Name: the chrop approach combines chip and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin at JoVE.com

מחקר זה פורסם במקור בפרוטאומיקה הנייד מול. סולדי מ &#39;וBonaldi ט proteomic חקירת תחומים פונקציונליים הכרומטין חושף Synergisms הרומן בין ברור heterochromatin הרכיבים MCP. 2013; 12: 64-80. © האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. אנו מודים לרוברטה Noberini (האיטלקי מכון טכנולוגי ולIEO, איטליה) לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודת TB נתמכת על ידי מענקים מArmenise-הרווארד תכנית ג&#39;ובאני קרן לפיתוח קריירה, האיטלקית האגודה לחקר הסרטן ומשרד בריאות האיטלקית. עבודת MS נתמכה על ידי מענק FIRC.

1. תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום סטנדרטי לשבב ילידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי הלה במדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% שור סרום עוברי (FBS), 1% גלוטמין, 1% פן / סטרפטוקוקוס ו10 HEPES מ&quot;מ pH 7.5. </li></ol></l...

<ol>
	<li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure:+a+repeating+unit+of+histones+and+DNA.">Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications.">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21, 381-395 (2011).</li><li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications:+lessons+from+professional+pocket+pickers.">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li><li>Spotswood, H. T., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increasingly+complex+code.">An increasingly complex code.</a> J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).</li><li>Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+for+the+analysis+of+chromatin+structure+and+dynamics.">Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics.</a> Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).</li><li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics:+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry.">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).</li><li>Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+histone+code+with+quantitative+mass+spectrometry.">Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry.</a> Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).</li><li>Taverna, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+combinatorial+linkage+between+methylation+and+acetylation+on+histone+H3+N+termini.">Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).</li><li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry.">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).</li><li>Villar-Garea, A., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+histone+modifications.">The analysis of histone modifications.</a> Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).</li><li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones.">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).</li><li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics.">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142, 810-821 (2010).</li><li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+anchoring+of+TFIID+to+nucleosomes+by+trimethylation+of+histone+H3+lysine+4.">Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4.</a> Cell. 131, 58-69 (2007).</li><li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+interaction+proteomics+and+genome-wide+profiling+of+epigenetic+histone+marks+and+their+readers.">Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.</a> Cell. 142, 967-980 (2010).</li><li>Bartke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome-interacting+proteins+regulated+by+DNA+and+histone+methylation.">Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation.</a> Cell. 143, 470-484 (2010).</li><li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci.">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li><li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks.">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteomic+investigation+of+chromatin+functional+domains+reveals+novel+synergisms+among+distinct+heterochromatin+components.">The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components.</a> Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68, 850-858 (1996).</li><li>Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+histone+modifications.">The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications.</a> Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).</li><li>Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC-based+proteomic+analysis+to+dissect+the+&amp;#34;histone+modification+signature&amp;#34;+of+human+breast+cancer+cells.">SILAC-based proteomic analysis to dissect the &amp;#34;histone modification signature&amp;#34; of human breast cancer cells.</a> Amino Acids. 41, 387-399 (2011).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal Chem. 75, 663-670 (2003).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).</li><li>Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mass+spectrometry+of+histones+H3.2+and+H3.3+in+Suz12-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+distinct,+dynamic+post-translational+modifications+at+Lys-27+and+Lys-36.">Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).</li><li>Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+histone+H3+lysine+9+creates+a+binding+site+for+HP1+proteins.">Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins.</a> Nature. 410, 116-120 (2001).</li><li>Bannister, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+recognition+of+methylated+lysine+9+on+histone+H3+by+the+HP1+chromo+domain.">Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain.</a> Nature. 410, 120-124 (2001).</li><li>Ram, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+patterning+of+chromatin+regulators+uncovered+by+genome-wide+location+analysis+in+human+cells.">Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells.</a> Cell. 147, 1628-1639 (2011).</li><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Beck, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+in+epigenetic+research.">Mass spectrometry in epigenetic research.</a> Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).</li><li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+chromatin+states+for+systematic+annotation+of+the+human+genome.">Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome.</a> Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).</li><li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry.">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).</li><li>Young, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+characterization+of+combinatorial+histone+codes.">High throughput characterization of combinatorial histone codes.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).</li><li>Boyne, M. T., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+characterization+of+human+histones+in+the+H2A+gene+family+by+top+down+mass+spectrometry.">Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).</li></ol>

יש לנו לאחרונה תיארתי ChroP, אסטרטגיה כמותית לאפיון בקנה מידה גדולה של רכיבי החלבון של הכרומטין. ChroP משלב שתי גישות משלימות בשימוש בתחום אפיגנטיים, שבב וטרשת נפוצה, מרוויח מנקודתי החוזק שלהם ולהתגבר על המגבלות שלהם. שבב מצמידים את רצף עמוק (שבב Seq) מאפשר מיפוי הגנום של שי?...

הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein דינמי מאוד כי הוא מעורב כתבנית ראשונית לכל התהליכים בתיווך ה-DNA. הנוקלאוזום הוא היחידה הבסיסית החוזרת ונשנית של הכרומטין והוא מורכב מליבת octameric חלבוניים המכילה שתי מולקולות של כל H2A הקנונית היסטון, H2B, H3 ו-H4, שסביבו 147 נ&quot;ב של ה-DNA עטופים 1,2. כל ההיסטונים הליבה בנויים כתחום כדורי ו&quot; זנב &quot;N-מסוף גמיש שבולט מחוץ להנוקלאוזום. אחד המנגנונים העיקריים להסדרת מבנה הכרומטין ודינמיקה מבוסס על שינויים קוולנטיים לאחר translational (PTMs), שבעיקר להתרחש על N-Termini של ההיסטונים 3,4. שינויי היסטון יכולים לתפקד גם על ידי שינוי מבנה הכרומטין סדר גבוה יותר, על ידי שינוי קשרים בין ההיסטונים-DNA או בין nucleosomes, ובכך שליטה על הנגישות של חלבוני ה-DNA מחייבת (מנגנוני cis), או על ידי מתנהג כמו dockinאתרים גרם לחלבונים רגולטוריים, או כיחידות בודדות, או משובץ במתחמי Multimeric. חלבוני ויסות כזה יכול להפעיל את תפקידם בדרכים שונות: על ידי ויסות ישירות ביטוי גנים (כלומר חלבוני TAF), או על ידי שינוי מיקום הנוקלאוזום (כלומר הכרומטין שיפוץ מכלולים) או על ידי שינוי שאריות אחרות היסטון (כלומר חלבונים עם מתיל-transferase או אצטיל פעילות transferase) (מנגנוני טרנס) 5. התצפית כי אשכול דפוסים ברור PTM בלוקוסי הכרומטין ספציפיים הוביל לפירוט של את ההשערה כי שינויים שונים באתרים שונים עשויים synergize ליצור קוד מולקולרי המתווך את המצב התפקודי של ה-DNA הבסיסי. &quot;ההשערה של קוד היסטון&quot; צברה קונסנסוס גדול בשנים, אבל אימות ניסיוני שלה כבר התאפקה על ידי מגבלות טכניות 6,7. פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה (MS) התפתחהכלי רב עוצמה למפה דפוסי שינוי היסטון ולאפיין מחייב חלבוני הכרומטין 8. MS מזהה שינוי כΔmass ספציפי בין המסה הניסיונית ותיאורטית של פפטיד. ברמה של ההיסטונים בודדים, MS מספק שיטה משוחדת ומקיפה למפה PTMs, המאפשר זיהוי של שינויים חדשים וinterplays החושפני ביניהם 9-14. בשנים האחרונות, מספר האסטרטגיות פותחו כדי לנתח את הרכב proteomic של הכרומטין, כולל האפיון של כרומוזומים שלמים המיטוטי 15, זיהוי של חלבוני קושרי hPTM המסיסים 16-18 והבידוד והניתוח של אזורי הכרומטין הספציפיים (כלומר הטלומרים) 19,20. עם זאת, החקירה של סינרגיות המוקד ספציפי בין PTMs היסטון, גרסאות, והחלבונים הקשורים הכרומטין היא עדיין לא הושלמה. כאן, אנו מתארים גישה חדשה, בשם ChroP (roteomics chro P matin) 21, שפיתחנו כדי לאפיין ביעילות תחומים הכרומטין תפקודי מובהקים. גישה זו מתאים את עצמו immunoprecipitation הכרומטין (שבב), פרוטוקול מבוסס היטב בשימוש במחקר אפיגנטיים, לניתוח proteomic מבוסס MS יעיל של המדגם המועשר. פיתחנו שני פרוטוקולים שונים, בהתאם לסוג של הכרומטין משמש כקלט והשאלה מופנה על ידי MS; בפרט: 1) שבב של הכרומטין ילידים מבולבל מתעכל עם MNase מועסק לטהר מונו nucleosomes ולנתח את hPTMs שיתוף שיוך (N-ChroP); 2) שבב של הכרומטין crosslinked מקוטע על ידי sonication משמש בשילוב עם אסטרטגית interactomics מבוסס SILAC לאפיין כל הכרומטין שיתוף ההעשרה מחייב חלבונים (X-ChroP). אנו מדגימים כאן שילוב של N-ו-X-ChroP להעשרת ולימוד heterochromatin, באמצעות H3K9me3 כפיתיון לצעדי immunoprecipitation. השימוש בChroP יכול להתארךללמוד או אזורים שונים על הכרומטין, או שינויים בהרכב הכרומטין בתוך האזור אותו במהלך המעבר למצב תפקודי שונה, ובכך סלל את הדרך ליישומים שונים באפיגנטיקה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="702">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-614F</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">FBS</td>
			<td style="width:145px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">SILAC DMEM</td>
			<td style="width:145px;">M-Medical</td>
			<td style="width:119px;">FA30E15086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Dialyzed FBS</td>
			<td style="width:145px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A6969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>68041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>608033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10 107 921 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:271px;">Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:145px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04 693 132 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:271px;">Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length</td>
			<td style="width:145px;">Spectrumlabs</td>
			<td style="width:119px;">132720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">QIAquick PCR purification kit</td>
			<td style="width:145px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Histone H3 peptide tri-methyl K9&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab1773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">100.04D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">NuPAGE Novex 4-12%&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Bis-Tris Gel&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>LC6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LDS Sample Buffer</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Formaldheyde</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Aceti anhydride-d6</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">175641-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">94318-50ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Iodoacetamide &#8805;99% (HPLC), crystalline</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 &#215; 20&#956;g)</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Nanospray OD 360&#956;m x ID 75&#956;m, tips ID 8&#956;m uncoated Pk 5</td>
			<td style="width:145px;">Microcolumn Srl</td>
			<td style="width:119px;">FS360-75-8-N-5-C15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">&#160; ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &#181;m&#160;&#160; 15 % C</td>
			<td style="width:145px;">Dr. Maisch GmbH</td>
			<td style="width:119px;">r13.aq.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">C18 extraction disk, 47 mm</td>
			<td style="width:145px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">1&#8203;2&#8203;1&#8203;4&#8203;5&#8203;0&#8203;0&#8203;4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Carbon extraction disk, 47 mm</td>
			<td style="width:145px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12145040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:271px;">Cation extraction disk</td>
			<td style="width:145px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">66889-U</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the chrop approach combines chip and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin

הכרומטין הוא מורכב nucleoprotein מאוד דינמי עשויים דנ&quot;א וחלבונים השולט בתהליכי ה-DNA תלוי שונים. מבנה הכרומטין ותפקוד באזורים מסוימים מוסדר על ידי ההעשרה המקומית של שינויי היסטון לאחר translational (hPTMs) וגרסאות, מחייב חלבוני הכרומטין, ובכלל זה גורמי שעתוק, ומתילציה בדנ&quot;א. אפיון proteomic של הרכב הכרומטין באזורים פונקציונליים שונים כבר הקשו עד כה על ידי חוסר פרוטוקולים יעילים להעשיר תחומים כגון בטוהר והכמות המתאימים לניתוח מעמיק לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). אנו מתארים כאן אסטרטגיה חדשה תוכננה פרוטאומיקה הכרומטין, בשם ChroP (roteomics P matin chro), לפיה immunoprecipitation הכרומטין preparative משמש כדי לבודד אזורי הכרומטין ברורים שתווים, במונחים של hPTMs, וריאנטים הקשורים שותף חלבונים שאינו histonic, הם נותח על ידי טרשת נפוצה. אנו ממחישים הואמחדש הקמת ChroP להעשרה והניתוח של אזורי heterochromatic תעתיק שקטים, שסומנה על ידי נוכחותו של Tri-מתילציה של ליזין 9 בהיסטון H3. התוצאות שהושגו להדגים את הפוטנציאל של ChroP באפיון יסודיות proteome heterochromatin ולהוכיח את זה כאסטרטגיה אנליטיים רבת עוצמה להבנת אופן שבו גורמי החלבון הייחודיים של הכרומטין אינטראקציה וsynergize להקים תצורות מבניות ותפקודיות מוקד ספציפי.

immunoprecipitation הכרומטין היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת לפרופיל הלוקליזציה של חלבון או שינוי היסטון לאורך הגנום. במקבילת פרוטאומיקה, שבב ואחריו פרוטאומיקה מבוססת MS לזהות איכותי וכמותית hPTMs, גרסאות היסטון ומחייב חלבוני הכרומטין שimmunoprecipitated יחד עם השינוי או חלבון של עניין, המ?...

Watch this Scientific Journal Video about The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin at JoVE.com

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...