Name: cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro at JoVE.com

Författarna vill tacka Biolitec Research GmbH (Jena, Tyskland) för vänligt ger oss den liposomala mTHPC formulering, med särskilt tack till Susanna Gräfe och Arno Wiehe för deras hjälp och teknisk expertis. Vi vill också tacka Kerstin Reidy, som genererade en stor del av resultaten och var coresponsible för dess offentliggörande 11. Detta arbete har finansierats med bidrag från Schweizerischer Verein Balgrist, universitetet i Zürich, den Krebsliga Zurich samt av ett bidrag från Walter L. och Johanna Wolf Foundation, Zürich, Schweiz och ett bidrag från EuroNanoMed ERA-NET / SNF Swiss National Science Foundation 31NM30-131004/1. Detta arbete stöddes också av HSM (högspecialiserade medicin) program för Musculoskeletal Oncology i Kanton Zürich.

1. Jämförelse av Upptag av mTHPC i respektive låga och mycket Metastatic HOS och 143B OS cellinjer <ol><li> Förbered cellodlingsmedium innehållande DMEM, Hams F12 och värmeinaktiverat fetalt kalvserum i ett förhållande 4.5:4.5:1. Obs: liposomal formulering av PS mTHPC löstes i vatten vid en slutkoncentration av 1,5 mg / ml mTHPC. </li><li> Plansch 0,2 x 10 6 HOS och 143B celler / brunn i 6-brunnsplattor (triplikat för varje betingelse) och låta cellerna vidhäfta över nat...

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma.">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li><li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era.">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li><li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma:+where+do+we+stand.">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li><li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma.">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li><li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment.">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li><li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

För att uppnå optimal cytotoxicitet som svar på PDT, är det viktigt att välja rätt laserljusinställningar och inkubationstider. De här beskrivna förfarandena är konsekvent och effektivt för att bestämma PS upptag och att kvantifiera PDT inducerad cytotoxicitet in vitro. Med hjälp av de specifika absorptions-våglängder av PS mTHPC, kan den cellulära PS upptag bestämmas på ett direkt sätt, och den bärbara telefonen kan aktiveras för att alstra cytotoxiska reaktiva syreradikaler. <p class=...

Dagens toppmodern behandling av osteosarkom (OS), en primär ben tumör, omfattar en kombination av neo adjuvant kemoterapi och kirurgi. Denna behandlingsregim visade en ökning av överlevnaden hos patienter med lokaliserad sjukdom från ca 20% före användning av kemoterapi, för närvarande mellan 60-70% 3, 4. Men i de senaste två decennierna har den totala överlevnaden av OS patienter med lokal sjukdom plateaued 4, 5. Dessutom, 30-40% av dessa patienter återfaller inom tre år efter diagnos och patienter med metastaserad sjukdom fortsätter att ha en dålig överlevnad på 20-30% 4, 6, 7. För att förbättra resultatet av dessa patienter, nya terapeutiska strategier behöver utvecklas. Fotodynamisk terapi (PDT), en ganska ny cancerbehandling, använder ljus av en viss våglängd för excitation av en photosensitizer (PS), som ackumuleras i tumörcellerna efter injicering i blodomloppet. Laserljus excitation av PS genererar syreradikaler i närvaro av syre, som inducerar cytotoxiska reaktion i tumörceller och celldöd. Förutom denna primära mekanism, framkallade ytterligare två PDT biologiska processer bidrar till minskad tumörtillväxt: PDT orsakar kärlsammandragning och blodproppsbildning av tumören mikrocirkulation och därmed lokal hypoxi och syrebrist inne i tumören, vilket leder till tumör infarkt. Slutligen skadade PDT och döende tumörceller utlösa ett lokalt immunsvar, en ganska unik egenskap hos PDT. Detta involverar komplementsystemet och aktiveringen av antigenpresenterande dendritiska celler 8. Därmed skapas förutsättningar för att presentera tumörantigener med efterföljande aktivering av lymfoida celler, vilket leder till tumörspecifik immunitet. Hittills har PDT använts för att behandla flera typer av mjukdelstumörer och hyperplAsiens, såsom aktinisk keratos, Barretts esofagus, endobronkiala tumörer, cancer i urinblåsan, basaliom, och palliativ behandling av huvud-halscancer 2. Den behandling är känd för att inducera lokal, storskalig nekros med endast lite biverkningar, och har sålunda potential att selektivt utrota tumörvävnad. Trots dessa fördelar, förblir tillämpningen av PDT tekniskt mer krävande än administrering av kemoterapeutiska läkemedel. För att uppnå maximal effekt, PS-koncentrationen, ljusexponering och total överföring av ljusenergi behöver optimeras. Detta kan göras i in vivo experiment, men, på grund av det relativa stora antalet parametrar som måste optimeras, är det mer effektivt för att initialt bestämma optimala betingelser in vitro. I de experiment som beskrivs nedan, testade vi effekten av PDT in vitro med användning av PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxifenyl) chlellervid, förkortat mTHPC (Figur 1A). mTHPC är den aktiva substansen i läkemedlet Foscan, som idag används i kliniken för palliativ behandling av huvud-halscancer. Det är en av de mest potenta PS, inducera massiv cellskada redan vid låga koncentrationer, och det visade sig vara överlägsen andra PS i termer av vävnadspenetration 9, 10. Dess ljus absorptionsspektrum (Figur 1B) visar två framträdande toppar, en vid 417 nm och en andra vid 652 nm, som används för vävnadslokalisering av ackumulera PS och för PDT induktion, respektive. För närvarande är en liposomal formulering för mTHPC under utveckling. Här beskriver vi de förfaranden för att kvantifiera upptaget av denna liposomal formulering, och att utföra PDT i två humana OS cellinjer, den låga metastaserad HOS och de höga metastaser 143B-celler. En del av de data som presenteras här har rapporterats tidigare 11. The metod som beskrivs här ger oss möjlighet att studera effekten av en metastatisk fenotyp på PDT effekt. 143B-celler, orthotopically injiceras i bakbenen av immun bristfälliga SCID möss orsakar intratibial metastasizing primära tumörer, en modell noga imitera den mänskliga metastaserande sjukdom. Således, de föreslagna in vitro-försök är perfekt lämpade att bedöma de optimala PDT inställningar för att senare användas i in vivo experiment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

Under senare år har det varit svårt att finna mer effektiva terapier mot cancer med mindre systemiska biverkningar. Därför Fotodynamisk terapi är en ny metod för en mer tumör selektiv behandling. Fotodynamisk terapi (PDT) som använder sig av en icke-toxisk fotosensibiliserare (PS), vilken vid aktivering med ljus av en specifik våglängd i närvaro av syre, genererar syreradikaler som framkallar en cytotoxisk respons 1. Trots sitt godkännande nästan tjugo år sedan av FDA, är PDT numera endast används för att behandla ett begränsat antal cancertyper (hud, urinblåsa) och nononcological sjukdomar (psoriasis, aktinisk keratos) 2. Den stora fördelen med användningen av PDT är förmågan att utföra en lokal behandling, vilket förhindrar systemiska biverkningar. Dessutom tillåter den behandling av tumörer vid känsliga platser (t.ex. runt nerver eller blodkärl). Här en intraoperative tillämpning av PDT anses i osteosarkom (OS), en tumör i benet, för att rikta primära tumörsatelliter kvar i tumör omgivande vävnad efter kirurgisk tumörresektion. Behandlingen syftar till att minska antalet återfall och till att minska risken för (postoperativt) metastaser. I den aktuella studien, presenterar vi in vitro PDT förfaranden för att fastställa den optimala PDT inställningarna för effektiv behandling av vanligt förekommande OS cellinjer som används för att återge den mänskliga sjukdomen i väletablerade intratibial modeller OS mus. Upptaget av PS mTHPC undersöktes med en spektrofotometer och fototoxicitet provocerades med laserljus excitation av mTHPC vid 652 nm för att framkalla celldöd bedömas med en WST-1-analys och genom räkning av överlevande celler. De etablerade tekniker gör det möjligt för oss att definiera de optimala PDT inställningarna för framtida studier i djurmodeller. De är ett enkelt och snabbt verktyg för utvärdering av effekten av PDT <em&gt; In vitro innan en ansökan in vivo.

Med de här rapporterade teknikerna undersökte vi mTHPC-baserade PDT i mänskliga OS-celler. Först var den tid och dosberoende upptag av mTHPC undersökts i den låga metastaserad HOS och i de mycket metastaser 143B OS cellinjer. mTHPC upptag kan bedömas genom mätning av fluorescensen av mTHPC med en fluorescensspektrofotometer (Figur 2, som återges med tillstånd från Reidy et al. 11). Figur 2A illustrerar upptagningen av mTHPC på ett tidsberoende sätt. Fluo...

Watch this Scientific Journal Video about Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro at JoVE.com

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Det protokoll som rapporteras här tillåter en utvärdering av effektiviteten av fotodynamisk terapi (PDT) i cellinjer och en optimering av de PDT-inställningar innan applicering av terapi i djurmodeller.

Cytotoxiska Effekten av fotodynamisk terapi i osteosarkomceller<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal Injektion av genterapivektorer och stamceller i musen ögat

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Anrikning av äggstockscancer tumör-initierande celler

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studera bukspottkörtelcancer Stem Cell egenskaper för att utveckla nya behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys av Läkemedels svar i patienter med cystisk fibros

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

framställning och<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av Magnetized miR-modifierade endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metod för att kvantifiera Upper Limb Performance i det dagliga livet som använder accelerometrar

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

En In Vitro -Metod för fotodynamisk terapi

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Beredning av Gushukang (GSK) granulat för in vivo-och in vitro-experiment

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Använda en kemisk biopsi för graft kvalitetsbedömning

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...