Name: efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies
Uploaded: 2014-03-19T14:15:00
Duration: 13 min 52 s
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私たちは、文化とSf9細胞株の維持にテクニカルサポートWeixan呂に感謝します。 LAYは、医学研究評議会（MRC）の大学院学生の身分によってサポートされていました。 RJCGは王立協会大学研究員だった。構造生物学のオックスフォード事業部は、人類遺伝学のためのウェルカムトラストセンター、 ウェルカムトラストコア賞認可番号090532/Z/09/Zの一部です。

IMジョーンズによって開発された1629年と：このプロトコルは、マウスkindlin-3遺伝子（FERMT3）が正常に非常に遅くp10プロモーターの下流とベクトルバクミドBAC10 KOとの組換えを可能にするために、バキュロウイルス隣接配列を有していることをベクターにクローニングされていることを前提としています同僚28。このプロトコルでは、kindlin-3遺伝子はpOPINE 29にクローニングし、使用したプライマーおよびクローニング戦略は、他の場所で12に説明されています。 FERMT3遺伝子 （kindlin-3）のp10バキュロウイルスプロモーターの制御下にあり、ベクターは、5 &#39;UTR/ORF603およびORF 1629を含み、下流の精製の ​​ために29 C-末端His 6 -タグをコードするようにプラスミドを設計される。 1。昆虫細胞培養とメンテナンス<ol><li>組換えバキュロウイルスの増幅の前に、懸濁培養に適応し、ヨトウガ細胞 （Sf9細胞）べきである成長させ、維持する。 昆虫細胞は、常に専用の組織培養ヒュームフード内の無菌技術を使用して処理する必要があります。 </li><li>昆虫細胞の懸濁培養物を100μg/ mlのペニシリンおよび100 rpmで振とうしながら27℃のフラスコで100μg/ mlのストレプトマイシンを補充したのSf-900 II（SFM）無血清液体培地中でインキュベートする。 </li><li>昆虫細胞培養密度範囲を維持6×10 1との間-分離及び新鮮なのSf-900 II培地で細胞培養物を希釈することにより細胞/ mlの1×10 7。 注：健康 細胞は大きさが均一になるはずですし、形状が球形である必要があります。 </li><li>培養の細胞密度を計算するために、血球計数器および光学顕微鏡を用いて試料体積中の細胞を数える。 </li></ol> 2。組換えバキュロウイルスの生成<ol><li> 100μg/ mlのpenicilliを補ったのSf-900 II培地を使用して懸濁液中でSf9細胞を培養し、維持Nおよび100μg/ mlのストレプトマイシン。 1×10 6細胞/ ml -バキュロウイルス生成のために、昆虫細胞を5×10 5の密度範囲に培養されるべきである。 </li><li>種子のSf-900 2mlの100μg/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充した培地中の滅菌II、6ウェル組織培養プレートのウェルあたり約1×10 6個のSf9細胞。プラスチックウェルの底に付着し、ドラフト内で室温でSf9細胞を残すため、単層を形成する。 </li><li>単層培養にバクミドDNAとプラスミドDNAをコトランスフェクトすることにより組換えバキュロウイルスの生成を行う。 <ol><li>抗生物質を含まないのSf-900 II SFM（A液）100μl中1629：各トランスフェクションのために、精製されたBAC10 KOの0.5μgの、ORF1629バキュロウイルス要素を持っている、精製pOPINE-mFERMT3、1〜2μgのを混ぜる。 </li><li>別のチューブでは、抗なしでのSf-900 II SFM100μlのセルフェクチンII試薬の6μLを希釈各トランスフェクション反応（溶液B）のための抗生。多くのトランスフェクションが必要な場合は「マスターミックス」は、減少した液体処理のために、ここで作成することができる。 </li><li>二つの溶液（A及びB、約200μl）を混合し、脂質-DNA複合体を形成するために室温で20分間インキュベートする。 </li><li>抗生物質を含まない800μLのSf-900 II SFMと脂質-DNA複合体を希釈します。慎重にさせたSf9細胞単層メディアを吸引し、慎重にしたSf9単層の上に溶液A / Bおよびメディアをピペット。 </li><li> 27°のCO / Nの加湿インキュベーター中でトランスフェクションされた細胞を培養すると、次の日に、各単層培養に抗生物質を含まないのSf-900 II SFMをさらに1ミリリットルを追加します。さらに5日間、27℃で細胞を培養する。 </li></ol></li><li>培養液（合計約2ミリリットル）から直接、組換えバキュロウイルスを収穫し、きれいな遠心管（例えば15ミリリットルファルコンチューブ）に移す。 <ol><li>任意のSf9細胞のDEBRを明確にRTで5分間、1,000×gでの遠心分離によってである。使用するまで暗所に4℃できれいなチューブおよび格納するために、得られた上清中にあるとP1で示さウイルスを、転送します。この段階で、残りのSf9単層は、昆虫細胞における組換えkindlin-3の存在を評価することにより、組換えウイルスの生成を評価するために使用することができる。 </li></ol></li><li> 0.5ミリリットルのPBSで単層を再懸濁し、2X SDS-PAGEローディング緩衝液の等容量の10μlのサンプルを希釈。少なくとも10分間、&gt; 95℃でサンプルを加熱する。 <ol><li>それは適切なゲルローディング用の粘性が高すぎる場合には、マイクロ超音波処理装置のチップを使用して、10％の振幅で1秒間のサンプルを超音波処理。 </li></ol></li></ol> 3。組換えバキュロウイルスの増幅<ol><li>懸濁液中のウイルスの増幅のために、1.4×10 6細胞/ mlの細胞密度を使用し、これは（ すなわち 、50ミリリットルの培養フラスコ中の総容積の1/20を占めるべき2 Lのフラスコ）。 </li><li>以下の式を用いて0.1の感染多重度（MOI）でのP1ウイルスストックで昆虫細胞培養物を感染させることにより、組換えウイルスの増幅を達成する; <img alt="" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" /> 注：P1ウイルスの生成は、1×10 7 pfu / mlでの予想されるウイルス力価を有すると仮定することができる。しかし、プラークアッセイの前に、この段階を行うことができる。 </li><li> 3日間（72時間）100rpmで振盪しながら27℃で、P1感染昆虫文化をインキュベートする。 </li><li> RTで5分間1,000×gでの遠心分離によって培地から細胞を分離することによって、ウイルスを収穫する。 SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによってkindlin-3タンパク質の発現を評価することによって組換えウイルス産生の確認のために、この段階で得られた細胞ペレットを保存します。 </li><li> 4℃の中できれいなチューブおよび格納するために明らかにしたウイルスに富んだメディアを転送使用するまで暗い。このウイルスストックは、P2と表記されている。 注：2×10 8 pfu / mlで（又は100 PFU /細胞の増幅率）のウイルス力価が期待できる。 </li></ol> 4。バキュロウイルス感染Sf9中kindlin-3の発現<ol><li>精製前のための大規模な組換えkindlin-3の発現に100μg/ mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充のSf-900 II SFM中で懸濁液中のSf9細胞培養の適切なボリュームを拡張。 100 rpmで振盪しながら、総培養体積で27℃で懸濁培養をインキュベート1:5の体積比フラスコ。 </li><li> 2×10 6細胞/ mlの密度で、Sf9細胞の懸濁培養物を感染させる。 </li><li>補足最終濃度1％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）を用いてSf9培養物を1のMOIを与えるために、増幅された組換えウイルス（P2ウイルスストック）とした。 100 rpmで振盪しながら27℃で感染培養をインキュベートする。 </li><li>収穫recombinaNT kindlin-3-CHIS 1,000×gでの遠心分離によりSf9細胞を72時間後に感染の6発現&#160;得られた細胞ペレットを使用するまで-20℃で保存し、または長期保存のために-80°C。 </li></ol> 5。組換えKindlin-3の精製<ol><li>氷上での組換えkindlin-3を発現して解凍凍結し、バキュロウイルス感染昆虫細胞（Sf9細胞）のペレット。 </li><li> EDTA不含プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびDNase1の1,000〜2,000 Uを補充し、溶解緩衝液（50mMのトリス-HCl、pH7.5、500mMのNaCl、1％（v / v）のTween-20を含む）で解凍し、細胞ペレットを再懸濁する。 注：NaCl濃度は、内因性のSf9細胞のタンパク質および下流の精製に使用し、固定化金属アフィニティーカラム（下記参照）との間の非特異的な相互作用を防止するために、500 mMまで調整される代わりに、修飾されたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）も使用することができる。 </li><li>洗剤とVOで再懸濁した細胞をインキュベートすることにより細胞を溶解rtexing。超音波処理、代替的（40％振幅、10秒の冷却に続いて10秒パルスの10サイクル）氷浴中でさらに細胞破壊のためのサンプルまたはダウンスホモジナイザーを使用しています。 </li><li> 4℃で1時間、48,000 xgでの遠心分離によって溶解物を明らかにする1ml /分の速度で4℃で、溶解緩衝液で予め平衡化したHisTrapカラム（5ミリリットルカラム体積）上に得られた上清をロードする。 注：別の方法として、明らかにした溶解物を1〜2時間、4℃で予め平衡化したニッケルセファロースビーズ1-5 5mLベッドボリューム（ 例えばニッケルセファロース6ファストフロー）と共にインキュベートすることができる。ニッケルセファロースカラムに重力流カラムを用いることによって結合工程の後に形成することができる。 </li><li>未結合のタンパク質を除去するために洗浄緩衝液（50mMのトリス-HCl、pH7.5、500mMのNaCl、10 mMイミダゾール）の10カラム容量でカラムを洗浄する。 </li><li>溶出するためにアクタFPLCを使用して10月/ mlの（または10カラム容量内）の割合で10〜10mmで、リニアイミダゾール勾配を使用して、結合された組換えkindlin-3-CHIS 6。 </li><li>通常、300mmのイミダゾール濃度で溶出kindlin-3-CHIS 6を含む画分と、アクタFPLCを使用して0.5〜1ミリリットルの画分に溶出を分画。 </li><li> SDS-PAGEで溶出液のタンパク質組成を評価し、初回の精製に抗His 6抗体または抗マウスkindlin-3抗体を用いたウエスタンブロット法により確認してください。 </li><li> 20mMのトリス-HCl、pH7.5、200mMのNaCl 50kDaの分子量カットオフ（MWCO）を用いてタンパク質を遠心濃縮器を用いて、緩衝液および試料濃度への希釈系列を介して内kindlin-3およびバッファー交換を含む画分をプール4℃で 注意：代替的に、20mMのトリス-HCl、pH7.5、200mMのNaCl中にO / Nを4時間、4℃で30 kDaのMWCOを用いてスライド-A-ライザー透析カセットを用いてタンパク質溶液を透析する。 注意：イオン交換のために（下記参照）のNaClの濃度が低い、 <eすなわち、50mMのmは&gt;することができ、この工程のために使用されてきた。 </li><li> 0.5ml /分の速度でアクタFPLCを用いて予め平衡化したHiTrapヘパリンHPカラム（5ミリリットルカラム体積）上に緩衝液交換したタンパク質溶液を適用する。 注：結合したkindlin-3は、線形NaCl勾配を用いて溶出される（1 MのNaCl、0.2 M NaCl）を同じ緩衝液中で、10mMの/ mLの割合で増加させる。 Kindlin-3-CHIS6は〜0.6MのNaClで溶出することが期待されている。 </li><li> 0.5〜1ミリリットルの分画に溶出を分別し、適切な場合には、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法によるタンパク質組成物を評価する。 注：SDS-PAGEによって評価される一方、近い95％のタンパク質純度を期待できる。 </li><li>プール画分をkindlin-3を含む0.5〜2 mlの最終容積に50 kDaのMWCOを有する遠心タンパク質濃縮器を使用して集中。 </li><li>最終工程において、濃縮タンパク質を研磨し、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いてタンパク質を緩衝液交換。 <ol><li>蘇上に精製タンパク質を適用perdex S200（16/60）又は（10/30）カラムのサイズに応じて、1ml /分または0.5 ml /分の速度で20mMのトリス-HCl、pH7.5、200mMのNaCl、1mMのDTTで予め平衡化使用。 注：必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーはまた、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で行うことができる。 </li><li>使用されるカラムのサイズに応じて1ml /分または0.5 ml /分の速度でカラムにバッファーを適用することによって、サイズに応じてタンパク質を精製する。 注：カラムから溶出したタンパク質を分画しであり、280nmでの吸光度を用いてモニターした。 </li><li>単一の吸光ピークは、均質性を決定するために分画し、SDS-PAGEによって評価され、この工程の後に、典型的には&gt; 95％の純度であるSECから期待されるべきである。 </li></ol></li><li> 〜15 mg / mlの、評価されるように、分光光度法109320 Mの計算された吸光係数（ε）を使用するために-1センチ-1 &lt;50 kDaのMWCOを有する遠心タンパク質濃縮器を用いて、精製kindlin-3-CHIS 6を集中/商標&gt;（すべてのシステイン残基が低減されると仮定して）。 </li><li> -80℃〜-20℃で長期保存における貯蔵のために、アリコートをPCRチューブ及びフラッシュ凍結し、液体窒素中でサンプルへのタンパク質。あるいは、タンパク質は、生化学的および生物物理学的多くの技術を用いて調査のために直接使用することができる。 </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+CrgA,+a+LysR-type+transcriptional+regulator+from+pathogenic+Neisseria+meningitidis+MC58.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58.</a> Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+adhesion+and+migration+by+Kindlin-3+cleavage+by+calpain.">Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain.</a> J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 .</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

バキュロウイルス発現系は、ますます人気とX線結晶学などの生物物理学的研究を用いて、タンパク質の特徴づけのための組換えタンパク質のミリグラム量の生産のための重要なツールになってきている。より実験的に求めているにもかかわらず、バキュロウイルス発現系は、E.比べていくつかの利点を提供大腸菌の一つは、翻訳後修飾のための適切なシャペロンと機会の存在などの真核生物由来のタンパク質のためのネイティブに近い環境です。 kindlin-3を発現させるための私たち自身の努力では、別の発現宿主は、哺乳類細胞株および細菌発現株（未発表の観察）を含む、使用された。一般的に、多くのE.大腸菌株は、組換えkindlin-3（;未発表の観察文化〜0.5 mg / Lの）の生産が非常に少量をテストしました。しかし、昆虫細胞におけるバキュロウイルス駆動発現が共同で、特に効果的だったと組換え細胞質タンパク質（未発表の観察）のミリグラムを単離するために必要な大規模なバイオマスの生成により適した哺乳動物細胞での一過性発現にmparison、。私たちは、真核生物の存在シャペロンkindlin-3の効率的な生産を可能にすることができると推測している。 バキュロウイルスは、昆虫細胞に感染し、組換えタンパク質発現のために本研究で使用バキュロウイルスは、 オートグラファ·カリフォルニ核多角体病ウイルス（AcNPV）に基づいています。自然の中でオートグラファ·カリフォルニ （アルファルファ枝落とし職人）昆虫の幼虫に感染AcNPVのは、ビリオンはこのように彼らのリリースのために必要な保護を提供する結晶性タンパク質マトリックスにカプセル化され、それによって閉塞を形成するために、ポリヘドリンタンパク質を必要とします。培養細胞に封入体の形成は、複製に必要なので、必須ではされていません。外来タンパク質を発現させる場合には、ポリヘドリンタンパク質遺伝子をrとすることができる目的のタンパク質の遺伝子を有する組換えAcNPVのでeplaced。 AcNPVの他Lepidopteronの種に感染することができ、組換えタンパク質発現軍の目的のために、ワームヨトウガ蛹卵巣細胞が使用されている。それは、そのようなこと：必須のウイルス遺伝子、ORF1629は、（KO 1629 BAC10）ノックアウトバクミド、その結果、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの挿入により不活性化されるように、ここで説明するアプローチでは、AcNPVののバクミド（BAC10）が設計されています感染baculovirions 28を形成することができません。線形化されたBAC10とSf9細胞の同時トランスフェクション：KO 1629とFERMT3含有トランスファーベクターの修理、非アクティブORF1629は、転置を通じて、また、ドリンプロモーター28の制御下にFERMT3遺伝子が組み込まれて実行可能なゲノムを得た。 私たちは、THRE経由で高純度の組換えマウスkindlin-3を単離するための精製プロトコルを記述Eステップのクロマトグラフィーアプローチ。ここで使用される方法は、簡単に他のHisタグタンパク質に適用することができる。我々はさらにkindlin-3を精製するイオン交換工程を採用したが、我々はkindlin-3はそのF1のドメイン内ポリリジンストレッチなどの塩基性残基の数が多い、所有しているように、これはさらに疑似親和性ステップであると考えています。さらに、kindlin-3に結合し、それが機能する原形質膜の細胞質面と相互作用すると考えられるので、我々は、塩基性残基のクラスター化タンパク質は負に帯電した膜に対抗できるようになると予測する。 精製プロトコールに記載されたバッファが標準であると考えられ、頻繁に構造生物学で使用される。 thermofluorアッセイ（ 図5）kindlin-3は、pH6.0の緩衝液上記のほとんどの条件において安定であることを示している。 β1：kinldin-3を研究するときに我々の実験を通知するために特に有用かつ重要だったNaClの12の低濃度でpH 6.1で優れたスペクトルが得られたNMRによるテール相互作用。 任意の生物物理学的研究に着手する前に、それが関心対象の精製されたタンパク質が実際に正しく折り畳まれ、機能的に活性であることを実証することが重要である。以前の刊行物では、サイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱、分析超遠心および小角X線散乱によって評価されるように、溶液中の単量体と単分散であり、あった組換えkindlin-3は、この方法を用いて発現および精製されたことを実証しまた、以前の携帯電話や生理学的研究14,20,22に沿ったものである天然のタンパク質、のように動作することを確認するように、結合および膜遠位NPXYとβ1A細胞質尾14の上流セリン/スレオニンクラスターを認識することができる。熱安定性アッセイの使用は、THを示唆している追加の方法ですE目的のタンパク質の適切な折り畳みは、として、誤って折り畳まれたタンパク質は、露出した疎水性残基に、高い蛍光バックグラウンドになります。 タンパク質のkindlinファミリーは、 生体内でのインテグリンの不可欠なコアクチベーターとしての予想外の役割が発見されて以来、多くの注目を集めている。これは、組換え、それらを表現し、その構造を解決するために多くの努力を誘発しました。現在までに限られた成功は、全長組換えタンパク質のミリグラム量を表現することが報告されているが、我々は、ここでの構造研究が実現可能になるレベルでの大規模な発現を可能にするバキュロウイルス系の使用が記載されている。組換えkindlin-3を大量に生成することにより、我々は、これは、このタンパク質のさらなる研究を支援することを期待しています。組換えマウスkindlin-3についてここで説明するバキュロウイルスドリブン方法および精製ワークフローは、他のkindlinアイソフォームを発現し、精製するために使用することができる、これも発現し、また、ポリ - リジンストレッチを保有することが困難であり、さらに、このような細菌株中で発現しない核酸結合タンパク質などの他の細胞質タンパク質、適合させることができる。

kindlinファミリーのタンパク質が重要な焦点接着アセンブリの構成要素、および複雑な生活のために不可欠である。 3哺乳動物のアイソフォーム（kindlin-1、kindlin-2、およびkindlin-3）があるそのうちのKindlinsは、タリン1と一緒に外受容体インテグリンのコアクチベーターと考えられている。インテグリンを介した細胞接着は、高等真核生物では、細胞外マトリックス（ECM）への細胞表面に接続します。それは、組織の完全性、胚発生、骨代謝、止血、免疫力が含まれる生理現象、の過多で重要かつ一般的なプロセスです。インテグリンを介した細胞接着は、その保存されたNPXYモチーフでインテグリンβサブユニット細胞質尾（CTS）にタリンとkindlinの結合を介してインサイドアウトシグナル伝達を介して活性化される。 kindlinタンパク質の生物医学の重要性は、はるかkindlin-2は、転写に関与していると、いくつかの最近の報告で示されている核、しかし拡張アル·コントロール2,3。 KindlinsはF2のサブドメインの中心のプレクストリン相同（PH）ドメインによって中断された二部のC末端FERM（4.1バン​​ド、エズリン、ラディキシン、モエシン）ドメインの所有による品質証明は約75 kDaでマルチドメインタンパク質であり、 4,5。 kindlin-2とkindlin-3 PHドメインの研究は、それが脂質セカンドメッセンジャーのホスファチジルイノシトール（3,4,5） -三リン酸およびホスファチジルイノシトール（4,5） -ビスリ ​​ン6-8に結合することが示された。しかしながら、kindlin-1 PHドメインの研究が結合する脂質を防止するアイソフォーム特異的塩橋によってkindlin-1で説明することができるはるかに低い親和性を有するP 3（3,4,5）の​​PtdInsそれに結合することを示す9。また、展開されると予測しかし、原形質膜の内部リーフレット10,11でホスファチジルセリンに結合するkindlinsのF1ドメインに挿入〜100個のアミノ酸ループが存在する。 kindlinのFERMタリンFERMドメインはプレクストリン相同ドメインを有していないが、ドメインが、タリンFERMドメインに相同であると考えられる。両方kindlinsとタリンは彼らのFERMドメインのF3領域を介してインテグリンβ-尾にNPXYモチーフと対話が、タリンは膜近位1 12月16日を目標としながら、kindlinは膜遠位モチーフに結合する。加えて、両方のKindlinsとタリンは、他FERMタンパク質11,17で発見されていないユビキチン様折り畳みを有するN末端​​F0ドメインを保有する。 kindlin-2のF0ドメイン上の研究は、それが独立して、ホスファチジルイノシトール（4,5） -ビスリ ​​ン富化膜17に結合することが示されている。 kindlinsはパラログ固有の組織発現パターンおよび非冗長の生理機能を発揮する。 Kindlin-1は、主に表皮中だけでなく、より少ない程度に、結腸、胃、腎臓に発現され; kindlin-2は、遍在的に発現されるが、横紋で濃縮し、滑らかな筋肉および4は、胚発生において発現のみkindlinであり、kindlin-3は、巨核球18に見出さkindlin-3の最高濃度を有する造血組織で発現される。しかし、より最近の研究は、機能性タンパク質が同様に19内皮組織で発現されることを示唆している。 Kindlin-3は、血液中のその重要な生理的役割に急性医療興味深い。これは、血小板凝集および感染および炎症21,22および骨吸収破骨細胞23足細胞の形成に応答して血栓形成20、白血球ローリング中に拡散するために重要である。生命を脅かす出血性疾患を特徴とする疾患および再発性の細菌感染20,24,25 -さらに、ヒトにおけるkindlin-3の枯渇は接着不全症のIII型白血球につながる。マウスでのKindlin-3ノックアウト研究は、タンパク質の重要な機能を明らかにした細胞接着KIND3 - / -マウスはkindlin-3を欠いているヒトでの症状に似ている、原因非アクティブな血小板インテグリン、深刻な大理石骨病、および損なわれた白血球接着20,22にこのような重度の出血などの明確な表現型を表示する。 kindlins上の高解像度の構造データは、現在まで、このようなプレクストリン相同kindlin-1 9とkindlin-2 26,27の（PH）ドメインとkindlin-1 11とkindlinのF0ドメインなどの個々のサブドメインに制限されています-2 17。各kindlinポリペプチドのサブドメインの大半は、しかし、クローニングと構造解析（イェーツとギルバート、未発表の観察）を抵抗しており、全長タンパク質の研究は、 大腸菌を使用して十分な量を発現させ、精製することの難しさによって妨げられてきた大腸菌 （未発表の観察とHarburger ら 14）。 kindlin-3とそのFUにかなりの医学的関心が寄せられているnction、他の2家族が並んで、そして最近では、バキュロウイルス感染12で駆動される、ヨトウガ細胞における組換え発現により、それのミリグラム量を生成した。したがって、我々は、ここに広範囲の構造研究および生化学的分析に適した昆虫細胞培養中の組換えマウスkindlin-3のミリグラム量の製造のための方法を記載している。 このプロトコルでは、設計ノックアウトバクミド（：1629 BAC10 KO）を利用する すなわち、単独で、生存可能なウイルス粒子28を製造することができない。ウイルスDNAは、このようにこの場合もkindlin-3遺伝子（FERMT3）を含み、FERMT3遺伝子における結果は、組換えで得られた高発現されるが、冗長されたウイルスは非常に後期遺伝子が、置換するトランスファーベクターとの組換えによりレスキューされるウイルスのライフサイクル28の一部として、マウスkindlin-3を表現したウイルス。 我々はこれを同定しkindlin-3の製造方法の他の発現宿主でそれを表現し、精製する試みは極めて困難（未発表の観察）だけでなく、我々がクローニングに使用し、それが多くの発現に展開することができますpOPINベクトルスイートの汎用性のために証明した後に29を開催しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1147">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid</td>
			<td style="width:123px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td style="width:439px;">store at 4&#176;C and warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td style="width:123px;">InVitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Streptomycin Sulphate (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>S0148</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Penicillin G, potassium salt (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>P0580</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td>Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HisTrap FF (5ml)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-5286-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HiTrap Heparin (5ml)</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-0407-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td style="width:439px;">15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies

Kindlinsは、細胞表面受容体のインテグリン、タリンで、本質的なコアクチベーターであり、またアウトサイドインインテグリンシグナル伝達に関与し、細胞核内の遺伝子の転写を制御する。 kindlinsは〜75kDaのマルチドメインタンパク質であり、NPXYモチーフとインテグリンβサブユニット細胞質尾部の上流のT / Sクラスターに結合する。造血重要なkindlinアイソフォーム、kindlin-3、白血球が感染し、炎症や骨吸収破骨細胞足細胞の形成に対応して転がり、血栓形成の際に血小板凝集のために重要である。これらのプロセスにおけるKindlin-3の役割は、広範な細胞および生理学的研究をもたらした。しかしながら、さらなる研究のためにタンパク質の高品質のミリグラム量を取得する効率的な方法が必要である。私たちは、バキュロウイルス-Dを使用して組換えマウスkindlin-3の効率的な発現および精製のために、ここで説明し、プロトコルを開発したその生物物理学的特徴付けを可能にするために、高純度完全長タンパク質の十分な量を得たSf9細胞での発現系を引き裂か。同じアプローチは、他の哺乳動物kindlinアイソフォームの研究に取ることができる。

バキュロウイルス感染Sf9細胞を用いた組換えマウスkindlin-3の大規模発現は、概略、図1Aに示すように、ミリグラム量を達成するために、2週間未満取るとのQIAprepミニプレップキットからのプラスミドDNAのわずかな量を必要とするためすることができ例。 図に示すように、5〜7日後に新たに形成されたビリオンを回収する組換えバキュロウイルスの生成は、マウスがkindlin-3（FERMT3）操作された線状化バクミド（KO 1629 BAC10）と共にプラスミドを含有するSf9細胞にコトランスフェクトすることによって達成される1A。バキュロウイルス生成結果のこの方法100パーセント組換えウイルスでの、本質的には、プラーク精製28,30の必要性を分配する。代表小規模（2ミリリットル単層）の文化は、MLの当り1×10 7プラーク形成単位の期待ウイルス力価（PFU）との組換えウイルスを含む溶液を生成します文化。一つは、実際のウイルス力価を決定するためにプラークアッセイを行うことができますが、構成要素の数が多いが、構造研究のためにテストされたとき、これはおそらく、あまりにも労働集約的である。ウイルス生成ステップの成功は、並列にeGFPを含有するプラスミドを用いて評価することができる、または、典型的に実証する、このkindlin-3構築物については、Sf9単層をPBSに再懸濁することができ、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって評価図1（b）に示すように、75kDaのHisタグタンパク質に対応する明瞭なバンド。ウイルスは、その後、大規模（1リットル容量）昆虫細胞の感染および組換えタンパク質を単離するための十分な量を生成するために増幅される。第2通路ウイルス（P2）は0.1の推定MOI（プロトコール参照）で懸濁培養を感染させることによって生成されます。これは、増幅させたSf9懸濁培養は、総フラスコボリュームの唯一の二十を占めていることが重要です。この追加のエアレーションが確実に生じたVIR3日間（72時間）後の感染後に収穫米を含むメディアは、その後の発現培養でkindlin-3の十分な量が生成されます。増幅されたウイルスストック（P2）を、2×10 6細胞/ mlの増幅31の間の細胞密度を用いて100 PFU /細胞の控えめな推定値に基づいて、2×10 8 pfu / mlでの予想されるウイルス力価を有することが想定される。 図1Cに示すように、一般に、最適なバキュロウイルス増幅およびタンパク質産生のために、Sf9細胞のため、サイズや球形で均一であるべきである。さらに、ウイルス増幅およびタンパク質発現は、72時間の感染後で最大であり、両方が有意に96時間感染後に低減される。 ウイルスが増幅され、大規模な実験でSf9細胞を感染させるために使用されたならば、組換えkindlin-3は、部分的に操作されたC-末端His 6タグを用いた固定化金属アフィニティクロマトグラフィのおかげで精製するmatography、 図2に示すように。これは、4℃で精製を行うことが重要であり、十分なプロテアーゼ阻害剤はタンパク質分解を防ぐために添加されている。部分精製kindlin-3、図3に示すように、ヘパリンカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィー（IEC）によってほぼ均質にさらに精製する。我々は、代わりに、従来のイオン交換カラムのヘパリンカラムの使用を採用し、我々は、kindlin-3 F1ドメイン内ポリリジンストレッチを含む塩基性残基、多数の、負に荷電した硫酸基と強く相互作用することを予測したように列の。この戦略は、CID1 32ウリジリル例えばRNA結合端子、基本的な核酸結合パッチで、DNAとRNA結合タンパク質のために特に有用である。最後にkindlin-3純度に示すように、凝集物を除去し、均質性を達成するために、サイズ排除クロマトグラフィーによって「磨か」である図4。プロトコルで指定されたバッファは、しばしば、構造分析のために、タンパク質精製に用いられる標準的なバッファである。一般に、リン酸塩系緩衝液は（特に4℃での実験のために）結晶化による滴中のリン酸結晶の形成、特に結晶化スクリーニング、構造研究のためのタンパク質の精製のために回避される。しかし、 図5に示すように、kindlin-3安定化されたバッファを決定するためにThermofluor基づく熱シフトアッセイを行った。簡潔には、精製されたタンパク質溶液を、したがって2次元のスクリーンを形成し、pHおよび塩化ナトリウム濃度の範囲をカバーするバッファー中に希釈される。タンパク質の融点は、温度範囲20〜95°C（293から368 K）上に、折り畳まれたタンパク質のコア内に疎水性残基に特異的に結合するシプロオレンジ染料（分子プローブ）からの蛍光を観察することにより測定される。その目での温度中間点電子タンパク質は、（転移温度、T m）は オプティコンモニターソフトウェアを用いて計算し、他の場所に記載されている33繰り広げられる。 Kindlin-3は、一貫性のある転移温度（T m）を用いて、pH範囲7.0〜9.0内で（500 mM）の高い塩化ナトリウム濃度において安定であることが観察された 55℃のまたKindlin-3のT mは 7.0〜7.5に関わらず塩化ナトリウム濃度のpH範囲内で約55℃であることが観察された。 我々はそこkindlin-3の限定的タンパク質分解は精製の間にあったが、高度に濃縮されたタンパク質（〜15 mg / ml）でのSDS-PAGE分析は等しい強度の二つの追加のポリペプチドと制限された汚染を示したことを見出した。 図4に示すように、奇妙なことに、しかし、サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる種の徴候は、存在しない。それは、このように、タンパク質がプロテアーゼによってニックを入れているが、折り畳まれたままとhydrodynと考えられている全長タンパク質からamically区別できない。興味深いことに、カルパインが知られているプロテアーゼであることプレクストリン相同（PH）ドメイン34のβ1-β2ループ内にあり、我々の観察を説明することができるTyrosine373、でkindlin-3を切断する。また、ウェスタンブロッティングを合計するとき、ポリペプチドダブレットの一つは、C-末端Hisタグおよびダブレットの見かけの分子量を有することが明らかになった、75kDaの、天然のタンパク質と同じ分子量は等しい。 Sf9細胞（〜2gの細胞重量）のリットル当たりの精製組換えkindlin-3の収率は、せいぜい、5 mgである。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> 図1。バキュロウイルス感染昆虫細胞の異種タンパク質の発現（A）の概要バキュロgeneratioの図式化の概要Sf9細胞におけるn及びkindlin-3の発現。 DNAベクター、回路図で、5&#39;UTR / ORF603は、赤に着色されているORF1629は、緑色に着色されており、興味（POI）のタンパク質の遺伝子は青色に着色されている。 （B） 組換えバキュロウイルス及び組換えマウスkindlin-3を産生するSf9細胞六小規模（2ミリリットル単分子層）培養物（レーン培養に係る標識）の抗His 6抗体を用いたウエスタンブロット、。 （C） のSf-900 II SFM中の懸濁液中で増殖させ、健康なSf9細胞の光学顕微鏡画像は、（プロトコルを参照）抗生物質を補充した35mmウェル組織培養皿に移した。画像は20Xの倍率である。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> 図2。Represe固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）によるkindlin-3の精製ntative。ニッケルアフィニティー精製された組換えネズミkindlin-3のSDS-PAGEは、バキュロウイルス感染Sf9細胞（〜2gの細胞重量）で表す。吸着されたタンパク質は、（ゲル上に示す）イミダゾール勾配を用いて溶出した。次のようにレーンが標識され、MW、分子量マーカー、リジン、全細胞溶解、FTが、（結合していない）を通って流れ、ウィスコンシン、1を洗う、WII、2を洗う。ウェスタンブロット解析（下記）もまた、組換えタンパク質上に設計Hisタグの存在を確認した溶出画分を用いて行った。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> 図3。 REPREkindlin -3ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによるのsentative精製する。（A）溶出プロフィールは、0.05〜1.0 MのNaClの濃度範囲を用いた線形塩化ナトリウム勾配（緑）の下で溶出する単一の対称ピークを表示する280nmの（青）（で観察され75kDaのタンパク質の存在を実証する分画された溶出B）の SDS-PAGE分析、kindlin-3（ラベルK3が）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> 図4の代表的なゲル濾過クロマトグラフィーおよび濃縮kindlin-3。用いて、精製kindlin-3の（A）ゲル濾過溶出プロフィール20℃のトリス-HCl、pH7.5、150mMのNaClおよび1mM DTTでのSuperdex S200（16/60）溶出体積に基づいて、kindlin -3移動するが、それは主に単量体であることを示唆し、75 kDaのタンパク質について予想されるように。 （B）は 、高濃度の精製された組換えkindlin-3のSDS-PAGE 14.5ミリグラムで/ mlである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> バッファスクリーニング。Kindlin-3については、図5。Thermofluorベースの熱シフトアッセイは、塩化ナトリウム濃度に対するpHを2次元のスクリーンを備えた種々の緩衝液中に希釈した。転移温度（温度中間点は）の蛍光で観察した疎水的に結合した色素、シプロオレンジ（分子プローブ）およびオプティコンモニターソフトウェアを用いて計算した。 （A）遷移温度の3次元ヒストグラム（B）50.4℃の計算された平均からの遷移温度の変化と一緒にプロットされている明確にするためにバーが、彼 ​​らが対応するまでの温度範囲に応じて色分けされます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlinsは、インテグリンを介して細胞間接着の基本であるが、それらの研究では、細菌宿主において組換えそれらを発現で遭遇する困難によって妨げられてきた。ここでは、バキュロウイルス感染昆虫細胞での効率的な生産のための方法を記載している。

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Research

JoVE Journal

Biology

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