Name: cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00
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Os autores gostariam de agradecer biolitec Research GmbH (Jena, Alemanha) para gentilmente nos fornecer a formulação lipossomal mTHPC, com um agradecimento especial a Susanna Gräfe e Arno Wiehe pela sua ajuda e conhecimento técnico. Também gostaria de agradecer a Kerstin Reidy, que gerou uma grande parte dos resultados e foi co-responsável por sua publicação 11. Este trabalho foi financiado por doações do Schweizerischer Verein Balgrist, da Universidade de Zurique, o Krebsliga Zurique, bem como por uma concessão do Walter L. e Johanna Lobo Foundation, Zurich, na Suíça e uma bolsa da EuroNanoMed ERA-NET / SNF suíço National Science Foundation 31NM30-131004/1. Este trabalho também foi apoiado pelo programa (altamente especializada Medicine) para Musculoskeletal Oncology da Kanton Zurich HSM.

1. Comparação da absorção de mTHPC no Baixo respectiva e altamente metastático HOS e 143B OS linhas celulares <ol><li> Prepare a meio de cultura celular contendo DMEM, F12 de Ham, e inactivado por calor soro fetal de vitelo numa 4.5:4.5:1 proporção. Nota: A formulação lipossomal do PS mTHPC foi dissolvido em água a uma concentração final de 1,5 mg / ml mTHPC. </li><li> Placa de 0,2 x 10 6 e as células HOS 143B / poço em placas de 6 poços (triplica para cada condição)...

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma.">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li><li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era.">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li><li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma:+where+do+we+stand.">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li><li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma.">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li><li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment.">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li><li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

Para alcançar citotoxicidade ideal em resposta a PDT, é fundamental para escolher as configurações de luz de laser direita e tempos de incubação. Os procedimentos aqui descritos são consistentes e eficiente para determinar a absorção de PS e para quantificar a citotoxicidade induzida por PDT, in vitro. Usando os comprimentos de onda de absorção específicas do PS mTHPC, a absorção PS celular pode ser determinada de um modo directo, e o PS pode ser activada para gerar espécies reactivas de oxigéni...

Estado da arte do tratamento de osteossarcoma (OS) de hoje, um tumor ósseo primário, abrange uma combinação de quimioterapia adjuvante e neo cirurgia. Este regime de tratamento revelou um aumento na taxa de sobrevivência de pacientes com doença localizada a partir de cerca de 20% antes do uso de quimioterapia, a atualmente entre 60-70% 3, 4. No entanto, nas últimas duas décadas, a sobrevida global dos pacientes com doença do sistema operacional local tem plateaued 4, 5. Além disso, 30-40% dos pacientes com recaída no prazo de 3 anos após o diagnóstico e os pacientes com doença metastática continuam a ter uma fraca sobrevivência de 20-30% 4, 6, 7. Para melhorar o resultado de esses pacientes, novas estratégias terapêuticas têm de ser desenvolvidas. Terapia Fotodinâmica (PDT), uma terapia anticâncer em vez novela, usa a luz de um comprimento de onda específico para a excitação de um photosensiTizer (PS), que se acumula nas células tumorais após a sua injecção na corrente sanguínea. A luz do laser de excitação do PS gera radicais de oxigénio, na presença de oxigénio, os quais induzem a reacção citotóxica em células tumorais e a morte celular. Além deste mecanismo primário, dois PDT adicional evocado processos biológicos contribuir para o crescimento do tumor reduzido: TFD causa a vasoconstrição e a formação de trombos da microcirculação do tumor e, consequentemente, a hipóxia e anóxia locais no interior do tumor, levando a enfarte do tumor. Finalmente, PDT feridos e moribundos células tumorais desencadear uma resposta imune local, uma característica bastante singular do PDT. Isto envolve o sistema do complemento e a activação das células apresentadoras de antigénios dendríticas 8. Assim, são criadas condições para a apresentação de antígenos tumorais com subsequente ativação de células linfóides, levando a imunidade específica do tumor. Até agora, a terapia fotodinâmica tem sido utilizada para tratar diversos tipos de tumores de tecidos moles e hyperplásia de, como a ceratose actínica, esôfago de Barrett, tumores endobrônquica, câncer de bexiga, carcinomas basocelulares e tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço 2. O tratamento é conhecido por induzir a necrose de grande escala local com apenas pequenos efeitos secundários, e, portanto, tem o potencial para eliminar selectivamente o tecido do tumor. Apesar destas vantagens, a aplicação de PDT permanece tecnicamente mais exigente do que a administração de fármacos quimioterapêuticos. A fim de atingir a eficácia máxima, a concentração de PS, o tempo de exposição à luz e de transferência total de energia de luz têm de ser optimizados. Isto pode ser feito em experiências in vivo, mas, por causa do grande número relativo de parâmetros que têm de ser optimizados, é mais eficiente para determinar inicialmente a condições óptimas in vitro. Nas experiências descritas em seguida, testou-se a eficácia in vitro de PDT utilizando o PS 5,10,15,20-tetraquis-(meta-hidroxifenil) chlorin, abreviado mTHPC (Figura 1A). mTHPC é a substância activa do medicamento Foscan, que é usado atualmente na clínica para o tratamento paliativo de câncer de cabeça e pescoço. É um dos PS mais potente, induzindo enormes danos celulares já em baixas concentrações, e demonstrou-se ser superior a outras PS em termos de penetração do tecido 9, 10. O seu espectro de absorção de luz (Figura 1B) mostra dois picos proeminentes, uma em 417 nm e um segundo de 652 nm, que são utilizados para a localização de tecido de acumulação de PS e para a indução de PDT, respectivamente. Atualmente, uma formulação lipossomal para mTHPC está em desenvolvimento. Aqui, descrevemos os procedimentos para quantificar a absorção desta formulação lipossomal, e para realizar PDT em duas linhas de células do sistema operacional humanos, o baixo HOS metastático e as células metastáticas 143B altos. Alguns dos dados aqui apresentados foram relatados anteriormente 11. The abordagem aqui descrita permite-nos estudar o efeito de um fenótipo metastático em PDT eficácia. Células 143B, ortotopicamente injetadas nos membros posteriores de ratos SCID imunodeficientes causar tumores primários metástase intratibial, um modelo que imita de perto a doença metástase humana. Assim, as experiências in vitro propostos são perfeitamente adequados para avaliar os ajustes de PDT óptimas para ser usado mais tarde em experiências in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

Nos últimos anos, tem sido a dificuldade em encontrar terapias mais eficazes contra o câncer com menos efeitos colaterais sistêmicos. Portanto Terapia Fotodinâmica é uma nova abordagem para um tratamento selectivo mais tumor. Terapia Fotodinâmica (PDT) que faz uso de um fotossensibilizador não tóxico (PS), que, após a activação com luz de um comprimento de onda específico, na presença de oxigénio, gera radicais livres de oxigénio, que provocam uma resposta citotóxica 1. Apesar de sua aprovação há quase vinte anos pelo FDA, PDT hoje é apenas usado para tratar um número limitado de tipos de câncer (de pele, bexiga) e doenças nononcological (psoríase, queratose actínica) 2. A principal vantagem da utilização da TFD é a capacidade de executar um tratamento local, o que evita os efeitos secundários sistémicos. Além disso, permite o tratamento de tumores em locais delicados (por exemplo, em torno de nervos ou vasos sanguíneos). Aqui, um intraoperataplicação ive do PDT é considerada no osteossarcoma (OS), um tumor do osso, para atingir satélites tumor primário deixado para trás em torno do tecido tumoral após a ressecção cirúrgica do tumor. O tratamento tem como objetivo diminuir o número de recidivas e na redução do risco de (pós-operatório) metástase. No presente estudo, apresentamos in vitro procedimentos PDT para estabelecer as configurações PDT ideais para o tratamento eficaz de linhas de células do sistema operacional amplamente utilizados que são usados ​​para reproduzir a doença humana em modelos do rato OS intratibial bem estabelecidos. A captação do PS mTHPC foi examinada com um espectrofotómetro e fototoxicidade foi provocado com a luz laser de excitação de mTHPC em 652 nm para induzir a morte celular avaliada com um ensaio de WST-1 e pela contagem de células sobreviventes. As técnicas estabelecidas nos permitem definir as configurações PDT ideais para futuros estudos em modelos animais. Eles são uma ferramenta fácil e rápida para a avaliação da eficácia da TFD <em&gt; In vitro antes de uma aplicação in vivo.

Com as técnicas aqui relatadas, investigamos PDT-based mTHPC em células do sistema operacional humanos. Primeiro, o tempo e a dose de absorção dependente mTHPC foi investigada no baixo HOS metastático e nas linhas de células 143B OS altamente metastáticas. mTHPC absorção pode ser avaliada através da medição da fluorescência de mTHPC com um espectrofotómetro de fluorescência (Figura 2, reproduzida com a permissão do Reidy et al. 11). Figura 2A ilustra ...

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Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

O protocolo relatado aqui permite a avaliação da eficácia da terapia fotodinâmica (PDT) em linhas de células e a optimização das condições de PDT, antes de aplicar a terapia em modelos animais.

Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

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