Name: assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress
Uploaded: 2014-05-07T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress at JoVE.com

Исследование приводит к этим результатам получил финансирование от Седьмой рамочной программе Европейского союза (FP7/2007-2013) под грантового соглашения N ° 323267 от Электрисите де Франс (EDF) и от Национальное агентство De La Recherche - Sante-ENVIRONNEMENT др. Здоровье-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

1. Процедуры животных Этот протокол был разработан в соответствии с Директивой Европейского Совета Сообщества от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC) и была одобрена нашей институциональной комитета по защите животных (CETEA-ЦЭА DSV IDF). <ol><li> Инъекции с EDU / BrdU и облучения E14.5 беременных м...

<ol>
	<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cerebral+cortical+areas.">Specification of cerebral cortical areas.</a> Science. 241, 170-176 (1988).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+he+neural+tube.">Mitosis in he neural tube.</a> J Comp Neurol. , 377-399 (1935).</li><li>Taverna, E., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+nuclei+IN+motion.">Neural progenitor nuclei IN motion.</a> Neuron. 67, 906-914 (2010).</li><li>Committee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+vertebrate+central+nervous+system:+revised+terminology.">Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology.</a> Anat Rec. 166, 257-261 (1970).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).</li><li>Miyata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+production+of+surface-dividing+and+non-surface-dividing+cortical+progenitor+cells.">Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells.</a> Development. 131, 3133-3145 (2004).</li><li>Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+arise+in+the+basal+neuroepithelium+of+the+early+mammalian+telencephalon:+a+major+site+of+neurogenesis.">Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).</li><li>Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+projection+neuron+production+and+maturation+in+the+developing+cerebral+cortex.">Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).</li><li>Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lengthening+of+the+cell+cycle+in+the+neurogenic+subpopulation+of+neural+progenitor+cells+during+mouse+brain+development.">Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development.</a> J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).</li><li>Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+neural+precursor+cells+in+the+dentate+gyrus.">Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus.</a> Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).</li><li>Semont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+p53+and+Fas/CD95+in+murine+neural+progenitor+cell+response+to+ionizing+irradiation.">Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation.</a> Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).</li><li>Nowak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+H2AX+phosphorylation+and+neural+precursor+apoptosis+in+the+developing+brain+of+mice.">Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice.</a> Radiat Res. 165, 155-164 (2006).</li><li>Gatz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+DNA+ligase+IV+during+embryonic+neuronal+development.">Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development.</a> J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).</li><li>Denekamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+kinetics+and+radiation+biology.">Cell kinetics and radiation biology.</a> International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).</li><li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints:+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events.">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246, 629-634 (1989).</li><li>Weinert, T. A., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RAD9+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+evidence+that+its+function+acts+posttranslationally+in+cell+cycle+arrest+after+DNA+damage.">Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).</li><li>Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+caffeine+on+X-irradiated+HeLa+cells.+I.+Delayed+inhibition+of+DNA+synthesis.">The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis.</a> Radiat Res. 71, 653-665 (1977).</li><li>Painter, R. B., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+ataxia-telangiectasia:+a+new+explanation.">Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).</li><li>Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+radiation-sensitivity+of+neural+stem+and+progenitor+cell+populations+within+the+developing+mouse+brain.">Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain.</a> Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).</li><li>Roque, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+p21waf1/cip+-dependent+G1/S+checkpoint+in+neural+stem+and+progenitor+cells+after+DNA+damage+in+vivo.">Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo.</a> Stem Cells. 30, 537-547 (2012).</li><li>Rousseau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+importance+of+homologous+recombination+DNA+repair+for+mouse+neural+stem+and+progenitor+cells.">In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 7, 12 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Clarke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-pulse+labeling+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+(EdU)+and+5-bromo-2'-deoxyuridine+(BrdU)+in+flow+cytometry.">Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry.</a> Curr Protoc Cytom. , (2011).</li><li>Deckbar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+the+G1-S+checkpoint.">The limitations of the G1-S checkpoint.</a> Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).</li><li>Manual, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-iT+EdU+Imaging+Kit.">Click-iT EdU Imaging Kit.</a> , (2011).</li><li>Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+centromeric+heterochromatin+in+mouse+fibroblasts+takes+place+in+early,+middle,+and+late+S+phase.">Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase.</a> Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).</li><li>Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subnuclear+localization+and+replication+timing+of+histone+H3+lysine+9+methylation+states.">Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states.</a> Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).</li><li>Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+global+and+fine-tuning+replication+timing+determinants+for+mouse+pericentric+heterochromatin.">Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin.</a> J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).</li><li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall.">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. , (2010).</li></ol>

Схема эксперимента описана здесь на основе включения ОБР 1,5 ч перед облучением и включение BrdU сразу после облучения позволило демонстрацией того, что NSPCs способны активировать S и G2 / M контрольные точки, но не контрольных точек G1 / S в течение 1-го часа после генотоксичным напряжение...

Во время эмбрионального развития головного мозга, проекционные нейроны коры головного мозга генерируются в вентрикулярной зоне, псевдомногослойный эпителий состоит из различных типов нейронных стволовых и клеток-предшественников (NSPC), что линии боковые желудочки. Среди NSPC, радиальные глиальные клетки (RGC), которые служат нервных стволовых клеток, претерпевают интеркинетической ядерного миграции (INM): они выполняют митоз на поверхности желудочка и S-фазе при базальном предела вентрикулярной зоне (ВЗ) 1, 2,3. Они могут разделить либо симметрично, чтобы генерировать два RGC или асимметрично, чтобы генерировать один RGC и один нейрон или промежуточной клеток-предшественников (IPC) 4, 5. МПК мигрировать в слое покрывающей пролиферирующих называемой субвентрикулярной зоне (SVZ), где после одного последнего симметричного деления они создают два незрелых проекционные нейроны 6-8. Вопреки РГК, МПК не подвергаются INM (обзор в 9). Вновь созданный нейроны Migrели радиально вдоль радиальных волокон через промежуточную зону (ИЗ), чтобы достичь конечного пункта назначения в кортикальной пластинки (СР) 10, 8. Идеальное время всех этих событий имеет важное значение для правильного развития коры. Например переход от распространения в дифференциации нервных населения предшественников контролируется продолжительности G1 фазы 11, 12. Таким образом, удлинение фазе G1 коррелирует с клеточной дифференцировки. Генотоксический стресс, такие как ионизирующего излучения, строго отрицательно воздействовать на развитие головного мозга (обзор 13). Мы и другие показали, что NSPC весьма склонны к радиационно-индуцированного апоптоза 14 15,16. Ионизирующих излучений вызывать ДНК двойные разрывы цепи, которые являются наиболее серьезный ущерб пролиферирующих клеток. Один из важнейших компонентов повреждения ДНК реагирования (РДР) в велосипедных клеток является активация контрольно-пропускных пунктах клеточного цикла в / M переходов G1 / S или G2 или во время Sфаза (внутри-S контрольно-пропускной пункт) 17-21. Они блокируют прогрессирование клеточного цикла, чтобы предоставить время для ремонта повреждений ДНК или ликвидации слишком поврежденных клеток. Следовательно, гибель клеток, а также ход клеточного цикла задерживается может изменить развитие мозга в ответ на ионизирующего излучения экспозиции 22-24. Таким образом, было интересно разработать метод оценки активацию клеточного цикла контрольно-пропускных пунктов в NSPC в облученной мышиных эмбриональных мозга. Прогрессирование клеточного цикла следует регулярно использующих включение тимидина аналоговых, 5-бром-2&#39;-дезоксиуридина (BrdU). BrdU вводят во время S-фазе клеточного цикла, когда ДНК репликацию. Использование антитела против BrdU позволяет впоследствии обнаружение клеток, которые были в S фазе в течение импульса BrdU. Новый аналог тимидина, 5-этинил-2&#39;-дезоксиуридина (ОБР) детектируется посредством флуоресцентного азида. Различные способы обнаружения EDU и В<html> РДУ не перекрестно реагируют 25, что позволяет одновременное обнаружение обоих аналогов тимидина, что полезно для изучения клеточного цикла. Обычно клетки сначала импульсно Edu, а затем импульсно BrdU, где время между обеими инкорпорации длится пару часов 25, 26. Добавление BrdU в культуральной среде, содержащей ОБР приводит к включению предпочтительно BrdU в ДНК с вытеснением ОБР, в то время как одновременное добавление ОБР 25 с эквимол рным или половина эквимол рном BrdU к результатам медиа только в BrdU включения 27. Это упрощает двойной протокол маркировки, устраняя шаги мыть, которые обычно требуют, чтобы удалить первую метку из культуральной среды перед добавлением второй этикетке. Это также относится к особый интерес для в естественных условиях исследования, где шаги стиральные невозможно, чтобы определить точные сроки ввода S фазы или выходе из клеточной популяции. т &quot;&gt; Недавно был предложен способ маркировки двойного импульса в эмбрионального мозга мыши с использованием ОБР и BrdU 23, 24,22 была разработана для анализа прогрессии клеточного цикла и INM из NSPC после облучения в матке. Более того было показано, что в ходе S фазы, клетки мыши повторить вначале Эухроматин регионы и затем перицентрического гетерохроматина 28,29,30. Интересно, перицентрический гетерохроматина разных хромосом сосредоточены в интерфазовыми ядер с образованием гетерохроматиновых очаги также известный как хромоцентров и легко обнаруживаемый окрашиванием DAPI как яркий очагов. Таким образом, дифференциальные EDU и BrdU окрашивание из эухроматина и хромоцентров помогли нам проанализировать точнее S фазы прогрессирования NSPC. Этот метод позволил демонстрацию очевидного отсутствия G1 / S контрольно-пропускном пункте в НМТП 22-24, что вполне удивительно, так как это контрольно-пропускной пункт, как предполагается, является критическим для стабильности генома. Несколько ехрerimental проекты, основанные на различных комбинациях EDU и BrdU импульсов были использованы для анализа прогрессию клеточного цикла в брюшной и спинной мозге. Здесь мы приведем пример протоколов, позволяющих изучение острого повреждения ДНК NSPC в течение первых 4 часов следующего внутриутробное облучения эмбрионов E14.5 мыши.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:228px;">EdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A10044</td>
			<td style="width:163px;">1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">BrdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">B5002</td>
			<td style="width:163px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:228px;">IBL 637</td>
			<td style="width:212px;">CIS BIO International</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Tissu Tek VIP</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Microtome</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">RM 2125 RT</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:125px;">93443</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:228px;">Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">C10083</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:228px;">Anti-BrdU</td>
			<td style="width:212px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:125px;">RPN202</td>
			<td style="width:163px;">1/300</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:228px;">Goat anti mouse-Alex594</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A11001</td>
			<td style="width:163px;">1/400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:212px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:125px;">0100-01</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Polysine slide</td>
			<td style="width:212px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:125px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P6148</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:228px;">PBS</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">20012-068</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:228px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">D9542</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Microscope BX51</td>
			<td style="width:212px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Confocal microscope SPE</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Prism software</td>
			<td style="width:212px;">Graphpad</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;">Version 5.0c</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:212px;">Adobe</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress

Нейроны коры головного мозга генерируются во время развития мозга от различных видов нервных стволовых и клеток-предшественников (NSPC), которые образуют псевдомногослойный эпителий накладки боковых желудочков эмбрионального мозга. Генотоксические стрессы, такие как ионизирующего излучения, имеют весьма негативное влияние на развивающийся мозг, связанной с высокой чувствительностью NSPC. Выяснение клеточных и молекулярных механизмов, вовлеченных зависит от характеристик ответа на повреждения ДНК этих конкретных типов клеток, что требует точный метод для определения прогрессирования NSPC через клеточного цикла в поврежденной ткани. Здесь показан способ, основанный на последовательных внутрибрюшинных инъекций ОБР и BrdU у беременных мышей и дальнейшего обнаружения этих двух тимидина аналогов в корональных секций эмбрионального мозга. EDU и BrdU оба включены в ДНК реплицирующихся клеток во время S фазы и обнаруживаются двух различных методов (азидных илиспецифическое антитело, соответственно), которые облегчают их одновременное обнаружение. EDU и окрашивание BrdU затем определяются для каждого ядра NSPC в зависимости от удаленности от желудочка перевесом в стандартной области спинной мозге. Таким образом эта двойная техника маркировки позволяет выделить клетки, которые в ходе освоения клеточного цикла от тех, которые активировали контрольную точку клеточного цикла, ведущих к остановке клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Пример эксперимента представлена, в котором EDU вводили до облучения и BrdU сразу после и проведение анализа в 4 ч после облучения. Этот протокол обеспечивает точный анализ повреждений ДНК ответ острой из NSPC в зависимости от фазы клеточного цикла, на котором они были облучены. Этот метод легко транспозонов и во многих других системах, чтобы определить воздействие конкретного лечения на прогрессирование клеточного цикла в живых тканях.

В эксперименте, описанном на фиг.2, ОБР вводили 1,5 ч перед облучением и BrdU только после облучения. Четыре типа Затем клетки отличаются в корковых срезов, полученных на 1 или 4 ч после облучения, в соответствии с введением либо ОБР или BrdU, оба или ни (фигуры 2A и 2B). В?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress at JoVE.com

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Администрация двух аналогов тимидина, EDU и BrdU, у беременных мышей позволяет проводить анализ клеточного цикла в нервной и клеток-предшественников в эмбриональном мозге мыши. Этот метод полезен для определения последствий генотоксического стресса, в том числе ионизирующего излучения, во время развития мозга.

Оценка клеточного цикла Прогрессирование нервных стволовых и клеток-предшественников в развивающемся мозге мыши после Генотоксические стресса

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Cellular Processes

Cell Cycle and Division

SCIENTISTS IN ACTION

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Нейробластов Анализ: Анализ для создания и обогащения нейронов клетки-предшественники из Дифференцируя нейронных потомков стволовых клеток методом проточной цитометрии

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Сотовый Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из взрослых мышей субвентрикулярной зоны и Live-визуализация клеточного цикла динамика

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Живой изображений, следуют одной ячейки отслеживания для мониторинга клеточной биологии и прогрессирования Lineage нескольких нейронных популяций

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Моделирования Зика вирус развивающегося мозга человека в пробирке с помощью стволовых клеток получены мозгового Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...