiana Och Tomat

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck test på Bomull

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrering och PVX-agroinfektion i Potatis och Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Luciferas komplettering Imaging test i Nicotiana benthamiana blad för övergående bestämma Protein-protein interaktioner Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Agrobacterium-Medierad omogen embryoomvandling av motsträviga majs inavlade linjer med morfogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...