Name: drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications at JoVE.com

De auteurs willen graag aan de heer Richard Zink en Todd Wiernicki erkennen voor methodologische training en test begeleiding. We danken ook John Paul Spence voor zorgvuldige lezing en redactionele suggesties. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, en Eli Lilly and Company door de Lilly Research Award Program (LRAP).

1. Uitbreiding en cryopreservatie van Assay Ready Cells <ol><li> Cultuur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) cellen op een 15 cm 2 celkweek schotel in Ham&#39;s F12 medium aangevuld met 1,0 uM L-glutamine, 800 ug / ul G418, 300 ug / ul hygromycine, 100 U / gl penicilline, 100 ug / ul streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS). </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 totdat de cellen 90-95% confluent. Was de cellen met 10 ul fosfaat gebufferd...

<ol>
	<li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance.">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha(i/o)-coupled+receptors.">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li><li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids:+tolerance,+withdrawal+and+addiction.">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li><li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens/striatal+neurons.">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li><li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m-Opioid+receptor+desensitization+by+&#946;-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence.">m-Opioid receptor desensitization by &#946;-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction.">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li><li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific.">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li><li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms:+insights+from+knockout+and+overexpression+studies.">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+type+5+(AC5)+is+an+essential+mediator+of+morphine+action.">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li><li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets:+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection.">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6:+A+progress+report.">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li><li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).</li><li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting.">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li><li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li><li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors.">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li><li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes.">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6.">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li><li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1.">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li><li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas:+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V.">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li><li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D(2)+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly.">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).</li><li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+(CAD)-D2L+cells.">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain.">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).</li><li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid.">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot:+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format.">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li><li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery.">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li><li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells.">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li><li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+dopamine+D2+receptor/beta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics.">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li><li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening:+a+paradigm+for+therapeutic+development.">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses.">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li><li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"genome-to-lead"+approach+for+insecticide+discovery:+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D(1)-like+dopamine+receptors.">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase.">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li><li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate/G13+pathway.">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li></ol>

In een poging om studies van heterologe sensibilisatie te vergemakkelijken, hebben we behoorlijk gemodificeerd onze vorige methode het bereiken van een gestroomlijnd &quot;mix en lees&quot; formaat dat amendeerbaar naar high-throughput screening en werkingsmechanisme onderzoek. De belangrijkste wijzigingen in ons protocol kan als volgt worden samengevat: 1) het gebruik van cryogeconserveerde cellen als &quot;test klaar&quot; reagentia, 2) de miniaturisatie van de assay in 384 putjes, en 3) het gebruik van de meting van ...

Een adaptief adenylylcyclase (AC) signalering reactie bekend als heterologe-of super-overgevoeligheid werd voor het eerst ontdekt in het laboratorium van Nobelprijswinnaar dr. Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg voorgesteld dat de waargenomen toename AC respons na chronische δ opioïde receptor activering was een mechanisme betrokken bij opiaten tolerantie en afhankelijkheid 1. Naast chronische δ opioïde receptor activatie dit neuroadaptive reactie van AC signaal komt voor na aanhoudende activatie van verscheidene andere Gai / o-gekoppelde receptoren 2. Met name veel van deze receptoren worden geassocieerd met pijn, neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen, en omvatten μ / κ opioïde, D 2/4 dopamine, 5HT 1A en M 2/4 muscarinereceptoren 2. Naast Dr Nirenberg bevindingen, een grote hoeveelheid bewijs bestaat koppelen sensibilisering van AC signalering naar chronische opioïde receptor activering zowel <em&gt; in vitro en in vivo 3-7. Sensibilisatie van AC is ook geassocieerd met een verscheidenheid van ziekten waarbij D 2-achtige dopamine receptoren waaronder schizofrenie en de ziekte van Parkinson (voor overzicht zie referentie 2). Ondanks het potentiële belang van sensibilisatie, de precieze mechanisme (s) van persistente Gai / o-gekoppelde receptoractivering die leidt tot verhoogde AC respons grotendeels onbekend. Deze studies vormen de reden voor het onderzoek van de mechanismen voor de sensibilisering van adenylylcyclase als een belangrijke neurobiologische doelwit. Ook moet de fysiologische relevantie van AC signalering 8 en het belang dat de individuele AC isovormen houden in deze adaptieve respons ook worden erkend 2,9,10. In het kader van het onderzoek, de algemene kenmerken geassocieerd met heterologe sensibilisering van de recombinante isovormen van AC parallel die kenmerken described voor het bestuderen van endogene isovormen van AC. Specifiek, heeft eerder onderzoek gevonden dat de activering van Gai / o eiwitten en daaropvolgende afgifte / omlegging βγ subeenheden belangrijkste voorwaarden voor receptor geïnduceerde sensibilisatie van AC-isovormen. Bovendien zijn een aantal studies suggereren dat het signaleren van proteïne kinasen en Gβγ subeenheden zijn betrokken bij overgevoeligheid 2,11-13. Individuele AC ook weer unieke en aparte sensibilisatie patronen 12. Zo is aanhoudende blootstelling D 2 receptoren agonisten geassocieerd met overgevoeligheid van AC1 en AC8 Ca 2 + / calmoduline stimulatie 14,15, terwijl de nauw verwante AC3 niet gesensibiliseerd 2. AC2, AC4, en AC7 zijn nauw verwant, echter alleen PKC-gestimuleerde AC2 groei robuust lichtgevoelig na langdurige blootstelling van D2 receptoren agonisten 7,14,16,17. Daarnaast AC5 en AC6 tonen een aanzienlijke mate van heterologous sensibilisatie voor Gas-en-forskoline gestimuleerde cAMP accumulatie na activatie van D 2 receptoren 14,18-20, maar lijken te verschillen in hun behoefte aan Gβγ subunit-AC interacties 21. Hoewel de meeste studies van AC sensibilisatie model cellijnen (bijv. HEK293 cellen die individuele AC-isovormen) gebruikt, blijkt dat deze bevindingen vertalen naar natieve neuronale celmodellen 4,22. Meer recent, kunnen de effecten van AC isovorm selectieve remmers van kleine moleculen die in HEK293 cellen die AC-isovormen worden vertaald in vivo gedragsonderzoek 23. Het ontbreken van een geïdentificeerde moleculaire mechanisme voor heterologe sensibilisatie waarschijnlijk weerspiegelt de complexiteit van de adaptieve respons en de unieke regulerende eigenschappen van de individuele AC-isovormen 12. Het ontrafelen van een dergelijke complexiteit wordt verder gecompliceerd door het gebruik van de methode omslachtig thoed heeft beperkte academische onderzoekers van dienst onpartijdige benaderingen. Bijvoorbeeld, onze vorige mechanistische studies betrof het gebruik van continu gekweekte cellulaire modellen met 24 - en 48-well weefselkweek formaat 15. Gekweekte cellen werden meestal gekweekt gedurende 48 uur en vervolgens onderworpen aan agonist behandeling (2-18 uur), gevolgd door een reeks van cel wassingen en incubaties (figuur 1). AC-isovorm specifieke cAMP protocols werden vervolgens toegepast gevolgd door meting van cAMP via een omslachtige en tijdrovende [3H] cAMP bindende methodologie 15,24. De duur van begin tot eind voor elke assay algemeen vereist een totaal van vier tot vijf dagen van cel plateren gegevensanalyse (figuur 1). De toepassing van nieuwe technologieën en automatisering heeft geleid tot duidelijke verbeteringen voor sensibilisatie studies in de industriële en HTS centrum setting. Bijvoorbeeld, een groep die werkt met het National Center for Chemical Genomics meldde een tweedaagse HTS testprocedure voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren van μ opioïd receptor geïnduceerde sensibilisatie in 1536-well formaat 25. Het huidige artikel beschrijft onze inspanningen om een ​​HTS-test voor studies van heterologe sensibilisatie met behulp van technologieën die beschikbaar zijn op de meeste academische onderzoeksinstellingen ontwikkelen. Deze strategie werd bereikt door de integratie van het gebruik van cryogeconserveerde cellen uit cel modellen heteroloog tot de uiting van de D2 dopamine receptor in combinatie met endogene of individuele recombinante adenylylcyclase isovormen (CHO-D 2L of HEK-AC6 / D 2 L). Om onze doorvoer te verbeteren, hebben we onze vernieuwde 48 en sensibilisatie assay (ca.&gt; 20 treden meer dan 4-5 dagen) een vijf-stap, dag assay in 384-well formaat, dat was in wezen &quot;mixen en te lezen&quot;. De nieuwe indeling maakt gebruik van een commercieel verkrijgbare homogene tijdopgeloste fluorescentie (HTRF) test om cAMP acc metenumulation in intacte cellen met een multi mode plaat lezer. De test is robuust en vatbaar voor kleine molecuul screening, en kunnen effectief worden toegepast voor het screenen op remmers van heterologe sensibilisatie. Daarnaast bieden wij de gegevens die het gebruik van deze test met reverse transfectie van siRNA voor gerichte of genome wide siRNA bibliotheek screening met slechts een geringe wijziging in de algemene aanpak maakt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

Sensibilisatie van adenylylcyclase (AC) signalering is betrokken bij diverse neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen waaronder verslaving en ziekte van Parkinson. Acute activering van Gai / O-gekoppelde receptoren remt AC activiteit, terwijl aanhoudende activering van deze receptoren leidt tot heterologe sensibilisatie van AC en verhoogde niveaus van intracellulair cAMP. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze verbetering van AC respons na chronische activatie van verschillende soorten Gai / o-gekoppelde receptoren zoals dopamine D2 en μ opioïde receptoren waargenomen zowel in vitro als in vivo. Hoewel heterologe sensibilisatie van AC eerst werd gemeld vier decennia geleden, het mechanisme (s) dat dit verschijnsel ten grondslag liggen blijven grotendeels onbekend. Het ontbreken van mechanistische gegevens vermoedelijk weerspiegelt de complexiteit die betrokken zijn bij deze adaptieve respons, wat suggereert dat nonbiased aanpak zou kunnen helpen bij het identificerening de moleculaire pathways die betrokken zijn bij heterologe sensibilisering van AC. Eerdere studies hebben kinase en Gbγ signalering geïmpliceerd als overlappende componenten die het heterologe sensibilisatie van AC regelen. Om unieke en extra overlappende doelstellingen in verband met sensibilisatie van AC identificeren, is de ontwikkeling en validatie van een schaalbare cAMP sensibilisatie kwantitatieve analyse vereist voor een grotere verwerkingscapaciteit. Vorige benaderingen van sensibilisatie studeren zijn over het algemeen omslachtig waarbij continue celkweek onderhoud, alsmede een complexe methode voor het meten van cAMP dat meerdere wasstappen inhoudt. Aldus zou de ontwikkeling van een krachtige cel-gebaseerde test die kan worden gebruikt voor high throughput screening (HTS) in 384 putjes toekomstige studies te vergemakkelijken. Met twee D2 dopamine receptor cellulaire modellen (dwz. CHO-D 2L en HEK-AC6 / D 2L), hebben we 48-well assay gevoeligheid (&gt; 20 stappen 4-5 dagen) omgezet in een vijf-step, enkele dag assay in 384-well formaat. Dit nieuwe format vatbaar is klein molecuul screening, en we tonen aan dat deze assay ontwerp ook gemakkelijk kan worden gebruikt voor omgekeerde transfectie van siRNA in afwachting gerichte siRNA bibliotheekscreening.

Deel I. Het ontwikkelen van een 384 goed heterologe overgevoeligheid test voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren met een algemeen verkrijgbare cel model. Om heterologe sensibilisatie studeren in een cel model, hebben we een aantal verbeteringen die ons in staat om de test te stroomlijnen in een &quot;mix en lees&quot; formaat. Enkele belangrijke aanpassingen zijn hieronder aangegeven en worden in meer detail in de discussie. De eerste belangrijke stap wijzigd...

Watch this Scientific Journal Video about Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications at JoVE.com

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Aanhoudende activering van remmende G-eiwit gekoppelde receptoren leidt tot een sensibilisering van adenylylcyclase signalering. Om de essentiële moleculaire pathways identificeren nonbiased stappen noodzakelijk zijn, maar deze strategie vereist de ontwikkeling van een schaalbare celgebaseerde cAMP overgevoeligheid assay. Hierin beschrijven we een overgevoeligheid test voor kleine moleculen en siRNA screening.

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Wideband Optische Detector van Echografie voor Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Fabricage van mechanisch afstembare en bioactieve Metal Steigers voor biomedische toepassingen

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Bereiding van silicium Nanowire veldeffecttransistor voor chemische en biosensoren toepassingen

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Extractie van Plant-gebaseerde Capsules voor Micro-inkapseling Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Toepassingen voor open source Microplate-compatibele verlichtings panelen

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...