Name: cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00
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Gli autori desiderano ringraziare biolitec Research GmbH (Jena, Germania) per averci gentilmente fornito con la formulazione liposomiale mTHPC, con un ringraziamento speciale a Susanna Gräfe e Arno Wiehe per il loro aiuto e la competenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare Kerstin Reidy, che ha generato una gran parte dei risultati ed è stato corresponsabile per la sua pubblicazione 11. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Schweizerischer Verein Balgrist, dell&#39;Università di Zurigo, il Krebsliga Zurigo così come da una sovvenzione da Walter L. e Johanna Lupo Foundation, Zurigo, Svizzera e una sovvenzione da EuroNanoMed ERA-NET / SNF svizzera National Science Foundation 31NM30-131004/1. Questo lavoro è stato supportato anche dal programma (altamente specializzati Medicina) per muscoloscheletrico Oncologia del Canton Zurigo HSM.

1. Confronto tra l&#39;assorbimento del mTHPC nei rispettivi basso e altamente metastatico HOS e 143B OS Linee Cellulari <ol><li> Preparare terreno di coltura contenente DMEM, Ham F12, e siero fetale di vitello inattivato al calore in un rapporto 4.5:4.5:1. Nota: La formulazione liposomiale del PS mTHPC è stato disciolto in acqua ad una concentrazione finale di 1,5 mg / ml mTHPC. </li><li> Tavola 0.2 x 10 6 HOS e cellule 143B / pozzetto in piastre da 6 pozzetti (triplicato per ogni ...

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma.">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li><li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era.">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li><li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma:+where+do+we+stand.">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li><li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma.">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li><li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment.">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li><li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

Per ottenere citotossicità ottimale in risposta a PDT, è fondamentale scegliere le impostazioni di luce laser destra e tempi di incubazione. Le procedure qui descritte sono coerenti ed efficienti per determinare PS assorbimento e quantificare citotossicità PDT indotta in vitro. Utilizzando le specifiche lunghezze d&#39;onda di assorbimento della PS mTHPC, il PS assorbimento cellulare può essere determinato in modo diretto, e il PS può essere attivato per generare citotossici specie reattive dell&#39;ossige...

Lo stato odierno del trattamento arte di osteosarcoma (OS), un tumore osseo primario, comprende una combinazione di chemioterapia neo adiuvante e chirurgia. Questo regime terapeutico rivelato un aumento del tasso di sopravvivenza dei pazienti con malattia localizzata da circa il 20% prima dell&#39;uso della chemioterapia, per attualmente tra 60-70% 3, 4. Tuttavia, negli ultimi due decenni, la sopravvivenza complessiva dei pazienti con malattia del sistema operativo locale ha plateaued 4, 5. Inoltre, il 30-40% di questi pazienti ricaduta entro 3 anni dopo la diagnosi e pazienti con malattia metastatica continuare ad avere una scarsa sopravvivenza del 20-30% 4, 6, 7. Per migliorare l&#39;esito di questi pazienti, nuove strategie terapeutiche devono essere sviluppate. La terapia fotodinamica (PDT), una terapia antitumorale piuttosto romanzo, utilizza la luce di una specifica lunghezza d&#39;onda di eccitazione di un photosensitizer (PS), che si accumula nelle cellule tumorali dopo l&#39;iniezione nel flusso sanguigno. Luce laser di eccitazione del PS genera radicali dell&#39;ossigeno in presenza di ossigeno, che inducono reazione citotossica nelle cellule tumorali e cellule morte. Oltre a questo meccanismo principale, due ulteriori PDT evocato processi biologici contribuiscono alla crescita del tumore ridotta: PDT provoca vasocostrizione e la formazione di trombi del microcircolo tumore e, di conseguenza, ipossia e anossia locale all&#39;interno del tumore, con conseguente tumore infarto. Infine, PDT ferito e cellule tumorali muoiono innescare una risposta immunitaria locale, una caratteristica piuttosto unica di PDT. Ciò comporta il sistema del complemento e l&#39;attivazione delle cellule presentanti l&#39;antigene dendritiche 8. Così, si creano le condizioni per la presentazione di antigeni tumorali con conseguente attivazione di cellule linfoidi, portando a tumore immunità specifica. Finora, PDT è stato usato per trattare diversi tipi di tumori dei tessuti molli e hyperplasia, quali cheratosi attinica, esofago di Barrett, tumori endobronchiali, cancro della vescica, carcinomi a cellule basali, e il trattamento palliativo della testa e del collo 2. Il trattamento è noto per indurre locale, necrosi larga scala con solo pochi effetti collaterali, e quindi ha il potenziale per eradicare selettivamente tessuto tumorale. Nonostante questi vantaggi, l&#39;applicazione di PDT rimane tecnicamente più impegnativo rispetto alla somministrazione di farmaci chemioterapici. Al fine di raggiungere la massima efficacia, la concentrazione PS, tempo di esposizione alla luce e totale trasferimento di energia luminosa devono essere ottimizzate. Questo può essere fatto in esperimenti in vivo, ma, a causa del gran numero relativo di parametri che devono essere ottimizzate, è più efficiente per determinare inizialmente condizioni ottimali in vitro. Negli esperimenti descritti di seguito, abbiamo testato l&#39;efficacia in vitro di PDT utilizzando il PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-idrossifenil) chlOrin, abbreviato mTHPC (Figura 1A). mTHPC è il principio attivo contenuto nel medicinale Foscan, che viene attualmente utilizzato in clinica per il trattamento palliativo del carcinoma della testa e del collo. Si tratta di uno dei più potenti PS, inducendo danno cellulare massiccia già a basse concentrazioni, ed è stato dimostrato di essere superiore ad altri PS in termini di penetrazione nel tessuto 9, 10. Il suo spettro di assorbimento della luce (Figura 1B) presenta due picchi prominenti, una a 417 nm ed una seconda a 652 nm, che sono utilizzati per la localizzazione del tessuto di accumulare PS e per l&#39;induzione PDT, rispettivamente. Attualmente, una formulazione liposomiale per mTHPC è in fase di sviluppo. Qui, descriviamo le procedure per quantificare l&#39;assorbimento di questa formulazione liposomiale, e per eseguire PDT in due linee di cellule del sistema operativo umani, la bassa HOS metastatico e le alte cellule metastatiche 143B. Alcuni dei dati presentati qui sono stati segnalati in precedenza 11. The approccio qui descritto permette di studiare l&#39;effetto di un fenotipo metastatico sul PDT efficacia. 143B cellule, ortotopicamente iniettate nelle arti posteriori del sistema immunitario topi SCID con deficit causano tumori intratibial metastatizzanti primari, un modello mimando la malattia metastasi umana. Così, gli esperimenti proposti in vitro sono perfettamente adatti per valutare le impostazioni ottimali PDT per essere successivamente utilizzati in esperimenti in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

Negli ultimi anni, vi è stata la difficoltà di trovare terapie più efficaci contro il cancro con meno effetti collaterali sistemici. Pertanto Terapia Fotodinamica è un nuovo approccio per un trattamento selettivo più del tumore. La terapia fotodinamica (PDT) che fa uso di un fotosensibilizzatore tossico (PS), il quale, dopo attivazione con luce di una specifica lunghezza d&#39;onda, in presenza di ossigeno, genera radicali dell&#39;ossigeno che suscitano una risposta citotossica 1. Nonostante la sua approvazione quasi vent&#39;anni fa dalla FDA, PDT è oggi utilizzato solo per il trattamento di un numero limitato di tipi di cancro (pelle, della vescica) e le malattie nononcological (psoriasi, cheratosi attinica) 2. Il principale vantaggio della PDT è la capacità di eseguire un trattamento locale, che previene gli effetti collaterali sistemici. Inoltre, permette il trattamento di tumori in siti delicati (ad esempio attorno nervi o vasi sanguigni). Qui, un intraoperatapplicazione ive di PDT è considerato in osteosarcoma (OS), un tumore dell&#39;osso, per indirizzare satelliti tumorali primari lasciati nel tumore tessuto circostante dopo la resezione chirurgica del tumore. Il trattamento mira a ridurre il numero di recidive e di ridurre il rischio di (postoperatorio) metastasi. Nel presente studio, presentiamo in vitro procedure PDT stabilire le impostazioni ottimali PDT per il trattamento efficace di linee cellulari OS diffusi che vengono utilizzati per riprodurre la malattia umana in modelli murini OS intratibial consolidate. L&#39;assorbimento del PS mTHPC è stato esaminato con uno spettrofotometro e fototossicità è stato provocato con la luce laser di eccitazione di mTHPC a 652 nm per indurre la morte cellulare valutata con WST-1 test e il conteggio delle cellule sopravvissute. Le tecniche consolidate ci consentono di definire le impostazioni ottimali PDT per futuri studi in modelli animali. Sono uno strumento semplice e rapido per la valutazione dell&#39;efficacia di PDT <em&gt; In vitro prima di un&#39;applicazione in vivo.

Con le tecniche qui riportate, abbiamo studiato a base di mTHPC PDT in cellule umane del sistema operativo. In primo luogo, l&#39;assorbimento dipendente dal tempo e dose di mTHPC è stato studiato nel partire HOS metastatico e nelle linee cellulari 143B OS altamente metastatiche. mTHPC assorbimento può essere valutata misurando la fluorescenza di mTHPC con uno spettrofotometro a fluorescenza (Figura 2, riprodotto con il permesso Reidy et al. 11). Figura 2A illustra...

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Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Il protocollo qui riportato permette di valutare l&#39;efficacia della terapia fotodinamica (PDT) in linee cellulari e l&#39;ottimizzazione delle impostazioni PDT prima di applicare la terapia in modelli animali.

Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

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