Name: cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke biolitec Research GmbH (Jena, Tyskland) for venligt at forsyne os med den liposomale mTHPC formulering, med særlig tak til Susanna Grafe og Arno Wiehe for deres hjælp og teknisk ekspertise. Vi vil også gerne takke Kerstin Reidy, der genererede en stor del af resultaterne og var coresponsible for offentliggørelsen 11.. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Schweizerischer Verein Balgrist, universitetet i Zürich, det Krebsliga Zürich samt ved en bevilling fra Walter L. og Johanna Wolf Foundation, Zürich, Schweiz og en bevilling fra EuroNanoMed ERA-NET / SNF Swiss National Science Foundation 31NM30-131004/1. Dette arbejde blev også støttet af HSM (Highly speciallæger) program for Muskuloskeletal Onkologi af Kanton Zürich.

1.. Sammenligning af optagelsen af ​​mTHPC i de respektive Lav og stærkt metastaserende HOS og 143B OS cellelinjer <ol><li> Forbered celledyrkningsmedium indeholdende DMEM, Ham F12 og varmeinaktiveret føtalt kalveserum i et forhold 4.5:4.5:1. Bemærk: Den liposomale formulering af PS mTHPC blev opløst i vand ved en slutkoncentration på 1,5 mg / ml mTHPC. </li><li> Plate 0,2 x 10 6 HOS og 143B celler / brønd i 6-brønds plader (tre eksemplarer for hver betingelse), og lad cel...

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma.">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li><li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era.">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li><li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma:+where+do+we+stand.">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li><li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma.">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li><li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment.">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li><li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

For at opnå optimal cytotoksicitet reaktion på PDT, er det afgørende at vælge de rigtige laserlys indstillinger og inkubationstider. De her beskrevne procedurer er konsekvent og effektivt at bestemme PS optagelse og kvantificere PDT induceret cytotoksicitet in vitro. Brug af specifikke absorptionsbølgelængder af PS mTHPC kan den cellulære PS optagelse bestemmes på en direkte måde, og PS kan aktiveres for at frembringe cytotoksiske reaktive ilt arter. Ved at bruge denne ...

Dagens topmoderne behandling af osteosarcoma (OS), en primær knogletumor, omfatter en kombination af neo adjuvans kemoterapi og kirurgi. Dette behandlingsregimen afslørede en stigning i overlevelsesraten for patienter med lokaliseret sygdom fra ca 20% før anvendelsen af kemoterapi, til øjeblikket 60-70% 3, 4. Men i de sidste to årtier har den overordnede overlevelse OS patienter med lokal sygdom toppet 4, 5. Desuden 30-40% af disse patienter tilbagefald inden for 3 år efter diagnosen, og patienter med metastatisk sygdom fortsat har en dårlig overlevelse på 20-30% 4, 6, 7. For at forbedre resultaterne af disse patienter skal udvikles nye terapeutiske strategier. Fotodynamisk terapi (PDT), en temmelig ny behandling mod kræft, bruger lys af en bestemt bølgelængde for excitation af en photosensiTizer (PS), som ophobes i tumorceller efter injektion ind i blodbanen. Laserlys excitation af PS genererer oxygenradikaler i nærvær af oxygen, som inducerer cytotoksisk reaktion i tumorceller og celledød. Ud over dette primære mekanisme, to ekstra PDT fremkaldte biologiske processer bidrager til reduceret tumorvækst: PDT forårsager vasokonstriktion og trombedannelse af tumor microvasculature og dermed lokal hypoxi og iltmangel inde i tumoren, hvilket fører til tumor infarkt. Endelig PDT sårede og døende tumorceller udløse en immunrespons lokal, en temmelig unik feature i PDT. Dette involverer komplementsystemet og aktivering af antigen-præsenterende dendritiske celler 8. Således er betingelserne skabt for præsentationen af ​​tumorantigener med efterfølgende aktivering af lymfoide celler, hvilket fører til tumor specifik immunitet. Hidtil har PDT er blevet anvendt til behandling af flere typer af tumorer i blødt væv og hyperplAsiens, såsom aktinisk keratose, Barretts øsofagus, endobronchiale tumorer, blærecancer, basalcellekarcinomer, og palliativ behandling af hoved-og halscancer 2.. Behandlingen er kendt for at fremkalde lokal stor målestok nekrose med kun små bivirkninger, og har således potentiale til selektivt at udrydde tumorvæv. På trods af disse fordele, anvendelsen af ​​PDT er teknisk mere krævende end administration af kemoterapeutiske stoffer. For at opnå maksimal effektivitet, PS koncentration lyseksponering og total lysenergi overførsel skal optimeres. Dette kan gøres in vivo eksperimenter, men på grund af det relativt store antal parametre, der skal optimeres, er det mere effektivt i første omgang at bestemme optimale betingelser in vitro. I de nedenfor beskrevne eksperimenter testede vi in vitro effekten af PDT under anvendelse af PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyphenyl) chlOrin, forkortet mTHPC (figur 1A). mTHPC er det aktive stof i lægemidlet Foscan, som i øjeblikket bruges i klinikken til palliativ behandling af hoved-og halscancer. Det er en af de mest potente PS, inducere massiv cellebeskadigelse allerede ved lave koncentrationer, og det blev påvist at være overlegen i forhold til andre PS i form af vævsgennemtrængning 9, 10. Dens lys-absorptionsspektrum (figur 1B) viser to prominente toppe, en ved 417 nm og en anden ved 652 nm, som anvendes til vævslokalisering akkumulere PS og til PDT induktion, hhv. I øjeblikket er en liposomal formulering for mTHPC er under udvikling. Her beskriver vi de procedurer, til at kvantificere udbredelsen af ​​denne liposomal formulering, og til at udføre PDT i to humane OS cellelinjer, den lave metastatisk HOS og de høje metastatiske 143B celler. Nogle af de data, der præsenteres her, er blevet rapporteret tidligere 11. The fremgangsmåde beskrevet her muligt for os at undersøge virkningen af ​​en metastatisk fænotype PDT effekt. 143B celler, orthotopisk sprøjtes ind i bagbenene immun mangelfulde SCID mus forårsager intratibial metastaserende primære tumorer, en model nøje efterligne den menneskelige metastaserende sygdom. Det foreslåede in vitro forsøg er perfekt egnet til at vurdere de optimale PDT indstillinger, der skal senere anvendes i in vivo forsøg.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

I de senere år har der været problemer med at finde mere effektive behandlinger mod kræft med færre systemiske bivirkninger. Derfor Fotodynamisk terapi er en ny tilgang til en mere tumor selektiv behandling. Fotodynamisk terapi (PDT), som gør brug af en ikke-toksisk fotosensibilisator (PS), som ved aktivering med lys med en bestemt bølgelængde i nærvær af oxygen, genererer oxygenradikaler, som fremkalder en cytotoksisk reaktion 1. På trods af sin godkendelse næsten tyve år siden af FDA, er PDT i dag kun brugt til at behandle et begrænset antal kræftformer (hud, blære) og nononcological sygdomme (psoriasis, aktinisk keratose) 2.. Den største fordel ved brugen af ​​PDT er evnen til at udføre en lokal behandling, som forhindrer systemiske bivirkninger. Desuden tillader behandling af tumorer på sarte steder (fx omkring nerver eller blodkarrene). Her en intraoperative anvendelse af PDT betragtes i osteosarkom (OS), en svulst i knogler, for at målrette primær tumor satellitter efterladt i tumor omkringliggende væv efter kirurgisk tumor resektion. Behandlingen sigter på at mindske antallet af gentagelser og på at mindske risikoen for (postoperativ) metastaser. I den foreliggende undersøgelse præsenterer vi in vitro PDT procedurer til at etablere de optimale PDT indstillinger for effektiv behandling af udbredte OS cellelinier, der anvendes til at gengive den humane sygdom i veletablerede intratibial OS musemodeller. Optagelsen af ​​PS mTHPC blev undersøgt med et spektrofotometer og fototoksicitet blev provokeret med laserlys excitation af mTHPC ved 652 nm til at fremkalde celledød vurderet med WST-1 analysen og ved optællingen af ​​overlevende celler. De etablerede teknikker gør os i stand til at definere de optimale PDT indstillinger til fremtidige studier i dyremodeller. De er en nem og hurtig redskab til evaluering af effekten af ​​PDT <em&gt; In vitro inden en ansøgning in vivo.

Med de her rapporterede teknikker, vi undersøgte mTHPC-baserede PDT i humane OS-celler. Først blev tid og dosisafhængig optagelse af mTHPC undersøgt i lav metastatisk HOS og i de meget metastatiske 143B OS cellelinjer. mTHPC optagelse kan vurderes ved måling af fluorescensen af mTHPC med et fluorescens-spektrofotometer (figur 2, der er gengivet med tilladelse fra Reidy et al. 11). 2A illustrerer optagelsen af mTHPC på en tidsafhængig måde. Fluorescensintensit...

Watch this Scientific Journal Video about Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro at JoVE.com

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Protokollen rapporteret her tillader evaluering af effekten af ​​fotodynamisk terapi (PDT) i cellelinjer og optimering af PDT-indstillingerne, før du anvender terapi i dyremodeller.

Cytotoksisk Effekten af ​​Fotodynamisk terapi i osteosarcomceller<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal injektion af genterapivektorer og stamceller i mus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Berigelse af kræft i æggestokkene tumorfremkaldende celler

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

fremstilling og<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterisering af Magnetized miR-modificerede endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metode til kvantificering Upper Limb Performance i min hverdag anvender accelerometre

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

En In Vitro metode til Fotodynamisk terapi

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Klargøring af Gushukang (GSK) granulat til in vivo-og in vitro-forsøg

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Brug af en kemisk biopsi til graft kvalitetsvurdering

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Cytotoksisk Effekten af ​​Fotodynamisk terapi i osteosarcomceller

Cytotoksisk Effekten af Fotodynamisk terapi i osteosarcomceller