Name: efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies
Uploaded: 2014-03-19T14:15:00
Duration: 13 min 52 s
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हम संस्कृति और Sf9 सेल के शेयरों के रखरखाव में तकनीकी सहायता के लिए Weixan लू धन्यवाद. लेटाओ एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) ग्रेजुएट छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया. RJCG एक रॉयल सोसाइटी यूनिवर्सिटी रिसर्च फैलो था. स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के ऑक्सफोर्ड डिवीजन ह्यूमन जेनेटिक्स, वेलकम ट्रस्ट कोर पुरस्कार अनुदान संख्या 090532/Z/09/Z लिए वेलकम ट्रस्ट सेंटर का हिस्सा है.

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	<li>Moser, M., Legate, K. 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W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindlin-3-mediated+signaling+from+multiple+integrin+classes+is+required+for+osteoclast-mediated+bone+resorption.">Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption.</a> J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).</li><li>Malinin, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+in+KINDLIN3+ablates+activation+of+three+integrin+subfamilies+in+humans.">A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans.</a> Nat. 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Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li><li>Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+baculovirus+recombination.">Improving baculovirus recombination.</a> Nucleic Acids Res. 31, (2003).</li><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ligation-independent+cloning+method+suitable+for+high-throughput+expression+screening+applications.">A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications.</a> Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Baculovirus अभिव्यक्ति सिस्टम तेजी से लोकप्रिय और एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी सहित biophysical पढ़ाई, का उपयोग प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होते जा रहे हैं. अधिक प्रयोगात्मक की मांग होने के बावजूद baculovirus अभिव्यक्ति प्रणालियों ई. पर कई फायदे की पेशकश कोली जिनमें से एक उपयुक्त संरक्षक और बाद translational संशोधन के लिए अवसर की उपस्थिति जैसे यूकेरियोटिक मूल के प्रोटीन के लिए एक के पास देशी माहौल है. Kindlin -3 व्यक्त करने के अपने प्रयासों में, वैकल्पिक अभिव्यक्ति मेजबान स्तनधारी सेल लाइनों और बैक्टीरियल अभिव्यक्ति उपभेदों (अप्रकाशित टिप्पणियों) सहित इस्तेमाल किया गया. आम तौर पर, कई ई. कोली परीक्षण किया उपभेदों पुनः संयोजक kindlin -3 की बहुत कम मात्रा (; अप्रकाशित टिप्पणियों ~ 0.5 मिलीग्राम / संस्कृति के एल) का उत्पादन किया. हालांकि, कीट कोशिकाओं में baculovirus संचालित अभिव्यक्ति सह में, विशेष रूप से प्रभावी था औरपुनः संयोजक cytoplasmic प्रोटीन (अप्रकाशित टिप्पणियों) के एक मिलीग्राम के लिए अलग आवश्यक बड़े बायोमास पैदा करने के लिए उत्तरदायी स्तनधारी कोशिकाओं में क्षणिक अभिव्यक्ति को mparison. हम उपस्थिति यूकेरियोटिक संरक्षिकाओं kindlin -3 के कुशल उत्पादन की अनुमति दे सकता है अटकलें हैं कि. baculoviridae कीट कोशिकाओं को संक्रमित और पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस काम में इस्तेमाल baculovirus परमाणु polyhedrosis वायरस (AcNPV) californica Autographa पर आधारित है. प्रकृति में Autographa californica (अल्फला LOPPER) कीट लार्वा को संक्रमित करता है जो AcNPV, virons इस प्रकार उनकी रिहाई के लिए आवश्यक सुरक्षा प्रदान करने के लिए एक क्रिस्टलीय प्रोटीन मैट्रिक्स में समाहित हैं जिससे occlusions के लिए फार्म polyhedrin प्रोटीन की आवश्यकता होती है. सभ्य कोशिकाओं में रोड़ा निकायों के गठन प्रतिकृति के लिए आवश्यक है और इसलिए नगण्य है नहीं है. विदेशी प्रोटीन व्यक्त करने के मामले में polyhedrin प्रोटीन जीन R किया जा सकता हैब्याज की प्रोटीन के लिए जीन के साथ एक पुनः संयोजक AcNPV में eplaced. AcNPV अन्य Lepidopteron प्रजातियों को संक्रमित कर सकते हैं और पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति सेना कीड़ा स्पोडोप्टेरा frugiperda के प्रयोजनों के लिए पोटा संबंधी अंडाशय कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं. यह है, कि इस तरह की: एक आवश्यक वायरल जीन, ORF1629, (को 1629 BAC10) एक दस्तक बाहर bacmid में जिसके परिणामस्वरूप chloramphenicol एसिटाइल ट्रांस्फ़्रेज़ की प्रविष्टि से निष्क्रिय है इतना है कि यहाँ उल्लिखित दृष्टिकोण में, AcNPV bacmid (BAC10) इंजीनियर है संक्रामक baculovirions 28 फार्म करने में असमर्थ. KO 1629 और FERMT3 युक्त स्थानांतरण वेक्टर मरम्मत भी polyhedrin प्रमोटर 28 के नियंत्रण में FERMT3 जीन शामिल किया गया है कि एक व्यवहार्य जीनोम में जिसके परिणामस्वरूप स्थानांतरण के माध्यम से निष्क्रिय ORF1629,,: linearized BAC10 साथ Sf9 कोशिकाओं की Cotransfection. हम एक thre के माध्यम से kindlin -3 अत्यधिक शुद्ध पुनः संयोजक माउस के अलगाव के लिए एक शुद्धि प्रोटोकॉल का वर्णनई कदम chromatographic दृष्टिकोण. यहां इस्तेमाल किया तरीकों को आसानी से अन्य उनकी टैग प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है. हम आगे kindlin -3 शुद्ध करने के लिए एक आयन एक्सचेंज कदम कार्यरत लेकिन हम kindlin -3 अपनी एफ 1 डोमेन के भीतर एक पाली lysine खिंचाव सहित बुनियादी अवशेषों की एक बड़ी संख्या है, पास के रूप में यह एक आगे छद्म आत्मीयता कदम है कि विश्वास करते हैं. इसके अतिरिक्त, kindlin-3 के लिए बाध्य है और यह काम करता है, जहां प्लाज्मा झिल्ली, के cytoplasmic चेहरे के साथ बातचीत करने के लिए माना जाता है, और इसलिए हम बुनियादी अवशेषों की क्लस्टरिंग प्रोटीन नकारात्मक आरोप लगाया झिल्ली का मुकाबला करने की अनुमति देगा का अनुमान है. शुद्धि प्रोटोकॉल में वर्णित बफ़र्स मानक माना जाता है और अक्सर संरचनात्मक जीव विज्ञान में किया जाता है. thermofluor परख (चित्रा 5) kindlin -3 पीएच 6.0 से ऊपर सबसे बफर की स्थिति में स्थिर है कि यह दर्शाता है. Β1: kinldin -3 का अध्ययन करते हैं तो यह हमारे प्रयोगों सूचित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी और महत्वपूर्ण थाNaCl 12 की कम मात्रा के साथ पीएच 6.1 पर उत्कृष्ट स्पेक्ट्रा सामने आए जो एनएमआर, द्वारा एक पूंछ बातचीत. किसी भी biophysical अध्ययन किए जाने से पहले, यह ब्याज की शुद्ध प्रोटीन वास्तव में सही ढंग से मुड़ा और कार्यात्मक रूप से सक्रिय है दिखाना है कि महत्वपूर्ण है. पिछले एक प्रकाशन में हम पुनः संयोजक kindlin -3 व्यक्त की है और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, गतिशील प्रकाश बिखरने, विश्लेषणात्मक ultracentrifugation और छोटे कोण एक्स - रे बिखरने द्वारा मूल्यांकन के रूप में शुद्ध के लिए इस विधि का उपयोग कर, समाधान में एक monomer और monodispersed था कि प्रदर्शन किया, और था भी यह पिछले सेलुलर और शारीरिक पढ़ाई 14,20,22 के साथ कतार में है, जो देशी प्रोटीन, की तरह बर्ताव करता है कि इस बात की पुष्टि इस प्रकार, बंधन और झिल्ली बाहर का NPxY और β 1 ए cytoplasmic पूंछ 14 के अपस्ट्रीम सेरीन / Threonine क्लस्टर पहचानने में सक्षम. एक थर्मल स्थिरता परख का उपयोग वें सुझाव का एक अतिरिक्त तरीका हैब्याज की एक प्रोटीन की ई उचित तह, के रूप में गलत तरीके से मुड़ा हुआ प्रोटीन की वजह से उजागर हाइड्रोफोबिक अवशेषों को एक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि में परिणाम होगा. प्रोटीन की kindlin परिवार विवो में integrins की आवश्यक coactivators के रूप में उनकी अप्रत्याशित भूमिका की खोज की थी के बाद से बहुत अधिक ध्यान का ध्यान केंद्रित किया गया है. इस recombinantly उन्हें व्यक्त करने और उनके ढांचे को हल करने के लिए ज्यादा प्रयास शुरू हो गया है. तिथि करने के लिए सीमित सफलता पूर्ण लंबाई पुनः संयोजक प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा को व्यक्त करने में सूचना दी गई है, लेकिन हम यहाँ संरचनात्मक अध्ययन संभव हो जहां के स्तर पर बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति है कि परमिट एक baculovirus प्रणाली के उपयोग का वर्णन किया है. पुनः संयोजक kindlin -3 की बड़ी मात्रा में पैदा करके हम इस इस प्रोटीन की आगे की पढ़ाई के लिए सहायता करेंगे. पुनः संयोजक murine kindlin-3 के लिए यहाँ वर्णित baculovirus संचालित विधि और शुद्धि कार्यप्रवाह भी अन्य kindlin isoforms एक्सप्रेस और शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो भी व्यक्त और भी पाली lysine हिस्सों के अधिकारी मुश्किल हो जाता है, और आगे इस तरह के जीवाणु उपभेदों में व्यक्त करने में विफल है कि न्यूक्लिक एसिड बंधनकारी प्रोटीन के रूप में अन्य cytoplasmic प्रोटीन, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Kindlin परिवार के प्रोटीन एक महत्वपूर्ण फोकल आसंजन विधानसभा के घटक, और जटिल जीवन के लिए इसलिए जरूरी हैं. 3 स्तनधारियों में isoforms (kindlin -1, kindlin-2, और kindlin -3) कर रहे हैं जिनमें से Kindlins, Talin 1 के साथ कोशिकी रिसेप्टर्स integrins की coactivators माना जाता है. Integrin की मध्यस्थता सेल आसंजन उच्च eukaryotes में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) को कोशिका की सतह से जोड़ता है. यह ऊतक अखंडता, embryogenesis, हड्डी चयापचय, रक्तस्तम्भन, और प्रतिरक्षा में शामिल हैं जो शारीरिक घटना के ढेर में एक महत्वपूर्ण और सामान्य प्रक्रिया है. Integrin की मध्यस्थता सेल आसंजन उनके संरक्षित NPxY रूपांकनों पर integrin β सबयूनिट cytoplasmic पूंछ (सीटीएस) को Talin और kindlin के बंधन के माध्यम से अंदर बाहर संकेत पारगमन के माध्यम से सक्रिय है. kindlin प्रोटीन की जैव चिकित्सा महत्व के रूप में दूर kindlin -2 प्रतिलेखन में शामिल होने के लिए हाल ही में कई रिपोर्टों में दिखाया गया है जहां नाभिक, हालांकि फैलीअल 2,3 नियंत्रित करते हैं. Kindlins अपने F2 उपडोमेन के केंद्र में एक pleckstrin अनुरूपता (पीएच) डोमेन से बाधित है, जो एक द्विपक्षीय सी टर्मिनल FERM (4.1 बैंड, एजरिन, radixin, moesin) डोमेन, के कब्जे से हॉलमार्क लगभग 75 केडीए की multidomain प्रोटीन, कर रहे हैं 4,5. Kindlin -2 और kindlin -3 पीएच डोमेन के अध्ययनों से यह लिपिड दूसरा दूत phosphatidylinositol-(3,4,5) trisphosphate और phosphatidylinositol-(4,5) बाइफोस्फेट 6-8 कि बांध दिखाया. हालांकि, kindlin -1 पीएच डोमेन की पढ़ाई यह बंधन से लिपिड को रोकने के लिए एक isoform विशेष नमक पुल से kindlin -1 में समझाया जा सकता है, जो एक बहुत कम समानता, साथ PtdIns (3,4,5) पी 3 के लिए बांध बताते हैं कि 9. इसके अलावा, सामने आया होने की भविष्यवाणी की है, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली 10,11 की आंतरिक पत्रक में phosphatidylserine को बांधता है कि kindlins की F1 डोमेन में डाला एक ~ 100 अमीनो एसिड पाश है. kindlin FERMTalin FERM डोमेन एक pleckstrin अनुरूपता डोमेन के अधिकारी नहीं है, हालांकि डोमेन, Talin FERM डोमेन के लिए मुताबिक़ माना जाता है. दोनों kindlins और Talin उनके FERM डोमेन की F3 क्षेत्र के माध्यम से integrin β-पूंछ पर NPxY रूपांकनों के साथ बातचीत, लेकिन Talin झिल्ली समीपस्थ एक 12-16 लक्षित करता है, जबकि kindlin, झिल्ली बाहर का मूल भाव को बांधता है. इसके अलावा दोनों Kindlins और Talin अन्य FERM प्रोटीन 11,17 में नहीं पाया जाता है कि एक ubiquitin की तरह गुना के साथ एक एन टर्मिनल F0 डोमेन के अधिकारी. Kindlin-2 के F0 डोमेन पर अध्ययन यह स्वतंत्र रूप से phosphatidylinositol-(4,5) बाइफोस्फेट समृद्ध झिल्ली से 17 कि बांध से पता चला है. kindlins paralogue विशिष्ट ऊतक अभिव्यक्ति पैटर्न और nonredundant शारीरिक कार्यों दिखा रहे हैं. Kindlin -1 मुख्य रूप से एपिडर्मिस में व्यक्त किया है, लेकिन यह भी एक हद तक कम करने के लिए पेट, पेट, और गुर्दे, kindlin -2 सर्वत्र व्यक्त किया है, लेकिन में केंद्रित है धारीदार और चिकनीमांसपेशी और भ्रूण के विकास 4 में व्यक्त केवल kindlin है, और kindlin -3 megakaryocytes 18 में पाया kindlin -3 के सर्वोच्च एकाग्रता के साथ hematopoietic ऊतकों में व्यक्त किया है. हालांकि, हाल ही के अध्ययन कार्यात्मक प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से 19 endothelial ऊतकों में व्यक्त किया है कि सुझाव दिया है. Kindlin -3 की वजह से खून में इसकी महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका को तीव्र चिकित्सा ब्याज की है. यह प्लेटलेट एकत्रीकरण और संक्रमण और सूजन 21,22 और अस्थि अवशोषण 23 में अस्थिशोषक podocyte गठन के जवाब में thrombus गठन 20, ल्युकोसैट रोलिंग के दौरान प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है. जीवन के लिए खतरा खून बह रहा विकारों और आवर्तक बैक्टीरियल संक्रमण 20,24,25 की विशेषता बीमारी - इसके अलावा, kindlin-3 मानव में की कमी आसंजन कमी प्रकार-III ल्युकोसैट की ओर जाता है. चूहों में Kindlin -3 नाक आउट पढ़ाई में प्रोटीन की महत्वपूर्ण समारोह का पता चलासेल आसंजन KIND3 -. / - चूहों kindlin -3 की कमी से मानव में लक्षण दिखने की वजह से निष्क्रिय प्लेटलेट integrins, गंभीर osteopetrosis, और बिगड़ा ल्युकोसैट आसंजन 20,22 करने के लिए इस तरह के गंभीर रक्तस्राव के रूप में अलग phenotypes, प्रदर्शित करते हैं. Kindlins पर उच्च संकल्प संरचनात्मक डेटा, आज तक, इस तरह के pleckstrin अनुरूपता kindlin-1 9 और kindlin -2 26,27 के (पीएच) डोमेन और kindlin -1 11 और kindlin की F0 डोमेन के रूप में व्यक्तिगत उप डोमेन के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है -2 17. प्रत्येक kindlin पॉलीपेप्टाइड के उप डोमेन से ज्यादातर लेकिन क्लोनिंग और संरचनात्मक विश्लेषण (येट्स और गिल्बर्ट, अप्रकाशित टिप्पणियों) का विरोध किया है, और पूर्ण लंबाई प्रोटीन की पढ़ाई ई. का उपयोग पर्याप्त मात्रा में व्यक्त और सफ़ाई की कठिनाई द्वारा बाधा कर दिया गया है कोली (अप्रकाशित टिप्पणियों और Harburger एट अल. 14). Kindlin -3 और इसके फू में काफी चिकित्सा रुचि हैnction, अन्य दो परिवार के सदस्यों के साथ, और हाल ही में हम baculovirus संक्रमण 12 से प्रेरित स्पोडोप्टेरा frugiperda कोशिकाओं में पुनः संयोजक अभिव्यक्ति द्वारा यह की मिलीग्राम मात्रा में उत्पन्न. इसलिए हम यहां व्यापक संरचनात्मक अध्ययन और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त कीट सेल संस्कृति में पुनः संयोजक माउस kindlin -3 की मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए विधियों का वर्णन. इस प्रोटोकॉल में हम एक इंजीनियर पीटकर bacmid (: 1629 BAC10 को) का उपयोग करना कि, अकेले, व्यवहार्य virions 28 उत्पादन करने में असमर्थ है. वायरल डीएनए इस तरह इस मामले में भी kindlin-3 जीन (FERMT3) और एक पुनः संयोजक में जिसके परिणामस्वरूप वायरस बेहद व्यक्त लेकिन बेमानी है जो बहुत देर जीन, जगह FERMT3 जीन में परिणाम भी शामिल है कि एक हस्तांतरण वेक्टर साथ पुनर्संयोजन द्वारा बचाया वायरस जीवन चक्र 28 के भाग के रूप में माउस kindlin -3 व्यक्त करता है कि वायरस. हम इस पहचानkindlin -3 के उत्पादन के लिए विधि अन्य अभिव्यक्ति सेनाओं में यह व्यक्त करते हैं और शुद्ध करने के प्रयास के कारण हमने क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया और कहा कि कई अभिव्यक्ति में तैनात कर सकते हैं जो POPIN वेक्टर सूट, की बहुमुखी प्रतिभा के लिए (अप्रकाशित टिप्पणियों) बेहद मुश्किल साबित हुआ लेकिन यह भी बाद 29 होस्ट करता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1147">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid</td>
			<td style="width:123px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td style="width:439px;">store at 4&#176;C and warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td style="width:123px;">InVitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Streptomycin Sulphate (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>S0148</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Penicillin G, potassium salt (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>P0580</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td>Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HisTrap FF (5ml)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-5286-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HiTrap Heparin (5ml)</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-0407-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td style="width:439px;">15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies

Kindlins कोशिका की सतह रिसेप्टर्स integrins की, Talin साथ, आवश्यक coactivators हैं और भी बाहर में संकेत integrin में भाग लेने, और सेल नाभिक में जीन प्रतिलेखन के नियंत्रण. kindlins ~ 75 केडीए multidomain प्रोटीन होते हैं और एक NPxY आकृति और integrin β सबयूनिट cytoplasmic पूंछ के अपस्ट्रीम टी / एस क्लस्टर के लिए बाध्य. hematopoietically महत्वपूर्ण kindlin isoform, kindlin -3, thrombus गठन के दौरान प्लेटलेट एकत्रीकरण के लिए महत्वपूर्ण है, संक्रमण और सूजन और अस्थि अवशोषण में अस्थिशोषक podocyte गठन के जवाब में रोलिंग ल्युकोसैट. इन प्रक्रियाओं में Kindlin -3 की भूमिका व्यापक सेलुलर और शारीरिक पढ़ाई में हुई है. हालांकि, आगे के अध्ययन के लिए प्रोटीन की उच्च गुणवत्ता मिलीग्राम मात्रा में प्राप्त करने का एक कारगर तरीका के लिए एक की जरूरत है. हम एक baculovirus डी के उपयोग द्वारा पुनः संयोजक murine kindlin -3 के कुशल अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए, यहाँ वर्णित, एक प्रोटोकॉल विकसित किया हैइसके biophysical लक्षण वर्णन अनुमति देने के लिए उच्च शुद्धता पूर्ण लंबाई प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में उपज Sf9 कोशिकाओं में अभिव्यक्ति प्रणाली विखंडित. एक ही दृष्टिकोण अन्य स्तनधारी kindlin isoforms के अध्ययन में लिया जा सकता है.

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Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

के कुशल उत्पादन और शोधन संयोजक Murine Kindlin -3 की biophysical अध्ययन के लिए कीट कोशिकाओं से

Kindlins integrins के माध्यम से कोशिका आसंजन के लिए मौलिक हैं, लेकिन उनमें से पढ़ाई बैक्टीरियल मेजबानों में recombinantly उन्हें व्यक्त करने में कठिनाई का सामना द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. हम यहाँ baculovirus संक्रमित कीट कोशिकाओं में उनके कुशल उत्पादन के लिए विधियों का वर्णन.

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

कीट कक्ष में पुनः संयोजक mCD1d प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक विधि.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria के खमीर कक्ष से शोधन

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

जीनोमिक डीएनए से 5-hydroxymethylcytosine के चुनिंदा कब्जा

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

पुनः संयोजक प्रोटीन का उच्च स्तर क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए पौधे के कुशल Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

से पेप्टाइड और प्रोटीन के साथ संयोजक Elastin तरह polypeptides और उनके fusions की गैर chromatographic शोधन<em&gt; कोलाई</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

बैक्टीरिया, कीट कोशिकाओं और संयंत्र सिस्टम: पुनः संयोजक प्रोटीन विभिन्न Biofactories में अभिव्यक्ति का एक तुलनात्मक विश्लेषण

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

3 डी उपगोल उत्पादन के लिए एक कुशल और लचीला सेल एकत्रीकरण विधि

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

क्षणिक अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं में

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Murine अस्थि मज्जा में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...