Name: assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress
Uploaded: 2014-05-07T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress at JoVE.com

La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 323267, de Electricité de France (EDF) y de l&#39;Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

1. Los procedimientos con animales Este protocolo ha sido diseñado de acuerdo con la Directiva del Consejo Europeo de Comunidades de 24 de Noviembre de 1986 (86/609/CEE) y ha sido aprobado por nuestro comité institucional sobre bienestar animal (CETEA-CEA DSV IDF). <ol><li> Las inyecciones con edu / BrdU y la irradiación de E14.5 ratones preñados (Figura 2A). <ol><li> Preparar una solución de EdU a 1 mg / ml y de BrdU a 5 mg / ml en PBS. Realice una inyección intrape...

<ol>
	<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cerebral+cortical+areas.">Specification of cerebral cortical areas.</a> Science. 241, 170-176 (1988).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+he+neural+tube.">Mitosis in he neural tube.</a> J Comp Neurol. , 377-399 (1935).</li><li>Taverna, E., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+nuclei+IN+motion.">Neural progenitor nuclei IN motion.</a> Neuron. 67, 906-914 (2010).</li><li>Committee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+vertebrate+central+nervous+system:+revised+terminology.">Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology.</a> Anat Rec. 166, 257-261 (1970).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).</li><li>Miyata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+production+of+surface-dividing+and+non-surface-dividing+cortical+progenitor+cells.">Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells.</a> Development. 131, 3133-3145 (2004).</li><li>Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+arise+in+the+basal+neuroepithelium+of+the+early+mammalian+telencephalon:+a+major+site+of+neurogenesis.">Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).</li><li>Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+projection+neuron+production+and+maturation+in+the+developing+cerebral+cortex.">Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).</li><li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex.">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).</li><li>Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lengthening+of+the+cell+cycle+in+the+neurogenic+subpopulation+of+neural+progenitor+cells+during+mouse+brain+development.">Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development.</a> J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).</li><li>Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+effects+on+neural+precursor+cells+in+the+dentate+gyrus.">Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus.</a> Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).</li><li>Semont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+p53+and+Fas/CD95+in+murine+neural+progenitor+cell+response+to+ionizing+irradiation.">Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation.</a> Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).</li><li>Nowak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+H2AX+phosphorylation+and+neural+precursor+apoptosis+in+the+developing+brain+of+mice.">Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice.</a> Radiat Res. 165, 155-164 (2006).</li><li>Gatz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+DNA+ligase+IV+during+embryonic+neuronal+development.">Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development.</a> J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).</li><li>Denekamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+kinetics+and+radiation+biology.">Cell kinetics and radiation biology.</a> International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).</li><li>Hartwell, L. H., Weinert, T. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+caffeine+on+X-irradiated+HeLa+cells.+I.+Delayed+inhibition+of+DNA+synthesis.">The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis.</a> Radiat Res. 71, 653-665 (1977).</li><li>Painter, R. B., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+ataxia-telangiectasia:+a+new+explanation.">Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).</li><li>Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+radiation-sensitivity+of+neural+stem+and+progenitor+cell+populations+within+the+developing+mouse+brain.">Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain.</a> Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).</li><li>Roque, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+p21waf1/cip+-dependent+G1/S+checkpoint+in+neural+stem+and+progenitor+cells+after+DNA+damage+in+vivo.">Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo.</a> Stem Cells. 30, 537-547 (2012).</li><li>Rousseau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+importance+of+homologous+recombination+DNA+repair+for+mouse+neural+stem+and+progenitor+cells.">In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 7, 12 (2012).</li><li>Bradford, J. A., Clarke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-pulse+labeling+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+(EdU)+and+5-bromo-2'-deoxyuridine+(BrdU)+in+flow+cytometry.">Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry.</a> Curr Protoc Cytom. , (2011).</li><li>Deckbar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limitations+of+the+G1-S+checkpoint.">The limitations of the G1-S checkpoint.</a> Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).</li><li>Manual, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-iT+EdU+Imaging+Kit.">Click-iT EdU Imaging Kit.</a> , (2011).</li><li>Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+centromeric+heterochromatin+in+mouse+fibroblasts+takes+place+in+early,+middle,+and+late+S+phase.">Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase.</a> Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).</li><li>Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+subnuclear+localization+and+replication+timing+of+histone+H3+lysine+9+methylation+states.">Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states.</a> Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).</li><li>Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+global+and+fine-tuning+replication+timing+determinants+for+mouse+pericentric+heterochromatin.">Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin.</a> J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).</li><li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall.">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. , (2010).</li></ol>

El diseño experimental descrito aquí basado en la incorporación de EdU 1,5 horas antes de la irradiación y la incorporación de BrdU inmediatamente después de la irradiación permitió la demostración de que NSPCs son capaces de activar S y puntos de control G2 / M pero no el punto de control G1 / S durante la 1 ª hora después de un estrés genotóxico en el cerebro del ratón fetal. Se realizaron otros experimentos en los que se ha inyectado EdU en diferentes momentos después de la irradiación y Br...

Durante el desarrollo embrionario del cerebro, las neuronas de proyección de la corteza cerebral se generan en la zona ventricular, un epitelio pseudoestratificado compuesto de diferentes tipos de células madre neurales y células progenitoras (CPSN) que recubre los ventrículos laterales. Entre CPSN, las células gliales radiales (RGC), que sirven como células madre neurales, se someten a la migración nuclear interkinetic (INM): que realizan la mitosis en la superficie del ventrículo y la fase S en el límite basal de la zona ventricular (VZ) 1, 2,3. Ellos pueden dividir de forma simétrica para generar dos RGC o asimétricamente para generar una RGC y una neurona o una célula progenitora intermedia (IPC) 4, 5. IPC migrar a una capa superpuesta que proliferan llamada zona subventricular (SVZ), donde después de una última división simétrica generan dos neuronas de proyección inmaduros 6-8. Contrariamente a la RGC, IPC no sufren INM (revisado en 9). Neuronas recién generadas MIGRcomió radialmente a lo largo de las fibras radiales a través de la zona intermedia (IZ) para llegar a su destino final en la placa cortical (CP) 10, 8. La sincronización perfecta de todos estos eventos es esencial para un desarrollo cortical correcta. Por ejemplo, el interruptor de la proliferación a la diferenciación de las poblaciones progenitoras neuronales se controla por la duración de la fase G1 11, 12. El alargamiento de la fase G1 se correlaciona tanto con la diferenciación celular. Estrés genotóxico, como la radiación ionizante, el desarrollo del cerebro dañar seriamente (revisado en 13). Nosotros y otros han demostrado que NSPC son muy propensas a la apoptosis inducida por la radiación-14, 15,16. Las radiaciones ionizantes inducen ADN de doble filamento se rompe que son el daño más severo a las células proliferantes. Un componente esencial de la respuesta al daño del ADN (DDR) en el ciclo de las células es la activación de los puntos de control del ciclo celular en la transición G1 / S o G2 / M transición o durante Sfase (intra-S de control) 17-21. Ellos bloquean la progresión del ciclo celular para proporcionar tiempo para la reparación del daño en el ADN o eliminación de células demasiado dañados. En consecuencia, la muerte celular, así como la progresión del ciclo celular retardada pueden alterar el desarrollo del cerebro en respuesta a la exposición a radiaciones ionizantes 22-24. Por lo tanto, era interesante desarrollar un método para evaluar la activación de puntos de control del ciclo celular en CPSN en el cerebro de ratón embrionario irradiado. La progresión del ciclo celular es seguida de forma rutinaria utilizando la incorporación de un análogo de timidina, 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina (BrdU). BrdU se incorpora durante la fase S del ciclo celular, cuando el ADN se replica. El uso de un anticuerpo contra BrdU a partir de entonces permite la detección de células que se encontraban en la fase S durante el pulso de BrdU. Un nuevo análogo de timidina, 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (edu) se detecta por una azida fluorescente. Las diferentes maneras de detectar Edu y B<html> RDU no reacciona de forma cruzada 25, lo que permite la detección simultánea de ambos análogos de timidina, que es útil para el estudio de la progresión del ciclo celular. Por lo general, las células se pulsaron con primera edu y pulsaron entonces con BrdU, en el que el tiempo entre las dos incorporaciones dura par de horas 25, 26. La adición de BrdU en medio de cultivo que contiene EdU preferentemente resulta en la incorporación de BrdU en el ADN con la exclusión de edu, mientras que la adición simultánea de EdU 25 con BrdU equimolar o medio equimolar a los resultados de los medios de comunicación en sólo incorporación de BrdU 27. Esto simplifica el protocolo de doble etiquetado mediante la eliminación de los pasos de lavado que normalmente se requieren para eliminar la primera etiqueta del medio de cultivo antes de la adición de la segunda etiqueta. Esto también es de especial interés para el estudio in vivo, donde los pasos de lavado no son posibles, para determinar el momento preciso de la entrada en la fase S o la salida de la población celular. t &quot;&gt; Recientemente, un método de etiquetado de doble pulso en el cerebro embrionario de ratón usando edu y BrdU 23, 24,22 se ha desarrollado para analizar la progresión del ciclo celular y el INM de CPSN después de la irradiación en el útero. Además, se ha demostrado que, durante fase S, células de ratón se replica en primer lugar las regiones de eucromatina y heterocromatina entonces el pericéntrica 28,29,30. Curiosamente, la heterocromatina pericéntrica de diferentes cromosomas agrupados en núcleos interfásicos para formar focos de heterocromatina también conocido como chromocenters y fácilmente detectable por tinción con DAPI como focos brillantes. Por lo tanto, los diferenciales Edu y BrdU tinciones de eucromatina y chromocenters nos ayudaron a analizar con mayor precisión la progresión de la fase S de NSPC. Este método permite la demostración de la aparente falta de G1 / S de control en NSCP 22-24, que es bastante sorprendente, ya que este punto de control se supone que es crítico para la estabilidad del genoma. Varios experimental diseños basados ​​en diversas combinaciones de edu y BrdU pulsos se han utilizado para analizar la progresión del ciclo celular en el telencéfalo ventral y dorsal. Aquí, le damos un ejemplo de protocolos que permiten el estudio del daño en el ADN aguda de NSPC dentro de las primeras 4 horas después de la irradiación en el útero de embriones E14.5 ratón.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:228px;">EdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A10044</td>
			<td style="width:163px;">1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">BrdU</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">B5002</td>
			<td style="width:163px;">5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:228px;">IBL 637</td>
			<td style="width:212px;">CIS BIO International</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Tissu Tek VIP</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Microtome</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">RM 2125 RT</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:125px;">93443</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:228px;">Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">C10083</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:228px;">Anti-BrdU</td>
			<td style="width:212px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:125px;">RPN202</td>
			<td style="width:163px;">1/300</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:228px;">Goat anti mouse-Alex594</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">A11001</td>
			<td style="width:163px;">1/400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Fluoromount</td>
			<td style="width:212px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:125px;">0100-01</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Polysine slide</td>
			<td style="width:212px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:125px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">P6148</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:228px;">PBS</td>
			<td style="width:212px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:125px;">20012-068</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:228px;">DAPI</td>
			<td style="width:212px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">D9542</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:228px;">Microscope BX51</td>
			<td style="width:212px;">Olympus</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:228px;">Confocal microscope SPE</td>
			<td style="width:212px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:228px;">Prism software</td>
			<td style="width:212px;">Graphpad</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;">Version 5.0c</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:228px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:212px;">Adobe</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cell cycle progression of neural stem and progenitor cells in the mouse developing brain after genotoxic stress

Las neuronas de la corteza cerebral se generan durante el desarrollo cerebral de diferentes tipos de células madre y progenitoras neuronales (CPSN), que forman un epitelio pseudoestratificado que reviste los ventrículos laterales del cerebro embrionario. Tensiones genotóxicos, como la radiación ionizante, tienen efectos muy nocivos sobre el desarrollo del cerebro relacionada con la alta sensibilidad de NSPC. La elucidación de los mecanismos celulares y moleculares implicados depende de la caracterización de la respuesta al daño de ADN de estos tipos particulares de células, que requiere un método preciso para determinar CPSN progresión a través del ciclo celular en el tejido dañado. Aquí se muestra un método basado en sucesivas inyecciones intraperitoneales de Edu y BrdU en ratones embarazadas y aún más la detección de estos dos análogos de la timidina en secciones coronales del cerebro embrionario. Edu y BrdU se incorporan tanto en el ADN de las células de replicación durante la fase S y se detectan mediante dos técnicas diferentes (o azidaun anticuerpo específico, respectivamente), lo que facilita su detección simultánea. Edu y tinción de BrdU se determinan entonces para cada núcleo CPSN en función de su distancia desde el margen ventricular en una región estándar del telencéfalo dorsal. Por lo tanto esta técnica de doble etiquetado permite distinguir las células que progresaron a través del ciclo celular de los que han activado un punto de control del ciclo celular que conduce a la detención del ciclo celular en respuesta al daño del ADN. Un ejemplo de experimento se presenta, en el que se inyectó EdU antes de la irradiación y BrdU inmediatamente después y análisis realizados en el 4 horas después de la irradiación. Este protocolo proporciona un análisis preciso de la respuesta al daño de ADN aguda de CPSN en función de la fase del ciclo celular en la que se han irradiado. Este método es fácilmente extrapolable a muchos otros sistemas con el fin de determinar el impacto de un tratamiento particular en la progresión del ciclo celular en los tejidos vivos.

En el experimento descrito en la Figura 2, EdU se administró 1,5 horas antes de la irradiación y de BrdU sólo después de la irradiación. Cuatro tipos de células se distinguen en las rodajas corticales preparadas en 1 o 4 horas después de la irradiación, de acuerdo a la incorporación de cualquiera de EdU o BrdU, ambos o ninguno (Figuras 2A y 2B). Es importante destacar que, ni EdU ni la incorporación de BrdU cambiar el nivel de la apoptosis inducida por la radi...

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Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

La administración de dos análogos de timidina, edu y BrdU, en ratones embarazada permite el análisis de la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales y en el cerebro de ratón embrionario. Este método es útil para determinar los efectos del estrés genotóxico, incluyendo la radiación ionizante, durante el desarrollo del cerebro.

La evaluación de la progresión del ciclo celular de la madre neurales y células progenitoras en el cerebro en desarrollo del ratón después de estrés genotóxico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Investigación

Neurociencias

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

La proyección de imagen seguida de la célula de seguimiento para la biología de la célula de Monitor y la progresión de linaje de poblaciones neuronales múltiples en vivo

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelado de la infección del Virus Zika del desarrollo cerebro humano In Vitro usando células madre derivado Cerebral organitas

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...