Name: assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress
Uploaded: 2014-05-07T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress at JoVE.com

La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro dell&#39;Unione europea (FP7/2007-2013) in convenzione di sovvenzione n ° 323.267, da Electricité de France (EDF) e da L&#39;Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

1. Procedure di animali Questo protocollo è stato progettato in conformità con la Direttiva Comunità Europea del Consiglio, del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) ed è stato approvato dal nostro comitato istituzionale sul benessere degli animali (CETEA-CEA DSV IDF). <ol><li> Iniezioni con EdU / BrdU e irradiazione della E14.5 topi in gravidanza (Figura 2A). <ol><li> Preparare una soluzione di EdU a 1 mg / ml e BrdU a 5 mg / ml in PBS. Eseguire una iniezione intraperitoneale...

<ol>
	<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cerebral+cortical+areas.">Specification of cerebral cortical areas.</a> Science. 241, 170-176 (1988).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+he+neural+tube.">Mitosis in he neural tube.</a> J Comp Neurol. , 377-399 (1935).</li><li>Taverna, E., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+nuclei+IN+motion.">Neural progenitor nuclei IN motion.</a> Neuron. 67, 906-914 (2010).</li><li>Committee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+vertebrate+central+nervous+system:+revised+terminology.">Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology.</a> Anat Rec. 166, 257-261 (1970).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).</li><li>Miyata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+production+of+surface-dividing+and+non-surface-dividing+cortical+progenitor+cells.">Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells.</a> Development. 131, 3133-3145 (2004).</li><li>Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+arise+in+the+basal+neuroepithelium+of+the+early+mammalian+telencephalon:+a+major+site+of+neurogenesis.">Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).</li><li>Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+projection+neuron+production+and+maturation+in+the+developing+cerebral+cortex.">Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).</li><li>Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lengthening+of+the+cell+cycle+in+the+neurogenic+subpopulation+of+neural+progenitor+cells+during+mouse+brain+development.">Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development.</a> J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).</li><li>Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+neural+precursor+cells+in+the+dentate+gyrus.">Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus.</a> Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).</li><li>Semont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+p53+and+Fas/CD95+in+murine+neural+progenitor+cell+response+to+ionizing+irradiation.">Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation.</a> Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).</li><li>Nowak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+H2AX+phosphorylation+and+neural+precursor+apoptosis+in+the+developing+brain+of+mice.">Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice.</a> Radiat Res. 165, 155-164 (2006).</li><li>Gatz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+DNA+ligase+IV+during+embryonic+neuronal+development.">Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development.</a> J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).</li><li>Denekamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+kinetics+and+radiation+biology.">Cell kinetics and radiation biology.</a> International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).</li><li>Hartwell, L. H., Weinert, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+radiation-sensitivity+of+neural+stem+and+progenitor+cell+populations+within+the+developing+mouse+brain.">Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain.</a> Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).</li><li>Roque, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+p21waf1/cip+-dependent+G1/S+checkpoint+in+neural+stem+and+progenitor+cells+after+DNA+damage+in+vivo.">Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo.</a> Stem Cells. 30, 537-547 (2012).</li><li>Rousseau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+importance+of+homologous+recombination+DNA+repair+for+mouse+neural+stem+and+progenitor+cells.">In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 7, 12 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Clarke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-pulse+labeling+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+(EdU)+and+5-bromo-2'-deoxyuridine+(BrdU)+in+flow+cytometry.">Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry.</a> Curr Protoc Cytom. , (2011).</li><li>Deckbar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+the+G1-S+checkpoint.">The limitations of the G1-S checkpoint.</a> Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).</li><li>Manual, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-iT+EdU+Imaging+Kit.">Click-iT EdU Imaging Kit.</a> , (2011).</li><li>Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+centromeric+heterochromatin+in+mouse+fibroblasts+takes+place+in+early,+middle,+and+late+S+phase.">Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase.</a> Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).</li><li>Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subnuclear+localization+and+replication+timing+of+histone+H3+lysine+9+methylation+states.">Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states.</a> Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).</li><li>Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+global+and+fine-tuning+replication+timing+determinants+for+mouse+pericentric+heterochromatin.">Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin.</a> J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).</li><li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall.">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. , (2010).</li></ol>

Il disegno sperimentale qui descritto sulla base di incorporazione di EdU 1,5 ore prima dell&#39;irraggiamento e l&#39;incorporazione di BrdU subito dopo l&#39;irradiazione ha permesso la dimostrazione che NSPCs sono in grado di attivare S e checkpoint G2 / M, ma non il checkpoint G1 / S durante la 1 ° ora dopo un stress genotossico nel cervello fetale mouse. Abbiamo eseguito altri esperimenti in cui EdU è stato iniettato in tempi diversi dopo l&#39;irraggiamento e BrdU, a solo 1 ora prima topi sacrifici, c...

Durante lo sviluppo embrionale del cervello, neuroni di proiezione della corteccia cerebrale sono generati nella zona ventricolare, un epitelio pseudostratificato composto da diversi tipi di staminali neurali e cellule progenitrici (NSPC) che riveste le ventricoli laterali. Tra NSPC, le cellule gliali radiali (RGC), che servono come le cellule staminali neuronali, subiscono migrazione nucleare interkinetic (INM): eseguono mitosi alla superficie del ventricolo e fase S al limite basale della zona ventricolare (VZ) 1, 2,3. Essi possono suddividere simmetricamente per generare due RGC o asimmetricamente per generare un RGC e un neurone o una cellula intermedia progenitore (IPC) 4, 5. IPC migrare verso uno strato sovrastante proliferare chiamata zona subventricolare (SVZ), dove, dopo un ultimo divisione simmetrica che generano due neuroni di proiezione immaturi 6-8. Contrariamente a RGC, IPC non subiscono INM (recensito in 9). Neuroni appena generati Migrmangiato radialmente lungo le fibre radiali attraverso la zona intermedia (IZ) per raggiungere la destinazione finale nella piastra corticale (CP) 10, 8. Il tempismo perfetto di tutti questi eventi è essenziale per un corretto sviluppo corticale. Per esempio l&#39;interruttore dalla proliferazione di differenziazione delle popolazioni progenitrici neurali è controllata dalla durata della fase G1 11, 12. L&#39;allungamento della fase G1 correla quindi con differenziazione cellulare. Stress genotossico, come le radiazioni ionizzanti, lo sviluppo del cervello compromettere gravemente (rivisto nel 13). Noi e altri abbiamo dimostrato che NSPC sono molto inclini a radiazione indotta l&#39;apoptosi 14, 15,16. Le radiazioni ionizzanti inducono rotture del DNA doppie che sono i danni più gravi alle cellule proliferanti. Una componente essenziale della risposta al danno al DNA (DDR) nelle cellule ciclismo è l&#39;attivazione di punti di controllo del ciclo cellulare ai G1 / S o G2 / M transizioni o durante Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. Bloccano la progressione del ciclo cellulare per fornire il tempo per riparare i danni del DNA o eliminazione delle cellule troppo danneggiate. Di conseguenza, la morte cellulare e la progressione del ciclo cellulare ritardato possono alterare lo sviluppo del cervello in risposta a esposizione a radiazioni ionizzanti 22-24. Era quindi interessante sviluppare un metodo per valutare l&#39;attivazione di punti di controllo del ciclo cellulare in NSPC nel topo cervello embrionale irradiato. La progressione del ciclo cellulare è ordinariamente seguita mediante l&#39;incorporazione di un analogo della timidina, 5-Bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU). BrdU viene incorporata nella fase S del ciclo cellulare, quando il DNA si replica. L&#39;uso di un anticorpo contro BrdU permette successivamente la rilevazione di cellule che erano in fase S durante l&#39;impulso di BrdU. Un analogico timidina romanzo, 5-etinil-2&#39;-deossiuridina (UDE) è rilevata da un azide fluorescente. I diversi modi per rilevare EdU e B<html> RDU non cross-reagisce 25, consentendo il rilevamento simultaneo di entrambe analoghi della timidina, che è utile per lo studio della progressione del ciclo cellulare. Solitamente le cellule vengono prima pulsate con EdU e poi pulsate con BrdU, dove il tempo tra due incorporazioni dura paio d&#39;ore 25, 26. Aggiunta di BrdU in mezzi di coltura contenente EdU provoca preferenzialmente incorporazione di BrdU nel DNA con l&#39;esclusione di EdU, mentre aggiunta simultanea di EdU 25 con BrdU equimolare o mezza equimolare ai risultati di media in solo incorporazione di BrdU 27. Questo semplifica il protocollo dual etichettatura eliminando le fasi di lavaggio che normalmente necessari per rimuovere la prima etichetta dal supporto di coltura prima dell&#39;aggiunta della seconda etichetta. Ciò è di particolare interesse per lo studio in vivo, in cui le fasi di lavaggio non sono possibili, per determinare il tempo esatto della fase S entrata o di uscita della popolazione cellulare. t &quot;&gt; Recentemente, è stato sviluppato un metodo di etichettatura con doppia impulsi in cervello di topo embrionale utilizzando EdU e BrdU 23, 24,22 per analizzare la progressione del ciclo cellulare e INM di NSPC dopo irradiazione in utero. Inoltre è stato dimostrato che, durante fase S, cellule di topo replicare prima le regioni eucromatina e poi il heterochromatin pericentrica 28,29,30. interessante, eterocromatina pericentrica di diversi cromosomi raggruppati in nuclei interfasiche per formare foci eterocromatico noto anche come chromocenters e facilmente rilevabile con colorazione DAPI come foci brillante. Pertanto, i differenziali Edu e BrdU colorazioni di euchromatin e chromocenters ci ha aiutato ad analizzare con maggiore precisione la progressione fase S di NSPC. Questo metodo ha permesso la dimostrazione della apparente mancanza di G1 / S checkpoint in NSCP 22-24, che è abbastanza sorprendente, dal momento che questo checkpoint dovrebbe essere critica per la stabilità del genoma. Diversi expdisegni erimental basati su diverse combinazioni di Edu e BrdU impulsi sono stati utilizzati per analizzare la progressione del ciclo cellulare nel telencefalo ventrale e dorsale. Qui, diamo un esempio di protocolli per lo studio del danno al DNA acuta NSPC all&#39;interno dei primi 4 hr seguente irradiazione in utero di embrioni di topo E14.5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:228px;">EdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A10044</td>
			<td style="width:163px;">1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">BrdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">B5002</td>
			<td style="width:163px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:228px;">IBL 637</td>
			<td style="width:212px;">CIS BIO International</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Tissu Tek VIP</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Microtome</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">RM 2125 RT</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:125px;">93443</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:228px;">Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">C10083</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:228px;">Anti-BrdU</td>
			<td style="width:212px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:125px;">RPN202</td>
			<td style="width:163px;">1/300</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:228px;">Goat anti mouse-Alex594</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A11001</td>
			<td style="width:163px;">1/400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:212px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:125px;">0100-01</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Polysine slide</td>
			<td style="width:212px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:125px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P6148</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:228px;">PBS</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">20012-068</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:228px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">D9542</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Microscope BX51</td>
			<td style="width:212px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Confocal microscope SPE</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Prism software</td>
			<td style="width:212px;">Graphpad</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;">Version 5.0c</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:212px;">Adobe</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress

Neuroni della corteccia cerebrale sono generati durante lo sviluppo cerebrale da diversi tipi di cellule staminali e progenitrici neurali (NSPC), che formano un epitelio pseudostratificato rivestimento ventricoli laterali del cervello embrionale. Stress genotossici, come le radiazioni ionizzanti, hanno effetti estremamente deleteri sullo sviluppo del cervello connesse con l&#39;elevata sensibilità di NSPC. Delucidazione dei meccanismi cellulari e molecolari coinvolti dipende dalla caratterizzazione della risposta al danno del DNA di questi particolari tipi di cellule, che richiede un metodo preciso per determinare NSPC progressione attraverso il ciclo cellulare nel tessuto danneggiato. Qui viene mostrato un metodo basato su successive iniezioni intraperitoneali di EdU e BrdU nei topi in gravidanza e ulteriore rilevazione di questi due analoghi della timidina nelle sezioni coronali del cervello embrionale. EdU e BrdU sono entrambi incorporati nel DNA delle cellule si replicano durante la fase S e sono rilevate da due diverse tecniche (azide oun anticorpo specifico, rispettivamente), che facilita il loro rilevamento simultaneo. EdU e BrdU colorazione sono quindi determinate per ciascun nucleo NSPC in funzione della sua distanza dal margine ventricolare in una regione standard del telencefalo dorsale. Così questa tecnica dual etichettatura permette distinguere cellule che avanti attraverso il ciclo cellulare da coloro che hanno attivato un punto di controllo del ciclo cellulare che porta all&#39;arresto del ciclo cellulare in risposta al danno del DNA. Un esempio di esperimento viene presentato, in cui EdU stato iniettato prima dell&#39;irraggiamento e BrdU immediatamente dopo e analisi effettuata all&#39;interno del 4 ore dopo irradiazione. Questo protocollo fornisce un&#39;analisi accurata della risposta al danno del DNA acuta di NSPC in funzione della fase del ciclo cellulare in cui sono stati irradiati. Questo metodo è facilmente trasponibile a molti altri sistemi per determinare l&#39;impatto di un particolare trattamento sulla progressione del ciclo cellulare nei tessuti viventi.

Nell&#39;esperimento descritto nella Figura 2, EdU stata somministrata 1,5 hr prima dell&#39;irraggiamento e BrdU appena dopo l&#39;irradiazione. Quattro tipi di cellule sono state poi distinti in fette corticali preparati a 1 o 4 ore post-irradiazione, secondo l&#39;incorporazione di uno o EdU BrdU, entrambi o nessuno (Figure 2A e 2B). Importante, né EdU né incorporazione di BrdU cambiato il livello di apoptosi indotta da radiazioni (dati non mostrati). Inoltre, i me...

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Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

La somministrazione di due analoghi della timidina, EdU e BrdU, nei topi in gravidanza permette l&#39;analisi della progressione del ciclo cellulare in cellule progenitrici neurali e nel cervello embrionale mouse. Questo metodo è utile per determinare gli effetti dello stress genotossico, incluse le radiazioni ionizzanti, durante lo sviluppo del cervello.

Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

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Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-formanti colonia saggio Cell: un test per discriminare Bona Fide cellule staminali neurali da cellule progenitrici neurali

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

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Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Seguita dalla singola cellula di rilevamento a Monitor biologia cellulare e la progressione di lignaggio di popolazioni neurali Multiple immagini dal vivo

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellazione di infezione del Virus di Zika dello sviluppo del cervello umano In Vitro utilizzando cellule staminali derivate Organoids cerebrale

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...